Génétique 6 (intro au diagnostic moléculaire) Flashcards
(144 cards)
1
Q
Définition du diagnostic moléculaire?
A
Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigenome
2
Q
~ ___ nouveaux tests cliniques disponibles par jour
A
10
3
Q
Combien de tests disponibles en ce moment?
A
Plus de 60 k
4
Q
Combien de gènes sont couverts par nos tests?
A
10%
5
Q
Décrit l’ADN.
nb de liens H, charge et constitution
A
Acide nucléique = sucre + phosphate + base
Charge négative (phosphate)
Liens hydrogène
* G-C : 3
* A-T : 2
6
Q
Importance du phosphate qui confère une charge négative à l’ADN.
A
Important pour isolation/extraction de l’ADN
7
Q
Importance de connaitre le nombre de liens hydrogénés entre les bases de l’ADN.
A
Important pour PCR/hybridation
Pour dénaturer ADN, besoin de plus d’énergie pour briser ( + d’Énergie pour 3 liens H que juste 2 liens H)
8
Q
Décrit la structure du gène, de gauche à droite.
A
Promoteur
5’ UTR
Codon d’initiation
Exon (GT)
Intron
3’ UTR
Codon STOP
9
Q
Début d’intron?
A
GT
10
Q
Début d’exon?
A
AG
11
Q
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome non pathologique?
A
Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associée à une pathologie génétique
12
Q
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome pathologique?
A
Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
13
Q
Est-ce qu’on possède beaucoup de variations sur notre génome?
A
Oui
plus de 5-6 M
14
Q
Est-ce que nous possédons les même variations génétiques que nos parents?
A
NON
~70 surviennent de novo, i.e. sont absentes chez les parents
contribue à diversité génétique
15
Q
Est-ce que la plupart de nos variations sont pathologique?
A
Non
16
Q
Que peuvent être les variations non pathologiques?
A
1) Dans régions non codantes (régions intergénique, introns)
2) Polymorphisme
3) Touche un gène qui s’exprime seulement à l’état récessif et il n’y a pas une seconde variation
17
Q
Endroit de prédilection pour la survenue de variations génétiques.
A
Ilots CpG
18
Q
Décrit les mutations qui peuvent survenir au niveau des îlots CpG.
A
C →methyl-C (methylation)
Methyl-C →U (PAS de U dans ADN)
U→T
CG → TG (le + fréquent)
19
Q
deux types de marqueurs génétiques utilisés en génétique moléculaire pour étudier la variabilité génétique au sein des populations
A
moyenne: microsattelittes
petite: SNP (polymorphismes nucléotidiques simples)
20
Q
Que sont les microsatellites?
A
Répétition d’une petite séquence (ex: CA)
21
Q
Pk les microsatellites sont des marqueur très puissants pour établir l’identité génétique?
A
À l’emplacement spécifique du microsatellite sur le chromosome, il y a environ dix variations différentes de la séquence génétique.
Dans une population donnée, les individus auront des versions légèrement différentes de cette séquence microsatellite à cet endroit précis sur leur ADN. Cette diversité au niveau des allèles est courante dans les populations et contribue à la variabilité génétique.
22
Q
Que sont les SNP?
A
Changement d’un seul nucléotide / un seul nucléotide est remplacé par un autre
Par exemple, à un certain endroit, certains individus peuvent avoir un “A” à cet emplacement, tandis que d’autres auront un “G”.
23
Q
Entre les microsatellittes et les SNP, quel type de marqueur est particulièrement utile pour étudier la diversité génétique?
A
LES MICROSATELLITES
Ils sont généralement plus polymorphes, ce qui signifie qu’ils ont tendance à avoir un plus grand nombre d’allèles différents au sein d’une population.
24
Q
Quelle mutation est la plus fréquente?
A
Substitution
+ de la moitié des mutations
25
Nomme les 4 conséquences possibles des variations.
1) Homologue (silencieux)
2) Faux-sens (missense)
3) Non-sens (nonsense)
4) Altération du cadre de lecture (frameshift)
26
Homologue?
Change un codon pour un autre codant pour le **même acide aminé**
27
Faux-sens?
