Gene therapy

Question 1

Hvilke fordele er der ved at vælge virale vektorer til gen terapi fremfor ikke-virale vektorer?

Answer 1

De er mere effektive til at leverer det genetiske materiale til celler.
De har evnen til at vedvare ekspressionen i længere tid specielt for de virale vektorer der integrerer det genetiske materiale i cellens genom.

Question 2

Hvilke fordele er der ved at vælge ikke-virale vektorer til gen terapi fremfor virale vektorer?

Answer 2

De er ikke immunogene/patogene

De har en højere oplagerings kapacitet.

Question 3

Hvad er replication-defekte vektorer?

Answer 3

Er en vektorer der mangler en eller flere proteiner af det virale genom som tillader viral replikation. Disse er udskiftet af de terapeutiske gener.

Question 4

Hvad er replikation-kompetente viral vektorer?

Answer 4

En vektor der indeholder alle nødvendige gener for viral syntese og som bliver ved med at udbrede sig der først infektionen er sket.

Question 5

Hvad er ulempen ved replikation-kompetente viral vektorer sammenlignet med replication-defekte vektorer?

Answer 5

Længden på de terapeutiske gener er begrænset.

Question 6

Nævn de forskellige måder vektorer kan leveres på til hjernen

Answer 6

Injektion
Infusion i cerebrospinal væsken
Vasculatur

Question 7

Hvad består retroviral vektorer af genom mæssigt og hvordan fungerer de?

Answer 7

Består af ssRNA

De leverer RNA som bliver reverse transkriperet til dsDNA

Question 8

Hvilke fordele er der ved retroviral vektorer?

Answer 8

Lav immunogenitet
Kan loades med 7-9 kb
Kan integrerer DNA ind i cellen og skaber derved en stabil langtids genekspression.
Brugbar ved cancer celler, da de kun kan integrere deres DNA ved mitotiske celler

Question 9

Hvordan afleverer retroviral vektorer deres materiale?

Answer 9

Ved at fusionerer med plasmamembranen og levere indholdet direkte til cytoplasmaet.

Question 10

Hvilke ulemper er der ved retrovirale vektorer?

Answer 10

Risiko for at inducerer mutagenese
Kan kun leverer sit materiale i mitotiske celler.
De produceres ved lave titer og kræver derfor proviral integration ind i værtscellen for ekspression.

Question 11

Hvad er mutagenese?

Answer 11

Når et proto-onkogen aktiveres ved at der integreres DNA tæt på en promotor sekvens, som skaber tumor formation.

Question 12

Hvad er simpel onkoretrobiral vektorer?

Answer 12

Er en simpel retrovirus med onkogen potentiale.

Question 13

Hvilke fordele er der ved simpel onkoretrovirale vektorer?

Answer 13

Høj titer
Langtidsstabil ekspression
Stor kapacitet.

Question 14

Hvilke ulemper er der med simpel onkoretroviral vektorer?

Answer 14

Risiko for mutagenese (især leukæmi)
Risiko for udvikling af replikation-competent retrovirus hvis den kombineres med human retrovirus.
Inficerer kun delene celler.

Question 15

Hvornår er det en fordel at bruge virale vektorer der kun inficerer delene celler?

Answer 15

Hvis ens target er cancer.

Question 16

Hvad er Lentivirale vektorer?

Answer 16

Virus baseret på HIV, som kan vi få påsat det fremmede virus protein (pseudotype) vesicular stomatitis virus G envelope, for at ramme flerer typer væv.

Question 17

Hvilke fordele er der ved at bruge lentivirale vektorer?

Answer 17

De er ikke afhængige af at cellen deler sig for at inficerer den.
Er fordelagtig at bruge ved integrering i introns i transkriptionelle aktive gener = mere sikker.
Reduceret onkolytisk potentiale
Høj titer
Høj kapacitet
Langtidsstabil ekspression.

Question 18

Hvilke ulemper er der ved bruge lenitvirale vektorer?

