Hlutapróf 3 Flashcards
(208 cards)
1
Q
hvað eru mörg gen sem tjá fyrir próteinum?
A
Rúmlega 20.000 gen
2
Q
hversu mörg basapör eru í erfðamengi mannsins
A
3,200,000,000
3
Q
hvað fellst í DNA klónun og afhverju er hún notuð?
A
DNA klónun felur í sér að fjölga DNA sameindum og einangra tiltekin DNA svæði
t.d. ákveðin gen
þetta er gert til þess að rannsaka ákveðin svæði erfðamengisins sérstaklega og í meira magni
4
Q
til hvers eru skerðiensím notuð?
A
til að klóna og einangra DNA
5
Q
hvað gerir skerðiensím
A
þau klippa DNA sameindir á sérstökum stöðum sem þau þekkja
6
Q
til hvers voru skerðiensím þróðuð?
A
Þróuðust líklega sem vörn gegn framandi erfðaefni (veiru DNA)
7
Q
hvernig vernda bakeríur eigið erfðaefni gegn skerðiensímum?
A
Bakteríur framleiða samsvarandi methylasa sem bæta methyl hóp á ákveðna basa (C og A) í erfðamengi sínu, sem gerir DNA-ið ónæmt fyrir skerðiensímunum. Þannig klippa skerðiensímin einungis erfðaefni annarra lífvera
8
Q
eftir hverju heita skerðiensím?
A
Heita eftir lífveru sem ensímin fundust í og í hvaða röð þau fundust
9
Q
af hverju ræðst tíðni skerðinga
A
Tíðni skerðingar ræðst aðallega af lengd skerðisets
dæmi:
4 basa skerðiröð: 4^4 eða sker í kringum 1 af hverjum 256 bösum
6 basa skerðiröð: 4^6 eða sker í kringum 1 af hverjum 4096 bösum
8 basa skerðiröð: 4^8 eða sker í kringum 1 af hverjum 65536 bösum
10
Q
hvað þýðir að DNA raðir eru samhverfar og afhverju eru skerðiensím mikilvæg í samhverjum DNA
A
Samhverfa í DNA vísar til þess þegar raðirnar á báðum strengjum eru eins þegar lesið er í 5’ til 3’ stefnu á hvorum streng fyrir sig. Í dæminu á myndinni er röðin „GAATTC“ á öðrum strengnum og „CTTAAG“ á hinum. Lesið frá 5’ til 3’ á báðum strengjum eru þessar raðir eins
.
Slíkar samhverfur eru mikilvægar því skerðiensím klippa oft við þessar sérstöku raðir.
11
Q
segðu frá skerðiensíminu TaQl
A
það klippir við tiltekna 4 basaröð (TCGA) og myndar sticky-enda
Þetta þýðir að eftir klippingu sitja stuttar einþátta raðir út úr DNA endunum, sem geta tengst öðrum DNA sameindum með samsvarandi endum
12
Q
hvað eru sticky ends
A
stuttar einþátta raðir út úr DNA endunum, sem geta tengst öðrum DNA sameindum með samsvarandi endum eftir klippingu
13
Q
segðu frá skerðiensíminu Haelli
A
það klippir líka DNA en myndar blunt ends, þar sem báðir endanir eru jafnir og engar einþátta raðir standa út
14
Q
hvað eru Blunt ends
A
þar sem bæði endarnir eru jafnir og engar einþátta raðir standa út eftir klippingu. blunt ends eru minna hrifnir af því að tengjast öðrum DNA sameindum, en þeir eru samt gagnlegir í sumum rannsóknum þar sem stöðugari tengingar eru þörf.
15
Q
Blunt ends klippa Beint upp en sticky ends klippir til hliðar
A
16
Q
hvernig er hægt að nota skerðiensím?
A
þau eru notuð til að búa til skerðikort sem geta greint breytingar í erfðaefni eins og úrfellinga og einbasa breytileika sem breyta skerðiseti og þá hvernig ensímin klippa DNA.
einnig eru skerðikort notuð í þróunarfræðilegum rannsóknum
- t.d. til að bera saman mtDNA á milli tegunda og innan tegunda, sem getur hjálpað til við að skilja erfðafræðilega þróun og skyldleika einstaklinga og tegunda
einnig notuð í klónun
17
Q
hvaða tvær aðferðir eru notaðar í mörgnun á DNA
A
in vivo
- innlimun í genaferjur (vector) sem fjölga sér í viðkomandi frumu. skerðinesím notuð in vivo
In vitro
- Keðjufjölföldun (Polymerase Chain Reaction - PCR)
18
Q
hvernig eru skerðiensím notuð í klónun?
A
DNA frá mismunandi lífverum er eins og því er hægt að skeyta því saman ef það er klippt með sama skerðiensími
það er hægt að nota DNA ligasa til að styrkja tengingu á milli nýju basaparana
19
Q
hvað eru plasmíð/vektorar/genaferjur og hvernig eru þau notuð í líffræðilegum rannsóknum?
A
Plasmíð/vektorar/genaferju eru hringlaga DNA sameindir sem geta eftirmyndast sjálfstætt innan hýsilfrumna, eins og baktería.
Þau eru oft notuð sem genaferrjur í erfðatækni til að flytja inn DNA í frumur þar sem það er fjölfaldað og rannsakað
20
Q
hver er tilgagnur plasmíða/vektora/genaferja í erfðatækni?
A
Genaferjur eru því verkfæri til að flytja DNA sameindir inn í frumur þar sem það er magnað upp/fjölfaldað
21
Q
hvað þurfa plasmíð/vektorar/genaferjur að hafa?
A
- Upphaf eftirmyndunar (afþví þau verða að geta fjölgað sér inn í bakteríuni)
- Valmerki (verðum að geta séð hvaða frumur taka upp plasmíðið)
mikilvægt til að geta útrýmt frumum sem tóku ekki upp plasmíðið - Skerðiset (það er klónað inn á plasmíðið fjölskerðiset)
22
Q
hvað eru góðir kostir fyrir plasmíð að hafa?
A
- Helst lítil um 3000 basapör
- helst mörg Skerðiset
- Valmerki (Sýklalyfja ónæmi)
- Replicon (upphaf eftirmyndunar
og tengdar DNA stjórnraðir)
23
Q
hvernig er athugað innskotsröðun margra klóna?
A
Raðgreining
Kortlagning með skerðiensímum
Sértækir þreifarar
24
Q
hvað er átt við með klónnun eða þyrpingu?
A
Allar bakteríur í þyrpingu eru afkomendur einnar bakteríu sem tók
upp eitt plasmíð
Allar plasmíð sameindirnar eru því nákvæmlega eins (klónun,
einrækt)
25
hvernig eru bakteríur valdar sem hafa tekið upp plasmíð?
Til að velja bakteríur sem hafa tekið upp plasmíðið er notað valæti með sýklalyfjum eins og tetracýklíni, ampicillíni eða chloramphenikoli. Plasmíðin innihalda ónæmisgen fyrir þessi lyf, svo aðeins bakteríur sem hafa tekið upp plasmíð lifa af í valætinu.
26
hvað er genasafn?