Change le codon pour celui codant pour **un autre acide aminé**
28
Non-sens?
Change le codon pour un **codon stop**
29
Frameshift?
Insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une **modification du codon et de ceux en aval**
30
5 **éléments à considérer** pour évaluer le **degré de danger** d’une mutation?
1) Fréquence population
2) Conservation
3) Impact ARNm
4) Impact sur la protéine
5) Fonction du gène
31
V ou F: une mutation **homonyme** est habituellement pathologique.
**FAUX**: habituellement bénin
pas de changement au niveau de la protéine
sont tolérées, pas à l'origine de pathologie patient
32
V ou F: une mutation **non-sens ou frameshift** est habituellement pathologique.
**VRAI**
33
V ou F: une mutation **faux-sens** est habituellement bénin.
**FAUX**: ambiguïté par rapport à cette mutation; variable
34
Gène récessif?
Le phénotype est exprimé seulement à l’**état homozygote**
35
Gène dominant?
Le phénotype est exprimé à l’**état hétérozygote**
36
**Perte** de fonction?
Une **réduction** dans la **quantité** de la protéine produite, ou une **réduction** de l’activité de la protéine
cause le phénotype
37
V ou F: la perte de fonction est la base de la majorité des **maladies récessives** (et certaines dominantes).
**VRAI**
38
**Gain** de fonction?
Une **augmentation** dans la **quantité** de la protéine produite, une augmentation de l’**activité** de la protéine ou une nouvelle **fonction** de la protéine entraîne le phénotype
39
Nomme les 5 mécanismes associés aux **gains de fonction**.
1) Augmentation du **dosage génique**
2) Altération de l’**expression de l’ARNm**
3) **Activité accrue** de la protéine
4) **Nouvelle fonction** de la protéine
5) **Altérations toxiques** à la protéine
40
3 exemples de maladie génétique causées par une expansion anormale de trinucléotides (**mutations dynamiques**)?
1) Steinert
2) X fragile
3) Huntington
41
But de l’isolation génétique?
**Isoler l’ADN du reste du contenu cellulaire** (majoritairement protéines)
42
Quelles **cellules** sont utilisées pour l’isolation de l’ADN?
**Cellules nucléées** (sang: leucocyte)
43
De quoi faut-il se servir pour isoler l’ADN?
Il faut se servir des **caractéristiques spécifiques** de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire
44
Nomme les deux produits utilisé pour isoler l’ADN.
1) **Phénol-Chlorophorme**
2) **Sels chaotropiques**
45
Que fait l’ADN en présence de sels chaotropiques?
à cause de sa charge négative, l'ADN **se colle sur la colonne de verre/membrane**
46
Que font les autres substances en présence de sels chaotropiques?
**solubles** dans l’eau (le reste ne se colle pas au verre/memnbrane)
on se débarrasse de tout ce qui est pas ADN
47
Avantages des sels chaotropiques?
**Non-toxique**
**Automatisable**
48
Nomme les deux technique qui permettent d’**évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN**.
1) **Densité optique**
2) **Teintures intercalantes** (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
49
Quelle est l'absorbante maximale de l'ADN (nm)? Et celle des protéines?
λ 260nm = absorbance max ADN
λ 280mm = absorbance max pour protéines
50
Importance de la **densité optique**.
Estimation de la **quantité de l’ADN** (ratio 260/280 estime pureté)
51
À quoi servent les **teintures intercalantes**?
Composés qui **se fixent à l’ADN double brin**
Estimation de la **quantité** et de la **taille** de l’ADN
52
Principe de l'**hybridation**:
On construit une **séquence de nucléotides complémentaire à une portion de l'ADN du patient (sonde)**
Elle est marquée (fluorescence, radioactivité)
La détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
53
De quoi est formé la sonde?
Séquence d’ADN complémentaire
Marquage (fluo, radioactif)
54
La détection du signal indique la présence de la _____________________.
séquence complémentaire
55
Qu’est-ce que l’**électrophorèse capillaire**?