Answer 18

Risiko for mutagenese
Risiko for udvikling af replikation-competent retrovirus hvis den kombineres med human retrovirus.
Tilstedeværelse af tat og rev proteiner som kan give et immunrespons.

Question 19

Hvad består Herpes simplex viral vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?

Answer 19

Er dsDNA og er en naturlig neurotrofisk virus.

Den leverer sit materiale via episomal ekspression og integrerer ikke.

Question 20

Hvilke fordele er der ved at bruge Herpes simplex viral vektorer til genterapi?

Answer 20

Høj titer 
Langtids episomal ekspression 
God kandidat for neurologisk genterapi. 
Høj kapacitet (50 kb) 
Har en cytopatisk effekt på cancer celler.

Question 21

Hvilke ulemper er der ved at bruge Herpes simplex viral vektorer til genterapi?

Answer 21

Inflammatorisk og toksisk reaktion i patienter.

Komlpex genom med flere virale gener.

Question 22

Hvordan er herpes simplex virus opbygget?

Answer 22

Består af lineær DNA der omringet af et capsidlag.
Capsidlaget er omringet af et lipid bilag, som er envelopen, der forbindes til capsidlaget via tegumeret. Envelopen er dækkes af forskellige former for glykoproteiner.

Question 23

Hvad består adenovirale vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?

Answer 23

Det er dsDNA der ikke er beskyttet af en envelope.

Transporteres ind i cellen ved endocytose og afgiver sit materiale

Question 24

Hvilke fordele er der ved at bruge adenovirale vektorer i gen terapi?

Answer 24

Kan både tranducerer delende og ikke-delende celler.
Det er episomal ekspression, som kan holde op til et år = integreres ikke.
Høj loading kapacitet (36 kb)
Høj titer.

Question 25

Hvilke ulemper er der ved at bruge adenovirale vektorer i gen terapi?

Answer 25

Kortvarig genekspression. Det skal re-administreres, som kan udlede et immunrespons. Selve kapsidet kan udløse et immunrespons. Mange af dens komponenter kan binde til blodets komponenter, som inaktiverer vira. Mange personer har allerede neutraliserende antistoffer mod adenovira, da den er så almindelig.

Question 26

Hvad vil det sige at en vector kan levere gen materiale ved episomal ekspression?

Answer 26

Det vil sige at det leveres som et plasmid, der kan replikeres ekstrakromosomalt, og derfor uden at påvirke det cellulære genom

Question 27

Hvad består adeno-associerede virale vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?

Answer 27

Det er ssDNA uden en envelope. Den optages ved endocytose, hvorved den kan undslippe endosomet og derved levere sit virale DNA til nucleus. Den skal co-inficeres med at hjælper plasmid, som indeholder gener for replikation fra adenovira.

Question 28

Hvilke fordele er der ved at bruge adeno-associerede virale vektorer i gen terapi?

Answer 28

Høj titer Ingen patogene eller cytotoksiske effekter Kan inficere delende og ikke-delende celler Episomal ekspression i mere end 10 år.

Question 29

Hvilke ulemper er der ved at bruge adeno-associerede virale vektorer i gen terapi?

Answer 29

Kapaciteten er ikke så stor. | Personer har ofte neutraliserende antistoffer.

Question 30

AAV vektorer er blevet meget populære som genterapi. Deres capsid kan modificeres således at de er specifikke for specielle væv. Hvilke typer vævs-specifikke promoter er det mest almindelig?

Answer 30

CMV | SV40

Question 31

Beskrive hvad origian of replication betyder, når der er tale om et plasmid

Answer 31

Er direkte opstart af plasmid replikation ved rekruittering af det bakterielle makskineri Den er kritisk for at plasmidet har evnen til at blive amplificerede af bakterier, som er en vigtig karakteristik af hvorfor plasmid er anvendelig at bruge.

Question 32

Beskriv hvad antibiotisk resistens gen betyder og hvordan bruges i plasmidet

Answer 32

Er et gen som indsættes i plasmidet, således at kun bakterier med dette gen vil overleve en antibiotisk behandling.

