Immuno-essais Principes et applications

Question 1

Quels anticorps sont les plus utilisés dans les immunoessais?

Answer 1

Les IgG

Question 2

Qu’est-ce qu’un immunogène et haptogène?

Answer 2

Immunogène : Substance capable de déclencher la formation d’anticorps lorsqu’introduite chez un hôte.

Un haptène est un petit composé chimique capable, lorsque conjugué à un porteur immunogénique , de stimuler la synthèse d’anticorps spécifiques contre cet haptène. Il est donc capable de lier un anticorps, mais incapable de déclencher une réponse immune seul.

Question 3

Qu’est-ce que l’affinité et l’avidité?

Answer 3

■Affinité
Représente l’énergie d’interaction entre un seul anticorps et l’épitope correspondant sur l’antigène. L’affinité peut être modulée par des facteurs tels que le pH et la température.
■Avidité
L’avidité représente la somme globale des affinités de liaison individuelles de tous les sites d’un anticorps. L’avidité dépendra également de la valence et de l’organisation structurale de
l’anticorps et de l’antigène.
Exemple : un IgM a 10 sites de liaison aux antigènes par molécule alors qu’un IgG en a 2.

Question 4

Comment est formé un anticorps polyclonal vs monoclonal?

Answer 4

-Les IgG sont composés de deux chaînes légères et deux
chaînes lourdes.
-Chaque chaîne est elle même composée de 3 à 4 segments codés par des gènes différents (C, J, D et V).
-Pour chacun des 4 segments, il existe une variété de gènes. Pour le segment Variable (V), il existe plusieurs centaines de gènes
-Pendant le développement des cellules B, productrices d’anticorps, ces segments à l’exception du C, subissent des réarrangements et du splicing . Cela génère une très grande diversité combinatoire.
-Un clone de cellule B produit un anticorps spécifique.
-Ainsi, un antigène peut générer une multitude d’anticorps avec des spécificités différentes : c’est ce qu’on appelle un anticorps polyclonal.
-Si on sélectionne et amplifie un clone spécifique, on obtiendra alors un anticorps monoclonal.

Question 5

QU’est-ce que des essais de précipitation?

Answer 5

Les anticorps monoclonaux interagissent avec un seul épitope sur chaque antigène.
En conséquence : la majorité des anticorps monoclonaux ne peuvent pas cross linker et précipiter des antigènes macromoléculaires.
Ils sont donc peu répandus dans les méthodes dites «précipitine » classiques.

Question 6

Nomme moi les forces entrent en jeux pour la liaison d’un anticorps à un antigène. Est-ce qu’ils agissent de façon coopérative?

Answer 6

–Liaisons de Van der Waals
–Interactions hydrophobes
–Liaisons ioniques
–Ponts Hydrogène

Ces forces agissent de façon coopérative

Question 7

Qu’est-ce que les liaisons de Van der Waals?

Answer 7

Ces liaisons sont basées sur l’attraction entre les atomes lorsque ceux ci sont à proximité les uns des autres :
–Liaisons électrostatiques
–Molécules polarisables non chargées : le nuage électronique se déforme de façon transitoire pour former une séparation de charges (dipôle)
–Forces de courte distance (4 à 6 nm)
–Forces plus importantes plus la molécule est grosse
–La polarisabilité varie de façon inversement proportionnelle à la température

Question 8

Qu’est-ce que des liaisons hydrophobes?

Answer 8

■Association de groupements non polaires est énergétiquement favorable dans solution aqueuse ou polaire.
■Au sein des protéines : liens hydrophobes participent au repliement structurel par enfouissement à l’intérieur de la molécule vs groupements polaires plus en surface.
■Il se forme un «noyau » hydrophobe au centre de la protéine dans lequel les chaînes latérales hydrophobes peuvent interagir faiblement.
■Ce type de force peut stabiliser la liaison anticorps antigène ou l’augmenter mais n’est pas la force majeure de liaison

Question 9

Qu’est-ce que des liaisons ioniques?

