Genové inženýrství

Question 1

Analýza transkriptomu - analýza na čipu

Answer 1

• = Lab on a chip
• Zastaralá metoda, teď už se v laborkách nepoužívá
• vyvinuty čipy (sklo, silikon) s mnoha vzorky ssDNA oligonukleotidů na které byly nakapávané kapky oligonukleotidových sond specifických ke konkrétní mRNA -> hybridizace těchto mRNA k sondám -> detekce konkrétní mRNA fluorescencí
• kvantifikace signálu - je známo množstvní dané mRNA
• značení fluorescencí
• porovnání 2 stavů buňky - senescentní x rakovinná, pod vlivem hormonu x bez hormonu
• dnes je výhodnější DNA sekvenovat

Question 2

Elektroforéza - co to je, northern blot, southern blot, western blot, isoelektrická fokusace, dělení proteinů podle molekulární hmotnosti

Answer 2

• pro NK i proteiny
• dělení NK na molekulovém sítu (agarózový gel pro NK, polyakrylamidový gel pro proteiny), v elektrickém poli podle velikosti a tvaru
• při pH = cca 7,5
• do nádoby se vloží napětí -> pohyb směrem k anodě díky jednotkovému (-) náboji (SDS)
• nutná vizualizace -> obarvení interakalačními činidly (ethidium bromid - interkalace do DNA)
  NORTHERN BLOT:
• na membránu nanesu RNA a tu pak visualizuju
  SOUTHERN BLOT:
• přenos DNA na membránu -> přidá se komplementární DNA, která je vizualizovaná
  WESTERN BLOT:
• na membránu přenesu proteiny -> vizualizuju pomocí protilátek
  PROTEINY:
• každá AMK má v daném pH jiný náboj -> vložím náboj na všechny proteiny
• nějčasteji se obalí detergentem (SDS) -> udělení záporného náboje
  ISOELEKTRICKÁ FOKUSACCE:
• dělení proteinů podle náboje
• na gelu gradient pH
• protein se zastaví v tom pH, kde má isoelektrický bod
  DĚLENÍ PROTEINŮ PODLE MOL. HMOTNOSTI:
• udělení (-) náboje všem proteinům pomocí SDS
• SDS působí jako povrchově aktivní činidlo, při zahřátí unfolduje protein
• zahřátí vzorku -> denaturace, ale protein se nesráží -> nanesení na polyakrylamid -> proteiny proplétají gelem, menší rychleji
• protein + SDS -> zahřátí -> na PAA gel

Question 3

Vizualizace proteinů

Answer 3

• barvení gelu elektroforézy
• potřeba detekce 1 konkrétní bílkoviny z desítek tisíc v eukaryota
• kvantifikace množství v kultuře po působení látky
• všechny proteiny z gelu na membránu -> zachycení bílkovin -> specifická detekce protilátkou
• využití enzymů/jiných způsobů vizualizace pro amplifikaci - slabý signál, malé množství proteinu ve vzorku

Question 4

PCR - směs (7), průběh, využití, denaturační křivky

Answer 4

• = Polymerase Chain Reaction
• obrovské namnožení určitého úseku DNA
• kvalitativní metoda - ukazuje zda někde něco je/není
• často se používá Taq polymeráza - Thermus aquaticus, dělá chyby, nemá proofreading aktivitu
  PCR SMĚS (7):
• Templátová DNA
• Forward primer
• Reverse primer
• dNTPs
• Pufr (vhodné prostředí)
• Mg2+ (pro polymerázu)
• Polymeráza
  PRŮBĚH:
• Směs -> zahřáté -> denaturace DNA (dsDNA na ssDNA) -> snížení teploty (annealing) -> nasednutí primerů na ssDNA -> 3’-OH očko primerů na ssDNA pro nasednutí Tag polymerázy -> prodloužení primeru -> zvýšení teploty
• další cyklus -> denaturace -> oddělení DNA -> reasociace primerů -> polymerace
• vznikají pořád delší molekuly
• nemusíme zná celou sekvenci, stačí jen okraje pro primery
• sekvence musí mít max několik kb
• Po ukončení PCR - dostanu 2^n molekul DNA (n = počet cyklů)
  VYUŽITÍ:
• Diagnostika - detekce patogenů, hledání mutací v genech, náchylnost k chorobám
• Forenzní praxe
• Klonování namnoženého úseku DNA
• mutageneze
• RT PCR (reverzní transkripce, pro RNA)
• sekvenování
• příprava sond
  DENATURAČNÍ KŘÍVKY:
• pro potřebu znání teploty tání NK
• detekce nově vzniklých dsDNA produkujících fluorescenci -> zahřívání po jednom stupni
• sleduju ubývání fluorescence -> denaturační křivka
• možnost vidět změny v 1 nukleotidu

Question 5

RT PCR

Answer 5

• detekce RNA pomocí PCR
• potřeba RNA převěst na DNA pomocí reverzní transkriptázy
• Rezerní transkriptáza - 2 aktivity, RNA dep. polymerázová aktivita + aktivita RNázy H pro odbourávání primerů