Question 33

Hvad er multipel kloningssted i et plasmid?

Answer 33

Et kort segment af DNA, som indholder flere restriktions enzym sider, der tillader nem indsætning af DNA. Den er ofte til stede downstream fra en promotor Restriktionssiden i MCS er unik og er ikke til stede andre steder i plasmidet, hvilket er derfor at de kan bruges til kloning.

Question 34

Hvad omtales det gen, promotor eller DNA fragment som indsættes i plasmidets MCS, og som ofte er det man ønsker at undersøge?

Answer 34

Insert (the insert)

Question 35

Hvad gør en promotor region?

Answer 35

Driver transkriptionen af insertet/genet ved at rekruitterer det transkriptionelle maskineri.

Question 36

Hvad er en enhancer?

Answer 36

Er en kort DNA fragment, der kan blive bundet af proteiner, der øger transkriptionen af et specifikt gen.

Question 37

Hvad er en selekteret markør?

Answer 37

Den bruges til at selekterer de celler, som har optaget plasmidet. Markøren er ofte i form af antibiotisk resistenst gen men under kontrol a ikke-bakterielle promotor. Markøren kan også være et fluorescence protein.

Question 38

Non-virale vektorer kan opdeles i kemiske og mekaniske. Nævn nogle kemiske non-virale vektorer

Answer 38

``` Lipoplex Polyplex Magnestisk assisterede transfection Nøgent DNA Articial kromosom ```

Question 39

Nævn nogle mekaniske non-viral vektorer

Answer 39

``` Mikro injektion Elektroporation Nåle Gen pistol Impalefektion Hydrostatisk tryk Vedvarende infusion Sonikation ```

Question 40

Beskriv lipoplex strukturen og hvordan de transporteres ind i nucleus

Answer 40

Lipider har positiv ladet hoveder som kan binde til DNA (negative phosphat), som derved pakker dem ind i hydrofobiske haler, som kan fusionerer med cellemembranen og beskytter dem mod nucleaser

Question 41

Hvad er fordelene ved at bruge lipoplex som genterapi?

Answer 41

Består ikke af peptider, så det inducerer ikke et immunrespons Kan indeholder store DNA sekvenser. Er ikke toksiske Ingen risiko for mutagenese

Question 42

Hvilke ulemper er der ved at bruge lipoplex som genterapi?

Answer 42

De har lav transfektions efficiency, da mange af dem bliver nedbrudt i cytoplasmaet. 100-1000 gange mere DNA er nødvendig for at få samme transfektions efficiency som vira Behandling skal gentages da det ikke integreres ind i genomet.

Question 43

Hvad er polyplexes?

Answer 43

Er DNA som er pakket ind ipolymeres: polyethylenimin, som er positiv lades og derfor meget kationisk, hvilket gør at den kan optages cellulært.

Question 44

Hvilke fordele er der ved at bruge polyplexes som genterapi?

Answer 44

De kan undslippe endosomet og videregive materialet til cellen. Har høj transfektions effektivitet. Er mindre toksisk ved lave molekyle vægt.

Question 45

Hvilke ulemper er der ved at bruge polyplexes som genterapi?

Answer 45

Kan være cytotoksiske

Question 46

Hvordan fungerer magnetisk assisterede transfektion?

Answer 46

DNA er pakket med magentiske nanopartikler, som vha. megentisk kræft leverer DNAet til målcellen, hvor den kan frigive sin cargo.

Question 47

Hvordan fungerer genterapi med nøgent DNA?

Answer 47

Man har et plasmis med et humant insert som indsættes direkte ind i celler uden et leveringssystem.

Question 48

Hvilke ulemper er der ved at bruge nøgent DNA i genterapi?

Answer 48

Det meste bliver afstødt af cellemembranen eller nedbrydes i cytoplasmaet, så det er meget lidt der kommer ind i nuleus.

Question 49

Hvordan fungerer articial kromosomer som genterpi?

Answer 49

Er syntetisk konstruerede kromosomer som indeholder funktionelle centromere og telomere, der kan integreres og replikeres i humane nuleus.