On sépare les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant **migrer à travers un gel** (e.g. Agarose)
56
Lors de l’**électrophorèse capillaire**, qu'est-ce qui influence la distance parcourue par les molécules à travers le gel?
grosse molécules prennent + de temps à circuler donc migrent sur - longue distance
molécules qui ont migrer sur plus longue distance = plus petites
57
Nomme une technique sur l’**ADN génomique**.
**Buvardage Southern**
58
Est-ce que le bavardage Southern utilise le test PCR?
**NON**; c'est le seul qui ne l'utilise pas
59
Qu’est-ce que le **buvardage Southern**?
Technique qui combine **électrophorèse** sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’**hybridation** par une sonde marquée complémentaire à l’ADN cible
60
Explique les 5 étapes du **buvardage Southern**.
A. Digestion de l’ADN génomique
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane
D. Hybridation
E. Détection par autoradiographie
61
Qu'est-ce que le **buvardage Southern** permet?
Déterminer la taille des grande expansions dans les **mutations dynamiques**
62
Est-ce que nous possédons 1 seule polymérase?
**NON**
63
V ou F: les polymérises ont toutes le meme taux d'erreur.
**FAUX**
64
V ou F: la Taq polymérase est infaillible et ne fait aucune erreur.
**FAUX**
65
Taux d’erreur de Taq?
**8 x 10^-6**
66
Que veut dire PCR.
Polymerase Chain Reaction
67
Principe de la PCR.
technique utilisée en biologie moléculaire pour **amplifier** et produire en **grande quantité** une **région spécifique d'ADN**.
C'est un processus qui permet de créer de nombreuses copies identiques d'un fragment d'ADN en un court laps de temps.
avoir assez d'ADN pour utiliser des techniques en aval (signal assez robuste pour détecter)
68
3 étapes PCR.
**Dénaturation** : Chauffage de l'échantillon pour séparer les brins complémentaires d'ADN.
**Appariement d'amorces** : Refroidissement de l'échantillon pour permettre aux amorces (petites séquences d'ADN) de se lier spécifiquement à la séquence d'ADN cible.
**Extension** : Utilisation d'une enzyme appelée ADN polymérase pour synthétiser une nouvelle chaîne d'ADN complémentaire à la séquence d'ADN cible.
69
La PCR fait _________ la quantité d’ADN à chaque cycle.
**doubler**
si j'ai 30 cycles, j'ai 2^30 molécules
70
Principe du **PCR-migration**.
**Électrophorèse capillaire** des produits de PCR
Détection du signal - la distance où se situe la bande par rapport au puits reflète sa taille
71
Que permet de détecter le **PCR-migration**?
Importante pour détecter des **insertions** ou des **délétions**.
72
Application de **PCR-migration**.
* Instabilité des microsatellites
* Contamination foeto-maternelle
* Pathologie judiciaire
73
Explique cette figure:
Gène normal mesure 250 pb
Si j'ai une délétion de 8pb, je me retrouve avec 242 pb (DÉLÉTION RÉCURRENTE)
Individu a un allèle avec nombre de pb normal et un avec pb mutées = hétérozygote
74
Lien entre PCR-migration et **contamination foeto-maternelle**
Mère a deux allèles pour un micro satellite
Le foetus normal va avoir le même allèle que sa mère et un allèle de son père (2e allèle maternel ne se retrouve pas chez ;le foetus)
Si il y a contamination avec sang de la mère; il y a aura un allèle de la mère, un allèle du père ET une portion de l'autre allèle de la mère (petit pic)
75
Principe de **PCR-digestion**
Digestion d’un produit de PCR par une **enzyme de restriction** qui reconnaît une **séquence spécifique** dans l'ADN
Si il reconnait sa séquence spécifique, il **coupe l'ADN**
ex: EcoR1 coupe à G_AATTC & Dra I coupe à TTT_AAA
76
Impact d'une **mutation** de l'ADN sur l'enzyme de restriction.
mutation peut **créer ou abolir** site de restriction d'une enzyme. Allèle n'ayant pas la mutation A le site de restriction, mais c'elle qui a la mutation n'a PAS le site de restriction
en utilisant l'enzyme de restriction sur produit de PCR, on obtient une bande de taille attendue suite à migration.