það er safn DNA búta úr einstaklingi eða lífveru sem inniheldur allt erfðamengið
27
hvað er cDNA sameind
er afrit af mRNA sameindum
28
hvernig er hægt að leita af tilteknum DNA bútum í genasafni?
notað raðgreiningu til að finna tilteknar raðir innan safnsins
29
hvernig virkar Human genomic library (dæmi)
1. við byrjum með DNA úr manneskju
2. DNA er klippt í marga smáa búta með skerðiensímum, allar bútarnir hafa sama enda
3. DNA bútum er komið fyrir í plasmíðum og komið þeim fyrir í bakteríum
4. þá erum við komin með genasafn af erfðamengi mannsins
30
hvernig myndum við cDNA safn?
1. mRNA er einangrað úr frumu
2. notum oligo-dT primer þannig að T basaparast við A
3. notum víxlrit sem notar upplýsingarnar frá mRNA til að búa til DNA sem kallast þá cDNA
4. losum okkur við upprunalegu mRNA sameindina með DNA pólýmerasa sem býr til hinn DNA þáttin
5. þá erum við komin með tvo einþátta DNA sameindir sem verður að tvíþátta DNA sameind
31
cDNA hefur ENGAR innraðir
32
hver er munurinná cDNA og genomic DNA/erfðameni DNA
cDNA
- þá er búið að splæsa út innröðunum og mRNA myndast
- notum vixlritun til að afrita mRNA yfir í cDNA
- inniheldur aðeins virk gen
genomic DNA
- allt erfðamengið er undir, innraðir á allt
- klippt með skeriensímum
- innröðun
33
hver er munurinn á tjáninga plasmíði og genaferju
þá erum við með promoter sem er sterkara stýrisvæði sem fer þá að tjá genið
getum gert það sama og ef við værum með genaferju, opnum beint downstream á prómoter og bætum inn bútnum við viljum tjá
síðan er það sett inn í frumur og RNA polymerasa bakteríunar fer að tjá þetta tiltekna gen
34
hvers vegna er kostur að nota cDNA söfn
af því að bakteríur geta ekki splæst
35
hvað er Dideoxy (DNA) raðgreining hvað getum við raðgreint mörg basapör með hanni?
hefðbunda raðgreiningin
600-750 bp
36
hvað getum við raðgreint með DNA raðgreiningu (sanger)
getum raðgreint einþátta og tvíþátta DNA
37
hvað þarf í DNA raðgreiningum (sanger)
DNA polymerasa
vísir (primer)
38
á hverju byggist DNA raðgreining?
byggist á dideoxyribonucleoside triphosphat
við þurfum að hafa dideoxyribonucleoside triphosphat til þess að stoppa röðunina
það er engin OH hópur á núkleótið en það væri einn OH ef þetta væri DNA
er kölluð Chain terminators – geta ekki lengt nýmyndaðan streng (ekki hægt að lengja meira)
39
hvernig var notað DNA raðgreiningu áður fyrr og hvernig er það gert núna
Áður fyrr voru einfaldlega sett af stað 4 mismunandi hvörf, eitt fyrir hvert núkleótíð.
t.d. að þá er notað +ddCTP sem stoppar þá á C-basa en þarf ekki endilega að vera fyrsti C-basin, getur verið mismunandi
síðan var rafdregið á geli.
Nú eru yfirleitt notast við flúrmerkt ddNTP og PCR . keyrt í geli í hárpíplum.
40
það er hægt að ákvaðra Amínósýru röð prótein meðððð?
DNA raðgreiningu :)
41
segðu frá þriðju kynslóðar raðgreiningum
þetta eru 4 skref
1. skrefið - byrjum á að gera safn
- erum með genomic DNA sem er fragmentað sem er krippt upp í litla búta og það eru ákveðnir adapters sett á enda bútana sem er þá það safn sem við ætlum að nota
2. skrefið - magna upp bútana
- notum cluster amplifacation
3. skrefið - raðgreining sjálf
- þá er það þannig að það merkin eru mismunandi fluor lituð
- byggist á því nýmyndun raðgreininga
- flæðir yfir núkleótíð og þá sér maður hvað er sett inn á hverjum stað.
- tekin mynd í hvert sinn sem það er látið flæða yfir
4. skrefið - data analysis
- þá er farið yfir gögnin og getum borið þau saman við önnur gögn og fundið mismuni
42
á hverju byggir Hýbrídísering/ þáttapörun
Byggir á að aðskilja DNA og leyfa síðan að parast aftur
Ef annar þátturinn er merktur getum við séð hvar geislamerkið er staðsett í erfðamenginu
43
á hvaða hátt er notað Hýbrídísering/ þáttapörun
Southern, þá finnum við það á DNA-inu
Northern, þá finnum við það á RNA-inu
In situ hybridization á vef og litningum, hægt að sjá þá nákvæmlega hvar þessi bútur er
44
hvað eru þreifarar (probes)
Stutt ssDNA sem hefur verið merkt t.d. með geislavirkri samsætu eða biotín
Röð sem er andstæðan við DNA röðina sem verið er að rannsaka (target DNA)
þreifarar blandast við DNA tagetið
Þreifarar notaðir í skimunum
45
segðu frá Allele-specific oligonucleotide þreifurum
Greinir stökkbreytingu í globin
gen
ef að sjúklingur er með stökkbreytingu:
homozygous er stökkbreyting á báðum samsætium en heterozygous er stökkbreyting á einni samsætu
þannig að ef að sjúklingur er með stökkbreytingu að þá hefur DNA þeirra röð sem er andstæðan við þreifaran (þannig að það passar saman)
ef heilbreigður verður engin pasapörun
46
hvað er Southern blotting
við einangrum DNA og klippum það síðan með skerðiensímum sem er síðan rafdregið í geli
í geli er DNAið afmyndað og blottað (flutt yfir á) á nitrocellulosa himnu
síðan er hægt að nota þreifara til að bindast réttu DNAi á himnunni
47
hvað er notað Southern blotting í
nota til greininga á stökkbreytingum
(úrfellingar og innskot) og punktbreytingum sem
valda því að skerðiset tapast eða ný myndast
48
hvað er skerðibútagreining notuð í
greina breytileika í erfðamenginu sem getur stafað af mismunandi stökkbreytingum eða polymorphismum
49
hver er munurinn á stökkbreytingu og polymorphisma?
Stökkbreytingar eru sjaldgæfar breytingar á DNA röð sem geta verið skaðlegar og tengjast oft sjúkdómum, en polymorphisminn er breytileiki sem er ekki skaðlegur, hefur engin sjáanleg áhrif á svipgerð
polymorphismi kemur oftast fram utan gena eða í innraða, þar sem hann hefur ekki áhrif á tjáningu próteina og er því ekki skaðlegur.
50
hvernig breytileiki getur verið á polymorphisma?
Breytileikinn getur verið tvenns
konar
1. 90% eru basabreytingar, sem kallast snips (Single-nucleotide
polymorphisms)
2. Endurteknar raðir þar sem fjöldi endurtekninga er mjög breytilegur milli einstaklinga.
Hægt að nota til þess að greina á
milli einstaklinga
þetta kallast VNTR (Variable
number of tandem repeats)
51
það er hægt að nota Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) í Réttarmeinafræði
sérstaklega í erfðafræðilegri fingraförun og auðkenningu einstaklinga.
52
VNTR er hægt að nota í fósturskoðun, sérstaklega í tengslum við rannsóknir á fjölskyldutengslum, svo sem feðrunarpróf, og til að greina erfðafræðilega sjúkdóma eða stökkbreytingar sem tengjast VNTR-svæðum. Þessi notkun er þó nokkuð sérhæfð og háð takmörkunum.