Answer 9

Attraction entre groupements chargés sur l’antigène et l’anticorps
–Principalement entre ammonium (NH4 ++) et groupement carboxylate (COO
–Ce type de liaison est plus forte dans un milieu avec une faible constante diélectrique (moins d’interactions avec solvant ou autres solutés)
–Milieu avec constante diélectrique moyennement élevée peut représenter une inhibition importante de liaison entre un anticorps et son antigène
–Changements de pH, température et force ionique devraient donc affecter la liaison anticorps antigène.
–Dans les faits, entre pH 6.0-8.0, température 25 35 degrés Celsius ces variables ont un effet minimal sur la formation de complexes immuns

Question 10

Nomme moi des facteurs influençant la force de liaison
entre un antigène et un anticorps

Answer 10

–Les effets de force ionique
–L’espèce ionique
–L’effet polymère

Question 11

Qu’est-ce que la force ionique?

Answer 11

Les sels cationiques produisent une inhibition d’un anticorps avec un haptène cationique. Il en est de même pour les sels ioniques sur des interactions avec un haptène anionique.
Plus l’espèce a un grand rayon ionique, plus l’inhibition est grande.
Concentration dépendant : plus c’est concentré, moins les complexes immuns se forment rapidement.

Question 12

Parle moi de l’exclusion stérique

Answer 12

La présence d’un polymère en solution avec une protéine réduira la solubilité de la protéine. Cette solubilité est inversement proportionnelle à la taille du polymère.
Si VT = Volume total de solvant
V’ = Volume occupé par protéines
Ve = Volume exclu (non accessible aux protéines)

VT = V’ + V E

Question 13

Quels sont les caractéristiques de l’effet polymère?

Answer 13

–Composition des complexes immuns pas affectée par la présence des polymères
–Pas de complexe formé entre polymère et antigène, anticorps, ou complexe immun
–Effet polymère dépend du poids moléculaire à la fois de l’antigène et du polymère
–L’utilisation d’un polymère peut augmenter la précipitation de complexes immuns utilisant des anticorps à faible avidité
–Accélère la formation des complexes immuns, surtout au début de la réaction
–Caractéristiques visées du polymère : haut poids moléculaire, linéaire, solubilité élevée en solution aqueuse
–Plus fréquemment utilisé : PEG (polyéthylène glycol)

Question 14

Quels sont les mécanismes de la réaction antigène-anticorps?

Answer 14

–Réaction en trois phases :
■Réaction initiale (Phase 1) d’un antigène avec un anticorps
Très rapide en comparaison aux autres phases
■Croissance des complexes immuns (Phase 2)
■Précipitation du complexe (Phase 3)
Après atteinte de la taille critique

C’est un processus dynamique!! Ne jamais voir cette réaction comme statique

Question 15

Qu’est-ce que des épitopes?

Answer 15

-Les anticorps peuvent reconnaître une structure particulière : on nomme ces épitopes : épitopes conformationnels.
-La protéine dénaturée ne serait alors pas reconnue par l’anticorps
-Les anticorps peuvent reconnaître une séquence d’acides aminés spécifique : celle ci peut être reconnue sous forme dénaturée et sous forme native, mais seulement si l’épitope est accessible au sein de la structure protéique repliée
-Certains épitopes peuvent également être « créés » suite à la protéolyse par exemple.

Question 16

Qu’est-ce que le titre d’un anticorps?

Answer 16

Le titre d’un anticorps correspond à la dilution maximale d’un antisérum qui produit une réaction positive.
Le marqueur de réaction positive peut différer selon le système :
-Essais d’immunoprécipitation : dilution maximale produisant un précipité
-Absorption et dispersion de lumière : zone d’équivalence
-Marqueurs : fixation de 50% des antigènes marqués

Question 17

Qu’est-ce que la spécificité d’un anticorps. Est-ce possible qu’un anticorps soit spécifique à une molécule? Quel type d’anticorps possède la meilleure spécificité?

Answer 17

■Lorsqu’on parle de spécificité, on réfère généralement à la capacité de l’anticorps de reconnaître uniquement la substance d’intérêt
■Toutefois, il est faux de penser qu’il existe des anticorps entièrement spécifiques à une seule molécule. Les séquences ou structures reconnues sont généralement présentes de façon identique ou assez similaire pour susciter une liaison sur d’autres molécules.
■Les anticorps monoclonaux sont généralement considérés plus spécifiques puisqu’on a une seule population d’anticorps et qu’on limite donc le nombre de réactions croisées.
■Exemple classique de réactions croisées : immunoessais de détection des drogues de rue.