Si il y a changement d'une pb (exemple: on change un T pour un C) -> à D sur figure, l'enzyme de restriction ne reconnait plus et ne couple plus (on aura un plus gros fragment et pas ce a quoi on s'est attendu)
77
Application de **PCR-digestion**
Mutations ponctuelles récurrentes
Il est habituellement possible de trouver un **site de restriction créé ou aboli par la mutation** que l'on recherche
78
Test où on aura la détection de signal basée sur le **primer**.
**Allele Specific Primer Extension** (ASPE)
79
Comment se fait l'**Allele Specific Primer Extension**?
Amplification PCR avec **amorces** marquées à **fluorescence** dont certaines ont un mismatch en 3'
En somme, l'amorce est utilisée pour initier la synthèse d'une nouvelle chaîne d'ADN, et si la séquence d'ADN complémentaire est présente, une sonde spécifique peut se lier à cette séquence et émettre un signal fluorescent, permettant ainsi la détection et l'identification spécifique de la séquence cible.
Différentes sondes associées à différents allèles.
80
V ou F: dans **Allele Specific Primer Extension**, on a une extension si on a un mismatch en 3'.
**FAUX**: extension si MATCH en 3'
81
Différence entre **Allele Specific Primer Extension** et l'**hybridation**.
**Allele Specific Primer Extension**: Fluorescence en lien avec l'**extension de l'amorce**
**Hybridation**: fluorescence au niveau dune sonde qui vient s'**hybrider dans le fragment**.
82
Principe du **séquençage de Sanger**.
méthode pour déterminer l'**ordre précis** des nucléotides dans une séquence d'ADN
83
Est-ce que le **séquençage de Sanger** utilise le bloc d'élèctrophorèse capillaire pour fonctionner?
**OUI**
84
3 étapes du **séquençage de Sanger**.
1) **Amplification PCR**
2) **Dénaturation** (2 brins simples)
3) **Réamplification**
85
Explique la **réamplification** lors du **séquençage de Sanger**.
Pour chaque brin simple d'ADN obtenu après la dénaturation, vous effectuez une nouvelle réaction d'amplification (on allonge le fragment d'ADN).
Cette fois-ci, vous ajoutez un mélange de **nucléotides réguliers** (A, C, G, T) et des **nucléotides modifiés**
86
Comment se nomment les nucléotides modifiées?
**ddNTPs** (dideoxynucléotides triphosphates)
87
Chaque ddNTP est marqué avec ... différente
une **fluorescence**
(par exemple, un pour A, un pour C, un pour G, un pour T).
88
Différence entre dNTPs et ddNTPs.
Contrairement aux dNTPs, les **ddNTPs manquent d'un groupe OH à l'extrémité 3'**
Ceci empêche la liaison du prochain dNTP (chain termination)
89
V ou F: L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est **aléatoire**
**vrai**
90
Impact de l'ajout de ddNTP sur la réaction de synthèse d'ADN.
L'ajout de ddNTPs **arrête** la réaction de synthèse d'ADN à des positions aléatoires, car ces nucléotides modifiés ne permettent pas la poursuite de la chaîne.
Ainsi, chaque brin en cours de synthèse s'arrête à des positions différentes.
Le résultat est une série de fragments d'ADN de longueurs variables, tous marqués avec une couleur spécifique associée au nucléotide modifié incorporé.
91
Qu'est-ce qu'on fait avec ces informations là? Pk est-ce utile?
En reliant les couleurs des fragments d'ADN à la position spécifique le long du gel, on peut reconstituer la **séquence d'ADN originale** complète de la région analysée.
On peut déterminer la **séquence d'ADN complète** du patient.
92
Importance du **séquencage de Sanger** en clinique.
* Gènes avec **grand nombre** de mutations dispersées à-travers du gène
(on voit les mutations n'importe ou dans le gène)
93
V ou F: le **séquencage de Sanger** est la méthode de choix pour les substitutions et pour trouver des petites insertions/déletions.
**vrai**
94
Est-ce que le **séquencage de Sanger** peut détecter les grandes anomalies de dosage?
**non**
95
Variation de la PCR.
**PCR temps réel**
96
Principe de PCR temps réel.