53
hvernig eru gerðar fósturgreiningar
ómskoðun
hægt að skoða frumur úr legvatni eða fylhjuvef til að sko litninga
hægt er að greina DNA út frá:
- hvítum blóðfrumum
- legvatni
- æðabelgskögur
54
hvað þurfum við til að framkvæma PCR
mót
- er DNA sem DNA pólímerasi nýtir það til eftirmyndunar.
vísar
- Búnir til synthetiskt oftast um 20nt. að lengd
– Bindast við sitt hvort þáttinn og snúa á móti hvort
öðrum
– Afmarka það svæði sem magna á
þurfum einnig:
- dNTP
- buuffer
- PCR vél (hitablokk)
55
hvernig er prógram PCR sýna
* Bræðsla
* Binding vísa
* DNA eftirmyndun
* Endurtekið u.þ.b. 30-40 sinnum
56
hvernig er framkvæmt PCR
1. afmynda DNA og losa þættina í sundur
2. primera sem bindast við flanking svæði og mótstæðandi þátt á geninu
3. notað er DNA pólýmerasa myndar DNA þráð
4. þannig að við erum komin með nýjan tvíþátta DNA streng
57
hverjir eru kostir PCR
mjög næm aðgerð og hröð
mögnun getur verið milljónföld
58
í hvað er notað PCR
* Greining stökkbreytinga
* Raðgreining
* Rof með skerðiensímum
* Þreifarar
* Greining á kjarnsýrum sem eru í mjög litlu magni (t.d. veirusýkingar, réttarmeinafræði)
59
hvernig er hægt að nota PCR í klónun
in vitro þá er magnað upp DNA með PCR
in vivo þá mögnum við upp DNA með skerðiensímum og setjum inn í genaferju og hentum svo inn í bakteríur
60
hvað er Gibson assembly?
Nýleg aðferð til klónunar
þarf engin skerðiensím
61
hvað er In vitro mutagenesis?
leið til að nota PCR
mikið nota þegar við erum búin að klóna búta inn í genaferjur
hægt er að nota PCR til a ðstökkbreyta í genaferjunum sem er mikið notað
62
hvernig virkar In vitro mutagenesis?
það er sett stökkbreytinu inn í vísinn og síðan notum við PCR til að magna upp frá þeim vísi. allt sem kemur á eftir því er stökkbreytt
63
hvað er mælt í rautíma PCR og hvað notum við í henni
Mæling á magni PCR afurðar um leið og hún myndast
Flúrljómandi litir notaðir
– Litirnir innlimast eða eru í prímerum
64
hvað segir Ct gildi okkur?
Ct gildi segir okkur hversu mikið er af DNA í upphafi sýnisins
ef Ct-gildið er lágt, t.d. á bilinu 15-20, bendir það til hárrar veirumagns
65
hvað eru erfðabreytingar
þegar það er verið að koma einhverju inn í lífverur eða breyta einhverju í lífverum
66
hver er tilgangur erfðabreytinga(7)?
Auka þol plantna gegn sýkingum/skordýrum
Mynda þol gegn illgresiseyði
Auka vaxtarhraða/bæta eiginleika
Bæta nýtingu næringarefna
Framleiða prótein sem lyf
Framleiða efni
Rannsóknir
67
Segðu frá erfðabreyttum matvælum
aðalega eru það plöntur
á markaði eru soja, maís, repja, sykurrófur
Einnig bómull
einnig eru til erfðabreytt epli og papaya
68
segðu frá dýrum sem eru erfðabreytt
Erfðabreyttar geitur sem lyfjaverksmiðja
Erfðabreyttur lax kominn á markað í Kanada og USA
Erfðabreytingar í frumum og bakteríum notaðar mikið til
framleiðslu efna og lyfja
– Öll próteinlyf framleidd á þann hátt
69
í hvað er erfðatækni notuð (8)
Sjúkdómagreiningar, PCR til að magna upp DNA úr sýkingarvöldum og dtökkbreytingar
Framleiðsla próteina
Örsýnaraðsöfn
Genalækningar
Réttameinafræði
CRISPR/Cas9
Erfðabreyttar lífverur
Klónun (Dolly)
70
segðu frá klónuni Dolly (kindinni)
Dolly var klónuð 1996 og þetta verkaði þannig að það var tekin fruma úr júrunum úr einhverri kind
síðan eru frumunar ræktaðar og einangraðar
síðan var önnur kind egg-gjafi af annari tegund. kjarnin var fjarlægður úr því eggi
eggfrumunni er blanda við líkamsfrumuna
síðan er það notað í frjóvgun sem er síðan komið fyrir í staðgöngumóðir og fáum þá litla dolly
71
hvað eru örsýnaraðsöfnun.?
það eru plötur með mörgum örlitlum DNA eða RNA þreifurum sem eru ólígónúkleótíð.
Sýni getur verið erfðaefni, afrit af
mRNA (cDNA) eða annað flókið
sýni þar sem verið er að prófa
margar sameindir samtímis.
72
hvernig er örsýnaraðsöfnun notuð? og komdu með dæmi út frá bjóstakrabbameini
greining og meðfer á krabbameini
Meðferð á brjóstakrabbameini háð að einhverju leiti
estrogen viðtaka status krabbameinsfrumnanna
- Estrogen pos svara meðferð venjulega vel en estrogen neg mis vel
73
hvernig virkar CRISPR?
þetta er náttúruleg vörn hjá bakteríum
bakteríur pikka upp DNA (bakterían er sýkt og þannig nær hún að taka upp þetta DNA) bæði frá veirum og bakteríufögum. þau innlima hluta erfðamengisins í sitt eigið erfðamengi.
bakterían tjáir precrisp RNA (breytir DNA í RNA) og cas prótein
það sem gerist er að Cas9 próteinin bindist við mRNA raðir sem geta hýpredýserast við veiruna þegar hún kemur inn aftur (skiluru hvert við erum að fara)
Cas9 próteimið klippir síðan á veiru DNAið
þetta krefi er hluti á áunnuónæmi bakteríunar
74
hvernig getum við nýtt okkur CRISPR/Cas9
1. við getum búið til gRNA fyrir hvern eiginstasta stað í erfðamenginu sem við viljum
2. erum síðan mep Cas9 prótein sem klippir á DNAið
PAM-röðin skiptir líka máli
75
hvað gerir gRNA?
gRNA ákvarðar staðsetninguna í erfðamenginu, hvar við viljum fara inn og hvar við viljum vera við
76
hvað er gert við tvíþáttabrot? og hvaða leiðir eru notaðar?
það þarf að gera við það og það eru 2 megin leiðir
þessi aðferð er fyrir knock out:
1. NHEJ þar sem endanir eru límdir saman en gallin er þá að það þarf oft að snirta endana til
svona gerum við knock out. af því hún er villugjörn að þá er líklegt að það komi indel.
þessi aðferð hefur oft margfeldi af þremur og notum þá CRISPR/Cas9 kerfið til að leita af margfeldi af 1 eða 2
þessi aðferð er notuð fyrir editing
2. HDR, er 100% villifrí. hér hendum við inn stuttum DNA bút með þeim breytingum sem við viljum fá síðan sér frum það og þá notar fruman gjafa DNA eins og þetta væri systur litningurinn.
77
helsta vandamálið við CRISPR-Cas9 aðferð er sértækni (þarf svo mikla sértækni við aðferðina)
78
hvað eykur sértæknina á CRIPSR-Cas9 aðferðinni?