Question 18

Qu’est-ce que la sensibilité analytique vs clinique d’un anticorps?

Answer 18

■Sensibilité analytique
Limite de détection analytique
Déterminé principalement par l’affinité de l’anticorps (essais compétitifs) et la limite de détection du marqueur utilisé (essais non compétitifs)
Sensibilité fonctionnelle : plus basse concentration qui peut être mesurée de façon fiable
■Sensibilité clinique
Capacité d’une méthode analytique de donner un résultat positif lorsque la condition est présente (maladie..)

Question 19

Qu’est-ce qu’un complexe immun?

Answer 19

Complexe formé entre un anticorps et un antigène soluble et qui formera un aggrégat
Ces complexes se forment in vivo dans les tissus et constituent un
des mécanismes d action des anticorps pour neutraliser les antigènes
Les complexes immuns sont capables d activer et fixer le complément

Question 20

Peux-tu me schématiser une réaction de type precipitin?

Answer 20

Question 21

Facteurs influençant les immunoessais pour le dosage de protéines spécifiques

Answer 21

■Propriétés de l’anticorps : type, réactivité, affinité, avidité, source, pureté, reconnaissance de l’épitope conformationnel vs linéaire, stabilité, variations interlots, temps de réaction…
■Propriétés de l’antigène : intégrité, stabilité, pureté
■Réactions croisées
■Méthode de mesure
■Interférences : reliées à l’échantillon, effet crochet, anticorps interférents

Question 22

Nomme moi les 2 types de méthodes utilisant le principe des precipitins?

Answer 22

■Méthodesqualitatives :
–Principalement en milieugelifié
–Diffusion passive sur gel ( Ouchterlony
–Immunoélectrophorèse
–Western blot et dot blot
■Méthodes quantitatives :
–Principalement en milieu liquide :
–Néphélométrie
–Turbidimétrie
–Et en milieu gelifié : immunodiffusion radiale et fusées de Laurell

Question 23

Qu’est-ce que la Méthode d’Ouchterlony

Answer 23

■Méthode sur gel (agar ou agarose)
■Double diffusion
■Deux points d’application pour les réactifs dans des puits
■Chaque réactif va diffuser selon sa concentration

■La rencontre des fronts de migration des deux réactifs permet la formation de complexes immuns
■La nature du complexe dépend des concentrations d’antigène et d’anticorps dans chacune des zones du gel en zone d’équivalence il y aura précipitation qui sera visible à l’oeil nu
■Processus dynamique : la ligne de précipitation peut bouger dans le temps selon l’évolution des concentrations
■Temps requis long 48-72 h

Question 24

Comment est interprété la méthode d’Ouchterlony?

Answer 24

■Méthode qui permet de savoir si 2 antigènes sont identiques, cross réactifs ou non identiques
■A) Lorsque le même antigène est dans des puits adjacents : réaction d’identité. Fusion des lignes de précipitation
■B) Si les deux antigènes sont différents = lignes croisées
■C) Si les eux antigènes sont similaires mais non identiques, on observe une réaction d’identité partielle
■Limites : si absence de précipitation, peut signifier absence de l’antigène, trop faible concentration pour être détectée, anticorps non précipitant ou encore un excès d’antigène.

Question 25

Comment schématiser une immunoélectrophorèse?

Answer 25

Question 26

Qu'est-ce que l'immunodiffusion radiale?

Answer 26

■Variante quantitative de la diffusion passive sur gel ■L’anticorps est uniformément réparti dans le gel ■L’antigène est mis dans un puits et diffuse passivement dans le gel ■La précipitation a lieu jusqu’à l’endroit où l’anticorps devient en excès. ■Quand précipite : diminue la quantité d’antigène disponible pour migrer plus loin. Processus dynamique : Ag continue à sortir du puits et peut réverser la précipitation. ■L’anneau de précipitation est mesuré et comparé à des concentrations connues. Durée : 72h ■Utilisé pour la détection d’IgD et IgE par exemple (tests peu fréquents, précision faible)

Question 27

Lors d'une immunodiffusion radiale, si on a un résultat négatif, à quoi faut penser?