Réaction de PCR avec **détection du produit simultanée** avec utilisation de fluorescence.
97
2 utilités de **PCR temps réel**
* Discrimination allélique (mutations fréquentes)
* Quantification (relative/absolue) (nombre de copies dans génome)
98
Élément important dans le mélange réactionnel lors de l'essai taqman dans le cadre de la PCR à temps réel.
**sonde Taqman**
99
C'est quoi la **sonde Taqman**? 2 composantes?
**Courte séquence d'ADN** qui est complémentaire à une partie spécifique de la séquence d'ADN cible. Constituée de:
1) **rapporteur** (r)
2) **quencher** (q)
100
Role du rapporteur (R).
Fluorochrome
101
Role du quencher.
absorbe la fluorescence quand la sonde est en solution
(empêche la sonde d'émettre la fluorescence en sln)
102
Explication de l'essai TaqMan dans PCR temps réel.
échantillon d'ADN contient le GèneX.
Préparation mélange réactionnel contenant l'ADN cible, des amorces spécifiques pour le GèneX, des nucléotides (A, C, G, T), une enzyme ADN polymérase, et une **sonde TaqMan spécifique au GèneX**.
Lorsque la réaction de qPCR démarre, l'ADN polymérase commence à amplifier le GèneX. À chaque cycle, la **sonde TaqMan se lie à la séquence spécifique du GèneX** et est **clivée par l'activité de l'enzyme**.
Cela **libère le fluorochrome**, générant un signal fluorescent.
103
Que permet la libération du signal fluorescent au fur et à mesure de l'amplification?
permet de quantifier la présence de ce gène dans l'échantillon initial.
104
combien de phases dans un réaction typique de PCR à temps réel?
**3**
105
Utilité clinique du **PCR à temps réel**.
se passe sur une plaque **multi puits**
si on veut tester mutation fréquente chez un **très grand nombre de patients** en même temps
Discrimination allylique
106
Dans le **PCR à temps réel**, on fixe un ...
**seuil arbitraire**
107
Le seuil est-il le même pour tous les patients testés?
**OUI**
108
En quoi est mesuré le seuil?
En **unités relatives de fluorescence** (RFU - Relative Fluorescence Units)
109
Plus la quantité d'ADN cible est élevée, plus la fluorescence ...
**augmente**
110
Cycle auquel la fluorescence de l'échantillon **dépasse le seuil choisi**.
**Ct** (cycle de seuil)
111
Interprète les résultats suivants:
Echantillon A : Ct = 20
Echantillon B : Ct = 25
Exemple: si le seuil est de 100 RFU
Pour l'échantillon A, la fluorescence dépasse le seuil au cycle 20, et pour l'échantillon B, elle dépasse le seuil au cycle 25.
Un **Ct plus bas** indique que la réaction a **atteint le seuil plus tôt**, ce qui signifie que l'**ADN cible était plus abondant** dans cet échantillon.
Dans cet exemple, l'échantillon A a une quantité initiale d'ADN cible plus élevée que l'échantillon B, car il a atteint le seuil plus tôt au cours des cycles d'amplification.
112
À chaque cycle, le nombre de molécules d'ADN ...
**double**
*comme dans la PCR*
113
Méthode pour la recherche de délétions/duplications dans **tous les exons** dans un gène.
**MLPA**
114
Que veut dire **MLPA**?
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
115
Quel test est utilisé pour une maladie impliquant plusieurs gènes (ex: dystrophie musculaire de duchenes)?
**MLPA**
116
Particularité de la sonde dans **MLPA**.
Sonde en **deux sous-unités** (2 oligonucléotides) qui doivent s'hybrider côte-à-côte sur l'ADN du patient
117
Longueur du gap entre les deux sous-unités de la sonde en termes de nucléotides.
gap de 1 nucleotide
118
5 étapes de **MLPA**.
1) **dénaturation**
2) **Hybridation** des deux portions de la sonde
3) Ligation des deux portions de la sonde via la **ligase**
4) **Amplification PCR** de la sonde fusionnée
5) **Électrophorèse capillaire**
119
Utilité du **séquençage des nouvelle génération (SNG)**.