Double nickase
hefur verið þróuð til að auka nákvæmni og draga úr óæskilegum breytingum á DNA
79
hvernig getum við notað CRISPR aðgerðina á annan hátt heldur en venjulega (skiljiði hvert ég er að fara?)
það er hægt að hengja KRAB á gen og slökkvum þannig á tjáninguni
einnig hægt að nota einhver activator sem er þá nálægt geni sem er lítið tjáð og getum þá yfirtjáð það
80
hvað eru nýjustu CRIPSR-Cas9 aðferðinar?
base edit (getur valdið stökkbreytingum) og prime edit
81
hvernig er þessi CRISPR aðferð notuð í læknisfræði
Fjöldi fyrirtækja sem nota CRISPR til að
lagfæra erfðasjúkdóma
82
hvernig er greint eingena sjúkdóm?
með DNA rannsókn
83
hvað eru fjölþátta sjúkdómar?
sjúkdómar sem verða til vegna samspils flókina erfða og umhverfisáhrifa
84
dæmi um fjölþátta sjúkdóma?
hjartasjúkdómar og brjóstakrabbamein
85
hver er munurinn á stökkbreytingu og erfðabreytileika?
Stökkbreyting:
- Meinvaldandi
- Ný breyting (sem oft er ekki tilfellið)
Erfðabreytileiki
- Algengur
- Meinlaus
86
En hvað köllum við mun sem við finnum á erfðaefni sjúklings og viðmiðunarröð
Erfðabrigði eða bara breyting
87
eftir hverju eru erfðabirði flokkuð eftir áhrifum þeirra á heilsu?
Meinvaldandi
Líklega meinvaldandi
Óviss þýðing
Líklega meinlaus
Meinlaus
auk þess geta erfðabirði talist áhættuþættir
88
hvað er brottfall og hversu umfangsmikið getur það verið?
þegar ákveðnir basapör eða raðir tapast úr erfðaefninu.
umfangið getur verið frá einu basapari upp í marga megabasa á lengd
89
hvað er skipt á einstökum bösum og hvað eru mismuandi gerðir þess?
skitpi á einstökum bösum í táknröð sem getur valdið ýmsum breytingum
Þögul breyting - engin amínósýrubreyting, hafa langoftast enga þýðingu.
Skiptibreyting, mislestursbreyting “missense mutation” (80%). - ein amínósýra er breytt í aðra.
Markleysubreyting, stopbreyting, “nonsense mutation,” (20%).
Merking tákna breytist í stopkóða á þýðingu.
Afleiðing að mRNA brotnar niður eða þýðing stöðvast.
90
hvað er splæsstæði
þegar að rangt mRNA myndast
91
hverjar eru mögulegar afleiðingar erfðabrigða fyrir virkni próteina?
getur verið:
- Tap á virkni próteins
- ný tegund af virkni
- engin líffræðileg áhirf
92
hvað er brottfall sem nær yfir fleiri en eitt gen og hvaða afleiður getur það haft
Brottfall sem nær yfir fleiri en eitt gen getur leitt til heilkenna brottfalls samliggjandi gena, einnig kallað „contiguous gene deletion syndrome“. Eitt eða fleiri gen á brottfallssvæðinu geta verið skammtanæm, sem þýðir að virkni þeirra fer eftir nákvæmri magnstjórnun
93
hvernig hefur brottfall og tvöfaldanir áhrif á erfðamengi?
hefur áhrif á byggingu litninga og þannig tjáningu gena
94
hvernig tengjast þekkt erfðabrigði í ákveðnu geni sjúkdómum
Þekkt erfðabrigði í ákveðnu geni geta verið algeng orsök sjúkdóma. Með því að prófa hvort þessi erfðabrigði séu til staðar hjá einstaklingi er hægt að fá skýra niðurstöðu um hvort viðkomandi ber þessa breytingu eða ekki
95
hvað er erfðapróf?
aðferð til að athuga hvort að tiltekin erfðqbrigði séu til staðar hjá sjúklingi
Tiltölulega auðvelt og skýr niðurstaða já eða nei hvort einstaklingur beri breytingu
96
Hvað er ítarleg erfðabrigðaleit og hvernig er hún framkvæmd?
Ítarleg erfðabrigðaleit felst í raðgreiningu táknraðar ásamt prófunum fyrir brottfalli eða tvöföldun. Þetta er gert með talningu á fjölda DNA sameinda frá hverri útröð eða með aðferðinni MLPA, sem er notuð til að greina stærri breytingar í erfðaefni.
97
hvað er raðgreining táknraða og hvernig getur hún verið takmörkuð?
Raðgreining táknraðar er aðferð til að finna erfðabrigði innan táknröð gens. Hún getur þó verið takmörkuð þar sem hún getur misst af breytingum eins og stórum endurröðunum eða brottföllum.
98
hvað felur Raðgreining allrar táknaraðar gens í sér
Raðgreining allra táknraða gens felur í sér að greina erfðabrigði í basaröð gensins. Oft er notast við háafkasta raðgreiningu sem gerir kleift að fá nákvæmar upplýsingar um röð DNA sameindarinnar.
99
Hvernig er hægt að ákvarða eintakafjölda í erfðaefni með háafkasta raðgreiningu?
Eintakafjöldi í erfðaefni er ákvarðaður með því að telja fjölda raðgreindra DNA sameinda í sýni sem kemur frá viðkomandi svæðum eftir að háafkasta raðgreining hefur verið framkvæmd
100
Hvað er „Multiplex Ligation Probe Amplification” (MLPA) og hvernig er það notað?
Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA) er aðferð til að greina brottföll og tvöfaldanir í erfðaefni. Hún er afbrigði af PCR og byggir á magngreiningu með hárrörum (hárpípuragreiningu), og getur prófað allt að 50 svæði í einu.
101
hvað er Fjölgenarannsókn
rannsókn á mörgum genum samtímis til að finna erfðaorsök
102
Af hverju greina erfðabrigðaleitir ekki öll erfðabrigði?
Erfðabrigðaleitir hafa takmarkað næmi og ná ekki til alls gensins. Að auki geta þær ekki alltaf greint allar stökkbreytingar á því svæði sem er rannsakað, sem þýðir að sumar breytingar geta farið framhjá leitarferlinu.
103
hvað þýðir ef ekkert erfðabrigði finnst í fjölgenarannsókn og hvað getur það þýtt ef að erfaðbrigði finnst í DNA röð
Ef ekkert erfðabrigði finnst þá þarf það ekki að merkja að ekkert meinvaldandi erfðabrigði sé til staðar.
Ef erfðabrigði finnst í DNA röð er oft óvíst hvort það hafi áhrif á virkni gens.
104
Hvað þýðir „mislestursbreyting“ og hvernig er hún táknuð í nafnakerfi?
Mislestursbreyting vísar til þess þegar ein amínósýra í próteini breytist í aðra. Þetta er táknað í nafnakerfi HGVS, til dæmis sem „p.Arg117His“, þar sem arginín (Arg) á stað 117 hefur verið breytt í histidín (His).
105
Hvað merkir „markleysubreyting“ í nafnakerfinu og hvernig er hún táknuð?
Markleysubreyting (nonsense mutation) er þegar basabreyting í DNA veldur því að stöðvunarkóði myndast, sem leiðir til stutts eða ófullgerðs próteins. Þetta er táknað, til dæmis, sem „p.Gly542*“, þar sem * táknar stöðvunarkóða
- aminósýran glysin á stað 542 í próteinkeðjunni hefur verið breytt í stöðvunarkóða
106
Hver er munurinn á mislesturs- og markleysustökkbreytingu?