Answer 27

■Si négatif : toujours garder en tête possibilité d’excès d’antigène (domaine de mesure)

Question 28

Qu'est-ce que les fusées de Laurell?

Answer 28

■Même principe qu’immunodiffusion radiale mais avec migration sur gel pour accélérer le processus ■L’anticorps est uniformément distribué dans le gel. ■Concentrations connues d’antigène utilisées comme calibrateurs . Hauteur migration détermine concentration présente.

Question 29

Qu'est-ce qu'une réaction d'agglutination?

Answer 29

■Utilisé pour le dosage qualitatif et quantitatif d’antigènes et d’anticorps. ■L’agglutination forme des aggrégats de particules visibles à l’oeil ■L’utilisation d’antigène sur des particules (cellules, bactéries, virus, billes de latex..) Forme de plus gros complexes que les complexes immuns ■Réactions à point final ■Prend des conditions strictes pour obtenir une réaction reproductible, stable et complète ■Utilisation IgM réactif idéal (grande taille, multivalece IgG cependant souvent utilisés

Question 30

Qu'est-ce qu'une hémaglutination? Comment est-ce interprété?

Answer 30

■Agglutination utilisant un antigène localisé sur un érythrocyte ■Technique courante en hématologie et banque de sang ■Notamment : groupes sanguins et détection d’antigènes spécifiques à la surface des globules rouges (anti A, anti C , anti Kell) 4+ = Bouchon globulaire restant intact, pas d'hématies libres, surnageant clair 3+ = Quelques choses agglutinats, surnageant clair 2+ = plusieurs petits agglutinats, nombreuses hématies libres, surnageant légèrement trouble 1+ = Nombreux petits agglutinats visibles seulement au microscope, surnageant trouble 0 = Pas d'agglutination

Question 31

Nomme moi des immunoessais qui utilisent des marquages?

Answer 31

■Radioimmunoessais ■Immunoessais enzymatiques ■Fluoroimmunoessais ■Immunoessais chemiluminescents ■Immunoessais électrochemiluminescents

Question 32

Quelle est le marqueur avec la plus grande limite de détection? On le retrouve dans qu'elle méthode?

Answer 32

Horseradish peroxidase Utilisé en photométrie

Question 33

Qu'est-ce que des radioimmunoessais? Nomme moi des avantages et désavantages

Answer 33

■Utilisation d’isotopes radioactifs pour quantifier la réaction antigène anticorps ■Épitope fréquemment utilisé en clinique : Iode 125 (rayons gamma, demi vie 60 jours) ■Essais de moins en moins disponibles à cause du principe ALARA et la discontinuation des trousses par les compagnies ■Avantage : moins coûteux, marquage qui n’affecte pas les propriétés de la molécule marquée, meilleure sensibilité analytique que la néphélométrie, peu d’effet d’interférence des indices sériques sur le signal ■Désavantages : Techniques manuelles, requiert gestion des déchets, permis, documentation et la formation du personnel, méthode en phase hétérogène, surveillance étroite et validation des courbes d’étalonnage, réactifs instables (demi vie), nécessite compteur gamma

Question 34

Qu'elle est la différence entre des immunoessais compétitifs vs non compétitifs?

Answer 34

■Compétitifs –Le réactif est limitant –Peut être en mode simultané ou séquentiel –Utilise un antigène marqué et un antigène non marqué (échantillon) qui compétitionnent pour l’anticorps –La probabilité de liaison à l’anticorps pour l’antigène marqué est donc inversement proportionnelle à la concentration d’antigène non marqué de l’échantillon qu’on veut doser ■Non compétitifs –Le réactif est en excès –Anticorps de capture utilisé, lié en phase solide ou non –Antigène lie l’anticorps de capture, suivi d’étapes de lavage –Liaison avec anticorps marqué pour la détection (épitope différent) –Peut être fait en mode simultané ou séquentiel. Mode simultané sujet à l’effet crochet.