Question 50

Hvilke type vektor er stor nok til at kunne transportere gener så store som Duchene muscular dystrophy gen?

Answer 50

Artificial kromosomer (2.4 mb)

Question 51

Hvordan fungerer mikro injektion som gen terapi?

Answer 51

Er en teknik til at levere DNA ind i en levende celle, som f.eks. en oocyt eller embryo med en glas mikropipette.

Question 52

Forklar kort hvad elektroporation går ud på i gen terapi

Answer 52

Et elektrisk felt tilføres en celle, som vil få den til at danne porer og tillader derved indgang ind i cellen.

Question 53

Hvordan fungerer en egenpistol som genterapi?

Answer 53

Metal såsom guld eller tungsten er coated med DNA (plasmid). Som skydes ind i organismen (bruges ofte til planter) som derved kopieres med resten af organismens gener.

Question 54

Hvrodan fungerer impalefektion som genterapi?

Answer 54

Nanomateriale, såsom nanofibre, carbon, nanotubes, coated med plasmid DNA. Disse indsættes i målorganet ved brug af en chip. Celler tæt på vil alle få leveret plasmidet på samme tid og udtrykke genet.

Question 55

Forklar hvordan man kan bruge ultralyd som en genterapi

Answer 55

Ved at tilfører ultralyd til et specifikt sted vil cellerne blive permeabel og optage det omkringliggende DNA. DNA er ofte givet vaskulært som mikrobobler.

Question 56

Forklar ordet transfektion

Answer 56

Er en proces for at levere nøgent of oprenset nucleidsyre med ikke-virale metode til eukaryotiske celler.

Question 57

Forklar ordet transduktion

Answer 57

Er processen for fremmede genetisk materiale er introduceret ind i cellen via virus eller virale vektorer.

Question 58

Forklar ordet transformation

Answer 58

Er indsættelse af nukleidsyre ind i cellen. | Er ofte brugt til at beskrive ikke-viral DNA overførelse i bakterier og planter.

Question 59

Hvad betyder transient ekspression af et gen?

Answer 59

Genet er ikke blevet integreret i genomet og forventes at blive tabt.

Question 60

Hvad er CRISPRs naturlige funktion?

Answer 60

Det er et system som genkender og kløver invaderende nukleidsyre.

Question 61

Hvad er det vigtigste for CRISPR/Cas9 for at den kan genkende og kløve gener?

Answer 61

Den er afhængig af single-guide RNA (sgRNA).

Question 62

Beskriv hvordan CRISPR/Cas9 udøver sin effekt når den kløver DNA

Answer 62

sgRNA som er bundet til en spacer, som definerer det genomiske sted, der skal modificeres. Når spaceren har bundet til det genomiske sted, ved siden af PAM, er DNAet kløvet. Derefter er det ødelagte DNA repareret af DNA reparations mekanismen.

Question 63

Efter at Cas har lavet et break i en DNA sekvens er der to typer af DNA reparations mekanismer der kan træde til. Hvad gør den homologe-direkte reparation?

Answer 63

Kan modificerer nukleitud sekvenser præcist.

Question 64

Efter at Cas har lavet et break i en DNA sekvens er der to typer af DNA reparations mekanismer der kan træde til. Hvad gør den ikke-homologe sammensætning af ender?

Answer 64

Den producerer insertion eller deletion der forstyrrereller inaktiverer målgenet.

Question 65

Hvordan kan man ellers bruge CRISPR/Cas9 uden bruges af deres kløvning af DNA?

Answer 65

Man kan katalytisk inaktiverer Cas9, med forskellige regulatoriske domæner, hvorved man skaber aktivatorer eller inhibitorer der kan aktiverer eller dæmpe ekspressionen af et målgen.

Question 66

Nævn de udfordringer der er ved bruges af CRISPR/Cas9

Answer 66

Ikke alle muterede locus har en PAM, som er den Cas bruger til at genekende. Kan have off target bivirkninger på genomet, leverings vesikler, immunsystemet eller DNA reparations responset.