Mislestursbreyting veldur því að ein amínósýra í próteinkeðju breytist í aðra, sem getur breytt virkni próteinsins. Markleysubreyting (nonsense mutation) veldur því að stöðvunarkóði myndast, sem stöðvar próteinmyndun og veldur ófullgerðu eða gallaðri próteini.
107
hvernig er DNA örflögugreining notuð við rannsóknir á erfaefni?
NA örflögugreining er notuð til að leita að brottfalli, tvöföldun eða endurröðun á erfðaefni á mismunandi svæðum á litningum. Þetta hjálpar til við að greina stórar breytingar í erfðamenginu sem geta haft áhrif á heilsu.
Sumar örflögur greina einnig vöntun á arfblendni eins og sést ef litningapar er frá sama foreldri eða ef skyldileiki foreldra.
108
hverjir eru kostir þess að nota veirur við rannsóknir?
Einföld kerfi.
Vaxa og tímgast hratt.
Klóna sig sjálfar
109
hverjir eru eigineikar veira?
þær eru mjög litlar
Erfðaefni (DNA eða RNA) er pakkað í próteinhjúp sem
stundum hefur himnu utan um sig
* Eru ekki með fullkomin efnaskipti.
* Tímgast eingöngu inn í frumum.
.
110
hvað er klínískt exóm
Klínískt exóm er raðgreining á þekktum meingenum eða öllum exóminu (kóðandi hluti erfðaefnisins) til að greina meinvaldandi erfðabrigði. Þessi aðferð er mikilvæg til að greina erfðatengda sjúkdóma með því að rannsaka einungis þá hluta erfðaefnisins sem skipta máli fyrir próteinmyndun.
111
Hvað merkir erfðabrigðið COL6A1: c.1970-3C>A, og hvað þýðir það að það fylgi ekki sjúkdómi?
Erfðabrigðið COL6A1: c.1970-3C>A vísar til „þekkts“ meinvaldandi erfðabrigðis sem truflar splæsingu í COL6A1 geninu. Að það fylgi ekki sjúkdómi þýðir að þetta erfðabrigði veldur ekki sjúkdómseinkennum hjá einstaklingum sem bera það, jafnvel þó það hafi áhrif á splæsingu.
112
Hvaða sýni eru notuð fyrir sameindaerfðarannsóknir, fyrir utan heilblóð?
Heilblóð sem ekki hefur storknað
þerripappír.
Munnskol - Skaf.
Líkamsvökvar: EDTA ef plasma eða sérglös.
Vefjasýni og nýburaskimunarsýni.
Legkaka sem fóstursýni
113
Hvers vegna er EDTA notað í blóðsýni fyrir DNA greiningu?
EDTA er notað í blóðsýni til að koma í veg fyrir storknun með því að binda Mg²⁺ jónir, sem eru nauðsynlegar fyrir virkni núkleasa. Þetta tryggir að DNA í blóðsýninu haldist stöðugt og að sýnið sé nothæft í nokkra daga án kælingar
114
Hvers vegna þarf að vera varkár með upplýsingar úr erfðarannsóknum?
Erfðarannsóknir veita varanlega niðurstöðu þar sem arfgerð einstaklings breytist ekki. Þær varða innsta kjarna einstaklingsins og geta haft forspárgildi fyrir áhættu einstaklings og fjölskyldumeðlima, sem gerir það að verkum að upplýsingarnar eru mjög persónulegar og næmar.
115
Hvað þarf að útskýra fyrir viðkomandi áður en erfðarannsókn fer fram?
Það þarf að útskýra tilgang rannsóknarinnar og mögulegar niðurstöður. Þetta felur í sér hvort skýring á einkennum finnist, hvort erfðabrigði séu meinalaus, óþekkt eða meinvaldandi og hver áhrif niðurstöðunnar gætu verið fyrir sjúkling, aðra fjölskyldumeðlimi, og hvaða merkingu það hefði ef engin erfðaorsök finnst.
116
Hvað eru „aðrar niðurstöður“ og „tilfallandi niðurstöður“ í erfðarannsóknum?
„Aðrar niðurstöður“ (secondary findings) eru niðurstöður sem benda til erfðavandamála sem tengjast ekki beint ástæðunni fyrir rannsókninni.
„Tilfallandi niðurstöður“ (incidental findings) eru niðurstöður sem koma óvænt í ljós, sérstaklega ef rannsóknin er víðtæk og greinir fleiri erfðabrigði en upphaflega var leitað að.
Ef tilfallandi niðurstöður finnast, þarf að ákveða hvort einstaklingur vill fá upplýsingar um þær
117
hvernig eru veirur uppbyggðar
hafa núkleócapsíð utan um erfðaefni sitt
sumar hafa úthýði/hjúp
hafa matrix prótein sem bindir saman kapsíð og úthýði
Sum strúktúr prótein hafa einnig þýðingu við eftirmyndun og umritun erfðaefnis.
118
hvernig er felri veiru fjölgunar
Flutningur veiru inn í frumu.
Veiruögn losnar í sundur.
Eftirmyndun erfðaefnis.
Framleiðsla veirupróteina.
Myndun nýrra veiruagna.
Losun veiruagna frá frumu á tvennan hátt:
o Angaskot – “budding”.
o Rof – “lysis”.
119
hvernig prótein hafa veirur?
Prótein fyrir eftirmyndun erfðaefnis
Pökkunar- og byggingarprótein
Prótein sem breyta byggingu og starfsemi hýsils:
– Oftast til að hjálpa til við nýmyndun veiruagna.
120
Sýking leiðir til losunar veiruagna með angaskoti.
Fruma lifir en erfðabreyting hefur átt sér stað
þetta er um retróveirur
121
hvað er færslugen?
genið sem er flutt inn í frumu
Færslugenið er starfhæft gen með táknröð og viðeigandi stýriröðum fyrir tjáningu.
122
hvað eru genalækningar?
læknisfræðileg notkun genaflutnings til að rannsaka,
fyrirbyggja eða meðhöndla sjúkdóma
(genaviðbót)
123
hvernig er notað markfrumur í genalækningum?
það er haft áhrif á markfrumur með því að breyta erfðaefninu en kynfrumur eru undantekning (þær eru ekki notaðar) af því að breyting á kynfrumum myndi erfast til næstu kynslóða
124
hvaða aðferðir notum við í genalækningum?
genaferjur sem geta annaðhvor verið:
líffræðileg genaferja sem er þá eins og t.d. veira
eða
eðlisefanfræðileg genaferja eins og t.d. lípósóm
125
hvernig væri hin fullkomna genaferja fyrir genalækningar?
Skilvirk og auðveld í framleiðslu.
Örugg:
– Engin eituráhrif.
– Engin ónæmissvörun
Viðeigandi tjáning færslugens:
– Langvarandi.
– Stýranleg.
Frumusértækur genaflutningur.
flytur gen inn í bæði frumur sem eru að skipta sér og ekki (stofnfrumur og postmítótískar frumur).