Permet de **multiplier l'information obtenue d'une analyse**
120
Point positif cliniquement du **séquençage des nouvelle génération (SNG)**.
Possible d'analyser **plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps** (grâce aux codesbarre moléculaires)
121
5 étapes du **séquençage des nouvelle génération (SNG)**.
1) Fragmentation de l'ADN
2) Capture
3) Liaison d'adaptateurs
4) Amplification en parallèle
5) Séquençage en parallèle
| truc: FCLAS
122
En combien de bases se fragmente l'ADN lors de la première étape?
100-150 pb
123
3 moyens pour fragmenter l'ADN:
1) sinisation
2) nébulisation
3) digestion
124
Explique l'étape de capture de l'ADN.
On retient la séquence qui constitue le gène par lequel on s'intéresse.
**Isolation** d'une séquence d'une portion du génome
point fort: pas besoin de faire le séquencage entier du génome
125
2 adapteurs qui sont liés à l'ADN lors de la 3e étape.
1) Adaptateur de séquençage
2) code-barre moléculaire
126
de quoi est composé le **code-barre moléculaire**?
**oligonucléotides**
127
Importance du **code-barre moléculaire**.
Différencie les patients entre eux; chacun a son propre code barre
On sépare les données grace au code barre
128
Pk parle-t-on d'**amplification en parallèle**?
Car amplification en parallèle des régions du génome que l'on veut séquencer
en **micro-compartiments**
129
Dernière étape du **séquençage des nouvelle génération (SNG)**.
**séquençage en parallèle**
130
À ce stade on a généré plusieurs milliers de séquences d'environ ~ ... paires de bases
**100-150**
131
Avec quoi les séquences peuvent-elles être attribuées à chaque patient?
selon le **code-barre moléculaire**
132
Maintenant qu'on a bcp d'information de séquence, que faire (3 étapes)?
1) Il faut procéder à l'**alignement** de ces séquences au bon endroit du génome humain
2) Ensuite identifier si des **variations** de séquence sont présentes p/r au génome de référence
3) Ensuite déterminer si certaines de ces variations sont **pathologiques** et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
133
2 **applications** du SNG.
1) **séquençage de l'exome**
2) **séquençage de l'ADN foetal circulant**
134
Combien de nucléotides dans notre génome?
**3 milliards**
135
Pourcentage de notre génome qui représente les **régions codantes**.
**1%**
136
Dans ce 1% du génome se trouve la majorité des **mutations causales de quelle maladie**?
mutations causales de la **déficience intelectuelle**
donc moyen intéressant d'explorer ces patients
137
Après le **séquencage de l'exome**, on retrouve combien de variations génétiques par individu?
on obtient a la fin **20 000 variations génétiques** par individu
vs 3 milliards de nucléotides ds le génome
138
**Importance clinique** du SNG.
Base de tests clinique pour diagnostic **maladies rares et cancer**
on peut séquencer une **grande proportion du génome** en **meme temps**
139
Dans le SNG, est-ce qu'on voit les introns?
**non** car on ne les capturent pas
(on a fait une capture pour capturer les régions codantes)
140
Séquençage de l'**ADN foetal circulant**.
141
Chez les femmes enceintes, on peut détecter une séquence de ...
**chromosome Y**
*patientes enceintes d'un foetus masculin*
142
Après centrifugation, qu'est ce qu'on retrouve dans la **couche de leucocytes** chez la femme enceinte?
**SLM L'ADN DE LA MÈRE**
143
Après centrifugation, qu'est ce qu'on retrouve dans la **couche de plasma** chez la femme enceinte?
**ADN LIBRE / ACELLULAIRE** (en circulation dans le **plasma**)
dans plasma, on retrouve des séquences d'origines maternels et de l'unité foeto-placentaire
(on peut détecter la **présence de chromosome y**)
144
Par contre, pour mettre en évidence un gain ou une perte de séquence présente **chez la mère ET chez le foetus**, comment-faire?
Besoin technologie très sensible
SNG dans génome entier à faible profondeur
On compte séquences qui appartiennent au chromosome 21 (si + de séquence attendues -> + à risque)