Question 6

Sekvenování - SANGER - směs, mechanismus

Answer 6

• (Sekvenování = určení nukleotidového složení)
• terminace transkripce
• často využívá DNA pol. (často Taq)
  SMĚS:
• 1 primer
• 4 dNTPs
• trochu ddNTPs (chybí jim 3’OH očko -> nemůže být prodlužován -> terminace)
  MECHANISMUS:
• na templát DNA nasedá 3’OH očko -> prodloužení DNA pol.
• ddNTPs se náhodně zařazují -> vznikají náhodně dlouhé úseky -> vizualizace
• vznik řady proužků, kde známe poslení nukleotid -> elektroforéza
• elfo. musí být schopná oddělit i dlouhé fragmenty s rozdílem 1 nukleotidu (↑ koncentrace močoviny, ↑ teplota)
• nejrychleji se pohybují malé fragmenty -> čte se od toho nejdál
  ddNTPs se označují fluorescenčními barvičkami
• dnes se používá jen na malé sekvenování

Question 7

Sekvenování - Pyrosekvenování - emulzní PCR, průběh

Answer 7

• směs DNA (např. izolovaný genom) - můžeme sekvenovat jen určité úseky
• DNA -> rozdělím na více úseků -> sekvenace -> prokládání
• amplifikace signálu pomocí emulzní PCR
  EMULZNÍ PCR:
• velký nafragmentovaný genom
• fragmenty chci osekvenovat zároveň, ale číst separátně
• vezmu speciální kuličky, které mají na povrchu ss oligonukleotidy DNA a jsou komplementární k adaptérovým sekvencím na koncích fragmentů, které jsme si předem připojili
• Adaptér = primer pro syntézu -> tvorba komplementárního vlákna nasazeného na kuličku
• směs kuliček a fragmentů -> tvorba emulze -> tvorba bublin
• v každé bublině je jen 1 kulička s adaptéry, fragmenty se připojí na kuličku (1v1) -> PCR separátně v bublinách
• v 1 bublině se množí 1 fragment
• kulička je obklopená spoustou kopií svého fragmentu
• kuličky pak zapadnou do komůrek ve speciální destičce -> sekvenování
• dlouhou dobu velmi populární
• konec podpory pro tyto přístroje
• namnožený templát na kuličce v komůrce -> přidám směs pro syntézu DNA (DNA pol., dNTPs, primer, ATP sulfuryláza)
• DNA pol. přidá za -OH skupinu primeru nukleotid -> uvolní se pyrofosfát a vodík -> uvolnění ATP -> luciferáza využije ATP pro luminiscenci -> detekce
• luminiscence vznikne po každém napojení nukleotidu
• pokud 3A za sebou -> signál silnější

Question 8

Sekvenování - Illumina

Answer 8

• dnes nejčastější
• amplifikace pomocí můstkové PCR
• speciální destička, na jejím povrchu zachycené krátké oligonukleotidy komplementární ke koncovým adapterům (levý, pravý)
• na destiku vzorek DNA -> PCR (fragment se napojí k adapteru -> ohne se -> druhým koncovým adapterem páruje k vedlejšímu oligonukleotidu = primer pro amplifikaci -> denaturace -> můstek se narovná)
• původní zachycený fragment mizí a nový zůstává - pokračování primeru
• vznikají shluky fragmentů, kde každý původní fragment reprezentuje jinou část genomu, mnoho kopií
• používají se modifikované dNPTs, 3’OH skupinu mají blokovanou, je to vratné
• cyklické reverzibilní terminátory - každý typ s napojenou barvou, přidám do vzorku + DNA pol. + primer
• DNA pol. zařadí reverzibilní terminátor -> zasvítí -> zastavení syntézy -> odečteme -> odstraníme blokování -> syntéza jede dál

Question 9

Sekvenování - SoLid system

Answer 9

• moc se neujalo, dnes už není podporováno
• nové vlákno se nesyntetizuje podle templátu nukleosidtrifosfátu
• 16 oligonukleotidů, každý začíná určitou dvoupísmenovou kombinací (zbytek páruje s čímkoli), na druhém konci fluorescenční značka (4 barvy, 1 barva pro 4 kombinace)
• templát + primer + 16 oligonukleotidů -> k templátu se připojí komplementární oktaoligonukleotid -> odštěpení 3 nukleotidů z oktaol. -> odstranění fluorescenční značky -> může nasednout další -> ligáza spojuje
• detekuje se, jaký fragment nasedl, jaká barva zasvítila -> 1 ze 4 kombinací
• 3 písmenka nevíme -> denaturace -> opakování procesu (primer o 1 nukleotid delší) -> posunutí -> mnoho cyklů

Question 10

Sekvenování - Ion Torrent

Answer 10

• jako pyrosekvenování
• detekce není na základě luminiscence, ale na detekci uvolněného H při zařazení nového nukleotidu
• změna koncentrace H -> změna pH
• nejcitlivější pH metr, ucítí rozdíl 1 H

Question 11

Sekvenování - Metoda nanopore

Answer 11

• čtený templát (nevzniká nové vlákno)
• speciální membrána s nanopóry velkými pro průchod DNA
• nahoře zachycen motorový protein -> posouvá DNA do póru -> DNA skrze membránu
• v rámci póru se mění vlastnosti - detekce změny napětí na membráně
• detekce, který neukleotid právě prochází
• templát zacyklen -> opakování -> eliminace chyb
• není potřeba amplifikace DNA
• DNA jde směrem k (+)