Innlimast á sértækan hátt í litning
126
hvað þýðir að innlima færslugenið?
ef við gerum það þá erum við að setja bút af geni inn í erfðamengið og það verður varanlegt í frumuskiptingu
ef við sleppum því að þá tapast búturinn sem við viljum bæta inn
127
Hvernig eru veirur breyttar til að þær virki sem genaferjur í genalækningum?
veirur eru breyttar með erfðabreytingum þannig að þær geta ekki fjölgað sér, og öll gen sem geta valdið sjúkdómum eru fjarlægð. Í staðinn eru færslugen með viðeigandi stýriraðir sett inn til að koma nýju eða breyttu erfðaefni í markfrumurnar.
128
hvað eru Cis raðir?
„Cis raðir“ eru ákveðnar erfðaraðir sem þurfa að vera til staðar í erfðaefni veiruferjunnar til að hún geti starfað rétt.
128
Hvað eru „transgen“ og hvert er hlutverk þeirra í veiruferjum?
Transgen“ eru gen sem bæta við nýjum eiginleikum og þarf að tjá í frumum sem framleiða veiruferjuna. Þau sjá til þess að prótein veiruagna myndist, sem eru nauðsynleg til að veiruferjan geti virkað sem burðarefni fyrir erfðaefnið.
129
Hver er helsti ókostur adenóveiruferja í langvarandi meðferð?
Þar sem adenóveirur valda ekki varanlegum breytingum og erfðaefni þeirra tapast yfir tíma, þarf að gefa meðferðina endurtekið ef hún á að hafa langvarandi áhrif. Að auki geta adenóveirur valdið bólgusvari
129
Hvernig er erfðaefni víxlveira, eins og retróveira, notað í genalækningum?
Erfðaefni víxlveira, eins og retróveira, inniheldur gen (gag, pol og env) sem eru nauðsynleg fyrir veiruna til að fjölga sér og setja erfðaefni sitt inn í litninga hýsilfrumu. Í genalækningum eru þessi gen fjarlægð og í staðinn er sett inn færslugen með meðferðarerfðaefni, sem gerir veiruna að skilvirkri genaferju til að flytja nýtt erfðaefni inn í markfrumur.
130
Hvað er helsti munurinn á adenóveirum sem genaferjum samanborið við aðrar veiruferjur
Adenóveirur innlima ekki erfðaefni sitt í litninga markfrumunnar, sem þýðir að þær valda ekki varanlegum erfðabreytingum. Þetta gerir þær ólíkar öðrum veiruferjum, eins og retróveirum, sem geta innlimað erfðaefni sitt í frumuna og gert breytingarnar varanlegar
131
segðu frá Adenó - Associated Veirum
hagstæðar veirur á margan hátt
innlimun í litning
geta bara flutt 5 þúsund basaðör langt gen
132
Hvað eru dæmi um efnafræðilegar aðferðir við genaflutning?
Dæmi um efnafræðilegar aðferðir við genaflutning eru genabyssa, rafgötun og katjónísk lípíð.
133
Hvað þarf að gerast eftir að genaflutningsferju er sprautað í blóðrásina?
Ferjan þarf að bindast blóðfrumum og serum próteinum, komast yfir háræðarveggi, forðast einkjarna átfrumur, flytjast um interstitium og bindast frumuhimnum til að komast inn í markfrumurnar.
Flutningur gegnum umfrymi og inn í kjarna.
Varðveisla erfðaefnis og tjáning.
134
Lípsóm er amphipatísk efni hvað þýðir það?
það þýðir það að þau eru bæði
með lípíð hluta og vatnssækinn hóp
sem er dæmigert með jákvæða
hleðslu. Myndar complex með DNA.
135
segðu frá lípósómum sem genaflutning?
* Ekki innlimun.
* Safnast í endósómum.
* Valda litlum starfstruflunm.
.
136
hverjar eru takmarkanir við eðliserfnafræðilegar aðgerir
Skilgreind efni
Einföld
Ekki skilvirka
137
hverjar eru takmarkanir við veiruferjur
Flóknar
Skilvirkar
Aukaverkanir
138
segðu frá samsettri genaferju
þegar adenóveirur eru notaðar til að flytja DNA inn í markfrumu með hjálp próteina
139
nefndu 4 algengustu genaferjunar
andeoveira
retróveirur
plasmíð DNA
lentiveira
140
hvaða sjúkdómar eru mest rannsakaðir og meðhöndlaðir með genaferjum?
krabbamein, eingenasjúkdómar, hjarta- og æðasjúkdómar, smitsjúkdómar (HIV) og taugahrörnunarsjúkdómar
141
hvernig genalækningar eru framkvæmdar með blóðmyndandi stofnfrumum
erfðabreyttar stofnfrumur eru notaðar til að meðhöndla sjúkdóma
t.d.
- stofnfrumur eru teknar úr beinmerg sjúklings
- notað afheresis ferli þar sem stofnfrumur eru aðskildar frá blóðinu
- CD34 jákvæðar frumur er safnað saman og valdar til að nota í meðferð
- þær eru ræktaðar í tilraunaglasi
- þær eru erfðabreyttar með retróveiru genaferjum
- að lokum er gefið frumunar til sjúkling með innrensli í blóðrás þar sem þær ferðast til beinmergsins
142
Hvað er SCID-X1 og hvernig tengist það ónæmiskerfinu?
SCID-X1 (Severe Combined Immunodeficiency, X-linked) er erfðasjúkdómur sem veldur skorti á gamma c-viðtaka, sem er mikilvægur fyrir virkni ónæmiskerfisins. Þetta skortur leiðir til þess að ónæmiskerfið getur ekki myndað virkar ónæmisfrumur
143
Hver voru helstu aukaverkanirnar sem komu upp hjá sumum sjúklingum eftir genalækninguna við SCID-X1?
Hjá 5 af 20 sjúklingum komu fram hvítblæði eftir meðferðina. Þetta var tengt innlimun veiruferjunnar nálægt krabbameinsvaldandi genum, en hvítblæðið reyndist oft læknanlegt.
144
Hver er munurinn á genalækningum við SCID-X1 og fyrri ADA tilraunum?
Í genalækningunum við SCID-X1 var notuð betri genaferja og frumurækt samanborið við fyrri tilraunir við ADA (adenosine deaminase) skort. Þetta stuðlaði að betri og öruggari árangri.
145
Er genameðferðin við SCID-X1 varanleg?
Já, genameðferðin hefur oftast varanleg áhrif á genagallann, þar sem hún lagar eða bætir upp fyrir skortinn á gamma c-viðtakanum sem ónæmisfrumur þurfa
146
hvaða veiruferja er helst notuð í genalækningum fyrir augnbotn og hvers vegna?
Adenóveiru-associated veira (AAV) er helst notuð í genalækningum fyrir augnbotn. AAV-veirur eru sérstaklega hentugar vegna þess að þær valda ekki sjúkdómi og geta afhent meðferðargen beint til sjónfrumna án þess að valda skaða eða ónæmissvörun.
Markmiðið með genalækningum á augnbotn er að meðhöndla og jafnvel lækna sumar tegundir blindu
147
Hvernig er metýlgúanín metýltransferasi (MGMT) notaður í genalækningum við krabbameini?
Metýlgúanín metýltransferasi (MGMT) er ensím sem gerir frumur ónæmar fyrir ákveðnum bæli- eða eiturlyfjum. Í genalækningum er gen fyrir MGMT sett inn í krabbameinsfrumur með genaferju, sem gerir þær ónæmar fyrir eiturlyfjum. Síðan er gefið alkýlerandi lyf sem drepa frumur sem ekki hafa orðið erfðabreyttar, sem gerir það kleift að velja aðeins fyrir þær frumur sem hafa færslugenið.