Question 67

Nævn nogle gen blokerings terapier

Answer 67

Antisense terapi Ribozym terapi RNA interference

Question 68

Beskriv hvordan man kan bruge antisense terapi til GOF mutationer

Answer 68

Oligonucleotider er opbygget således at de er komplementære til den mRNA sekvens der produceres af GOF mutation, eller til dsDNA med mutationen i sig selv, således at RNA ikke kan blive translateret til proteiner.

Question 69

Hvad er ulemperne ved antisense terapi?

Answer 69

Antisense nukleotider er ofte nedbrudt før de når deres mål. Variationer i formen af mål DNA eller RNA gør det svært for antisense nukleotiden at binde til den komplementære sekvens.

Question 70

Beskriv hvordan man kan bruge Ribozym terapi til GOF mutationer

Answer 70

Et enzymatisk RNA molekyle er designet således at det kan kløve mRNA af f.eks. en mutation så det ikke translateres til proteiner.

Question 71

Forklar hvordan man kan bruge RNA interference som genterapi

Answer 71

Er egentlig et naturligt fænomen, hvor viral dsRNA bliver nedbrudt. Ved artificial syntese af dsRNA, der svarer til det sygdomsfremkaldende DNA, vil enzymet Dicer nedbryde dsRNA til siRNA, disse vil forme en template der genkendes og bindes af RISC, som kløver og nedbryder den komplementære RNA streng.

Question 72

Hvilke udfodringer er der ved at bruge RNA interference som genterapi?

Answer 72

RNA molekylerne kan risikerer at blive nedbrudt inden de når deres mål.

Question 73

Definer gen terapi

Answer 73

Er en procedure til at behandle eller forbedre en patients tilstand ved at modificerer patientens celler genetisk.

Question 74

Nævn de to typer genterapi kan blive klassificeret under

Answer 74

Somatisk | Germline

Question 75

Hvilke udfordringer er der ved at bruge genterapi på germline?

Answer 75

Risiko for at embryonet dør under injektionen. Udvikling af malformationer eller tumorer. Etik.

Question 76

På hvilke to måder kan man anvende genterapi?

Answer 76

In vivo | Ex vivo

Question 77

Hvordan kan man bruge genterapi i behandling af cancer?

Answer 77

Bevarer beskyttende proteiner (tumorsuppressor gener) Inaktiverer onkogen ekspression Leverer gener til maligne celler, så de bliver mere følsom over for medicin. Give cancer celler proteiner, som gør dem mere genkendelige for immunsystemet. Leverer proteiner til raske celler så de kan modstå kemoterapi.

Question 78

Hvilke store tekniske udfordringer eller kritiske trin kan genterapi kategorires i?

Answer 78

``` Effekticitet af vektor transport Vedholdenhed Aktivitet Immunrespons Regulatoriske problemer Etik Fordele for firmaer finansielt. ```

Question 79

Hvilke udfordringer skal man være særlig opmærksom på, hvis man skal designe en vektorer som leveringsmetode af geneterapi?

Answer 79

``` Vektoren skal beskytte DNA Den skal specifik leverer det til målcellen Den skal kunne igennem plasmamembranen Skal kunne undslippe endosomer Leveringen af det genetiske materiale. ```

Question 80

På hvilken måde kan en vektor komme ind i nukleus?

Answer 80

Ved celledeling | Ved porer i i nucleus membranen.

Question 81

Nævn andre store udfordringer der er ved genterapi

Answer 81

``` Leveringvejen Nedbrydelse via immunsystemet Mangel på receptorer der kan lukke leveringsmetoden ind og eller er de på off target celler. Krydse blod-hjerne-barrieren Størrelse p ågener. ```

Question 82

Hvilke udfordringer i klinikken er der ved at bruge virale vektorer?

Answer 82

Det er svært at behandle tidligt. Størrelse på vektor og det gen man vil indsætte. Outcome er ofte urealistiske. Man har kun en chance pga. immunogenitet.