148
hvað er CAR-T meðferð
Erfðabreyting á T frumum ónæmiskerfis til að ráðast á krabbameinsfrumum
mest notuð í illkyngja blóðsjúkdómum
149
Hvað gerir CAR-próteinið í meðferðinni?
CAR-próteinið er hannað til að bindast sérstökum yfirborðspróteinum á krabbameinsfrumum. Þegar CAR-próteinið bindst þessum próteinum ræsir það T frumurnar, sem leiðir til þess að T frumurnar ráðast á og drepa krabbameinsfrumurnar.
150
hvernig virkar CAR-T meðferðin
T frumur sjúklings eru erfðabreyttar til að tjá CAR próteinið sem hjálpar T frumunum að þekkja og ráðast á krabbameinsfrumur. Eftir erfðabreytinguna eru T frumurnar ræktaðar og sprautaðar aftur inn í sjúklinginn, þar sem þær geta bundist yfirborðspróteinum á krabbameinsfrumum og drepið þær.
151
hvert er markmiðið með lyfjameðferð með kjarnsýrum?
- Nota antisens ólígónúkleótíð til að binda viðkomandi RNA eða DNA.
- Trufla splæsingu, sem er ferlið þar sem mRNA er unnið til að mynda prótein.
- Framkvæma staðbundna DNA viðgerð til að leiðrétta eða bæta upp fyrir genagalla.
152
Hvað er dystrofín genið og hvernig tengist það vöðvasjúkdómum?
Dystrofín genið framleiðir prótein sem er nauðsynlegt fyrir vöðvafrumur. Stökkbreytingar í þessu geni geta valdið ýmsum vöðvasjúkdómum. Ef ekkert prótein er framleitt er sjúkdómurinn mjög alvarlegur, en ef smávægilegt prótein er framleitt getur sjúkdómurinn verið vægari.
153
hvað er exon skipping
Exon skipping er ferli þar sem ákveðnar útröðir í mRNA eru „skiptar út“ eða sleppt til að hindra stökkbreyttan hluta gensins í að vera lesinn.
154
Hvað er CRISPR/Cas9 kerfið og hvernig er það notað?
CRISPR/Cas9 er kerfi sem var upphaflega varnarkerfi í bakteríum gegn veiruárásum. Í erfðaefnislækningum er það notað til að stökkbreyta eða breyta DNA í ákveðnum genum. Kerfið nýtir guide RNA (gRNA) til að finna tiltekna DNA röð og Cas9 próteinið til að klippa DNA-ið á þeim stað, sem getur leitt til genaviðgerðar eða genabreytingar.
155
Hvað gerir Cas9 próteinið í CRISPR/Cas9 ferlinu?
Cas9 próteinið er ensím sem klippir bæði þætti DNA sameindarinnar á þeim stað þar sem gRNA hefur fundið samsvarandi röð
156
Hver er hlutverk guide RNA (gRNA) í CRISPR/Cas9 kerfinu?
Guide RNA (gRNA) finnur nákvæmlega samsvarandi röð í erfðamenginu og leiðir Cas9 próteinið að réttum stað í DNA-inu
157
við hvaða sjúkdóma hefur CRISPR/Cas9 verið notað til að erfðabreyta frumum?
CRISPR/Cas9 hefur verið notað til að erfðabreyta frumum til að meðhöndla sjúkdóma eins og sigðfrumublóðleysi og tilraunamúsum með lifrarsjúkdóminn týrósinemíu.
158
Hvað eru ríbozým og DNAzým og hvernig eru þau notuð?
Ríbozým og DNAzým eru ensím sem geta klippt mRNA á sértækan hátt
159
hvað er blast og hvað gerir það
afla sér upplýsingar um prótein með því að bera saman erfðamengi eða próteinraðir og finna eða samsvarandi raðir í gagnagrunum
160
hver er hugmyndafræðin á bakvið kerfislíffræði?
lífefni mynda líftenglanet sem hægt er að breyta yfir í reiknilíkön og með þeim er hægt að áætla birtingaform
161
til hvers eru reiknilíkön notuð?
auka skilning á líffræðilegum gögnum
við erfðatækni rannsóknir
við tilgátu gerð
auka skilning á samskiptum lífveira
auka skilning á samskiptum lífvera
162
hvað er hægt að skoða í tilraunadýrum
æxlanir mögulegar
unnt að skoða margar kynslóðir
unnt að skoða mikinn fjölda afkvæma á stuttum tíma
líffræðilega virkni gena/próteina
163
hver er helstu kostir tilraunalífvera
lítil
* stuttan æxlunartíma
* ódýr í rekstri
* unnt að stökkbreyta/erfðabreyta
* módel fyrir mannasjúkdóma
164
hvaða helstu tilraunadýru eru notuð
ávaxtaflugur
þráðormar
mýs
zebrafiskar
pufferfish
Sveppir
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombae
Plöntur
Arabidopsis thaliana
165
segðu frá þráðormum
litlir, einfaldir, ódýrir ormar sem lifa á E. coli
kynslóðatíminn einungis 3 dagar
genamengið frekar lítið = 19.099 gen
"hermaphrodite", mörg afkvæmi frá hverjum einstaklingi
959 frumur í fullorðnum einstaklingi, örlög hverrar frumu þekkt og nákvæmlega kortlögð
166
hvers vegna eru þráðormar góð tilraunadýr
unnt að erfðabreyta
- tilviljanakenndar stökkbreytingar
– transgenískar stökkbreytingar
– RNAi tilraunir
hitanæmar stökkbreytingar
Má frysta og geyma í fljótandi N2
Má nota til að skoða:
– þroskun, hegðun, öldrun, frumudauða, frumusamskipti, "lineage"-
ákvörðun osfrv
167
í hvaða lífveru fannst RNAi (inngrip) fyrst í
fannst fyrst í þráðormum
168
í hvað er RNAi notað í
til að greina hlutverk allra gena í frumum og lífverum
169
Hvernig getur RNAi komið í stað stökkbreytinga?
RNAi getur komið í stað stökkbreytinga með því að hindra eða „eyða“ virkni tiltekinna gena á sérvirkan hátt
169
Hvernig er RNAi notað til að greina hlutverk allra gena í frumum og lífverum?
RNAi er notað kerfisbundið til að þagga niður virkni allra gena með því að nota safn af siRNA sameindum sem eru sérstaklega hannaðar til að hindra hvert gen í mannslíkamanum
169
hvað einkennir ávaxtaflugur sem tilraunadýr
fjöldi stökkbreyttra afbrigða er til
hitanæmar stökkbreytingar
P stökklar - gera okkur kleift að erfðabreyta flugunum
Balancer litningar - einstakur fyrir fluguna, gerir okkur kleift að vinna með hana
169
hvað eru helstu kostirnir við ávaxtaflugur sem tilraunadýr
Litlar og viðráðanlegar
ódýrar í rekstri (eplasafi, ger, agar)
kynslóðatíminn stuttur (2 vikur)
mikill fjöldi afkvæma frá hverri æxlun
genamengi lítið (1/20 af genamengi mannsins)
– litningar auðsjáanlegir, 13.601 gen
169
á hvaða litningi er mest af erfðamengi ávaxtaflugu
litningi 2 og 3 (80%) - mest unnið með
X litningur hefur restina
Y hefur eiginilega ekki neitt-neitt
litningur 4 hefur bara örfá gen
170
hvað ákvarðar kyn ávaxtaflugna
y litningur ákvarðar ekki kyn heldur er það hlutfallið af outosomal X
ef tvö X þá er það kvenndýr
ef eitt X þá er það karldýr
171
hvað eru balancer litningar
tilbúnir litningar notaðir til rannsókna
172
hvaða eiginleika hafa balancer litningar
bera ríkjandi sjáanlegar stökkbreytingar
í arfhreinu ástandi er það banabreyting
- ef við sjáum stökkbreytinguna þá er hún arfblendin
- sjáum ekki stökkbreytingar í arfhreinum
Bera margar “inversions” - litningabreytinga þar sem ákveðinn hluti litnings snýst við, þannig að röð erfðaefnisins verður öfug miðað við upphaflega röðunina.
Það kemur í veg fyrir endurröðun
173
dæmi um balancer litningar
CyO (balancer f. litning 2, “Curly” vængur)
– TM3 (balancer f. litning 3, “Stubble” hár)
174
í hvað eru P-stökklar notað í
til að búa til erfðabreytar flugur
175
á hverju byggist P-elementa aðferðin
byggist í P-stökklum sem eru litlar DNA einingar sem geta stokkið úr einum stað yfir á annan
inn í P- stökklinum er transposasi
176
hvað er transposasi
ensím sem ber kennsl á DNA raðir og klippir þær af sitthvoru megin við enda stökkulsins og getur flutt það eitthvað annað
177
við getum stjórnað hvenær P-stökklar stökkvað en ekki hvert þeir stökkva
178
hvaða genaferjur voru búnar til fyrir flugur
helper genaferjan
genaferja með erfðabreytingum þá sem óskað er
179
segðu frá helper genaferju
Hefur P-element með transposasa án þess að hafa inverted repeat raðir sem þýðir að hann getur ekki sokkið
getur bara búið til transposasa
Ferjan getur ekki innlimast í erfðamengið
180
segðu frá genaferju með erfðabreytinu þá sem óskað er
hefur P-element með inverted repeat raðir en ekki transposasa
getur stokkið í erfðamenginu og fáum þá erfðabreytingu sem við viljum ef að transposasi er til staðar á þeim stað
181
hvernig má nota P-element
Ákveða áhrif yfirtjáningar gena
Skoða stýrisvæði (reporter gene assay)
“Gene traps”
Vefjasérhæfð tjáning gena
“Knockout” með homologous recombination
“Genome rescue“
182
hvaða stökkbreytingar í
- mönnum
- músum
- ávaxtaflugum
veldur augnleysi og á hvaða geni verður hún
menn: aniridia
mýs: Small-eye
Drosophila: eyeless
stökkbreytingin er alltaf á Pax6 geni
183
hvað eru helstu kostirnir við að nota zebrafiska sem tilraunadýra
Lítil hryggdýr - auðvelt að rækta
Fóstrin eru gagnsæ og hægt að fylgjast með þroskun utan móður
Ódýrari en mýs
Hægt að fá afkvæmi allt árið
Vaxa hratt
Kynslóðatíminn er rúmir tveir mánuðir
184
hvað eru helstu kostirnir við að nota mýs sem tilraunadýra
Skyldari manninum en flestar tilraunalífverur
Lítil spendýr sem auðvelt er að meðhöndla
Stuttur kynslóðatími (~9-10 vikur) - um 3 mánuðir
Eiga mörg afkvæmi (6-12 á ~4 vikna fresti)
Leyfa tímasetningu þungana
Unnt að erfðabreyta að vild næstum því
185
hvernig er erfðamengi músa
20 þúsund gen
2,5 milljörðum basapara
14% minna en erfðamengi mannsins
– Talið vera vegna úrfellinga
186
hvað eru helstu stofnar músa
Innræktaðir stofnar (inbred strains)
F1 hybrids
Congenic strains
Recombinant inbred strains
crispr aðferðin er líka hægt að nota
187
segðu frá innræktuðum músa stofnum
voru búnar til við endurteknar æxlanir systkina
Eftir 20 kynslóða æxlanir er 98,7%
erfðamengisins arfhreint (getur orðið banabreyting sem kemur í veg fyrir áframhaldandi æxlanir)
Eftir 40 æxlanir er 99,98% arfhreint
188
hvað eru til margir innræktaðir músa stofnar
465
189
hvað eru kostir við innræktaða músastofna
Lítill sem enginn erfðabreytileiki milli einstaklinga í innræktuðum stofni
- Niðurstöður alltaf sambærilegar hvar sem er í heiminum
Mikill breytileiki milli innræktaðra stofna
190
dæmi um innræktaða músastofna
C57BL/6 hefur verið viðhaldið í >150 kynslóðir
DBA elstur slíkra stofna
BALB/c er annað dæmi
191
hvað eru gallar við innræktaða músastofna
Fitness minna en í villigerð
Tilbúnar aðstæður (niðurstöður eiga bara við þennan stofn ekki neinn annan)
192
hvers vegna notum við F1 hybrids músastofna
til að komast fram hjá þessu fitness og tilbúnu aðstæðna vandamáli
193
segðu frá F1 hybrids músastofnum
Æxlum saman tveimur ólíkum innræktuðum stofnum og fáum F1
Allar F1 mýsnar eru eins, allar arfblendnar fyrir öll gen og meira fitness
194
erfðabreyttar mýs skiptast í tvennt:
transgenískar mýs og knockout mýs
195
hvað eru transgenískar mýs
mýs þar sem að við setjum eitthvað gen inn í erfðamengið, það fer inn á tilviljanakenndan hátt, í mörgum eintökum
Yfirleitt notað til að yfirtjá ákveðið gen (t.d. þekkt sjúkdómsgen úr mönnum) eða skoða stjórnsvæði gena
196
hvað eru knockout mýs
mýs þar sem að við setjum eitthvað gen inn í erfðamengið breytta genið fer á einn ákveðinn stað í erfðamenginu og aðeins í
einu eintaki.
Oftast er útbúin úrfelling eða innskot
Yfirleitt notað til að búa til stökkbreytingu í ákveðnu geni (t.d sjúkdómsgeni)
Notast við embryonic stem (ES) frumur, þ.e.
stofnfrumur úr fósturvísum
197
hvaða vandamál fylgja transgenískum músum
Fjöldi eintaka af transgeninu er breytilegur og ekki hægt að stjórna
198
Hvað getur gerst þegar innskot af transgeni er á mismunandi stöðum í erfðamenginu hjá trangenískum músum
Innskot á einstökum stöðum í erfðamenginu getur haft áhrif á tjáningu gensins og þess vegna þarf margar línur til að staðfesta áreiðanleg áhrif í tilraunum.
5-15% af línunum eru banabreytingar í arfhreinu ástandi
199
hvernig er ferlið við að búa til knockout mýs
hlusta á myndbandið hjá eiríki á uglu
byrjar á mínútu sirka 01.05.00
200
hvað er neo
gen sem veitir þol gegn fúkkalyfinu
neomycin
201
hvað er Tk= thymidine kinase
ensím sem frumur tjá
þær deyja ef að gancyclovir er í ætinu
202
hvaða praktísk vandamál við erfðabreytingar á músum
Hvert gen fyrir sig, aðeins ein breyting í einu í hverri mús
Mikil vinna
Óhagkvæmt
Dýrt
Oft sést engin svipgerð
Í öðrum tilfellum er um banabreytingu að ræða