Question 35

Différence entre mode simultané et séquentiel pour un immunoessais compétitif?

Answer 35

Mode séquentiel, peut être effectué avec liaison de l’antigène non marqué d’abord, puis ajout de l’antigène marqué. Permet une meilleure liaison de l’antigène non marqué (surtout si faible concentration). Améliore la limite de détection. Signal inversement proportionnel à la concentration

Question 36

Schématise moi un immunoessais non compétitif

Answer 36

Signal proportionnelle à la concentration ■Principe de base : sandwich. Plusieurs variantes possibles

Question 37

Quels sont les différentes phases retrouvées pour l'imunoessai on compétitif?

Answer 37

Les immunoessais non compétitifs peuvent être en phase homogène ou hétérogène : –Homogène : Ne nécessite pas de séparation de phases (anticorps ou antigène libre et marqué) –Hétérogène : premiers essais développés, nécessite une séparation physique d’une fraction en phase solide. Exemple classique : ELISA

Question 38

Qu'est-ce qu'une immunoessai en phase solide (hétérogène)

Answer 38

–l’anticorps de capture est lié à un support solide. La façon dont l’anticorps est lié peut avoir un impact sur ses capacités de liaison à l’antigène. –Si un anticorps polyclonal est utilisé dans la phase de capture, une étape de lavage est nécessaire avant d’ajouter l’anticorps conjugué de détection. –Si des anticorps monoclonaux sont utilisés et qu’ils reconnaissent des épitopes distincts, les deux phases peuvent être effectuées en une seule étape sans lavage intermédiaire. –Dans ce type d’essai : si excès d’antigène, peut saturer les deux anticorps et il en résulte un effet crochet (diminue le nombre de complexes formés) --Les méthodes détectant des molécules dont la plage de mesure est très étendue sont particulièrement sujettes à ce problème. Exemple : marqueurs tumoraux. --Les trousses doivent contenir des concentrations suffisantes d’anticorps pour s’assurer de ne pas devenir saturées au plus haut de la limite de mesure.

Question 39

Qu'est-ce qu'une immunoessai en phase homogène?

Answer 39

–Avancée majeure dans le domaine des immunoessais –Marqueur utilisé = directement modulé par la liaison de l’anticorps. –La magnitude de la modulation = proportionnelle à la concentration de l’antigène ou de l’anticorps mesuré –Techniquement : beaucoup plus rapide et simple –Développé pour le dosage des médicaments à l’origine –Plusieurs variantes : immunoessais avec marqueurs enzymatiques (CEDIA, EMIT), immunoessais LOCI, immunoessais fluorimétriques (

Question 40

Nomme moi un substrat, avec son produit, signal et appareil de mesure?

Answer 40

Question 41

Qu'elles sont les limites du immunoessai non-compétitif?

Answer 41

■Taille des molécules –Facteur limitant : molécule doit être suffisamment grosse pour permettre liaison de deux anticorps simultanément –Stratégies développées pour remédier : --Un premier anticorps de capture lie l antigène. L anticorps de détection reconnait le complexe anticorps de capture antigène (exemple : VitD 25 OH) ■Effet de crochet

Question 42

Peux-tu me faire un résumé des types d'immunoessais, pour compétitif, non compétitif, homogène et hétérogène

Answer 42

Question 43

Qu'est-ce qu'un dosage immunoenzymatique?

Answer 43

■Utilisation des propriétés catalytiques des enzymes dans le but de détecter et quantifier des réactions immunologiques entre un anticorps et un antigène ■Doit générer des conjugués stables (liens covalents) Antigène-Enzyme ou Anticorps-Enzyme. La conjugaison ne doit pas altérer la réactivité immunologique

Question 44

Quels sont les marqueurs enzymatiques les plus utilisés pour les immunoessais?

Answer 44

-Peroxidase de raifort (HRP) -Phosphatase alcaline -Β-galactosidase (CEDIA) -Glucose-6-phosphate déshydrogénase (EMIT)

Question 45

Qu'est-ce que EMIT, peux-tu me le schématiser?

Answer 45

Couplage de l’antigène à doser avec une enzyme. La liaison de l’anticorps anti-antigène à l’Ag couplé inactive l’enzyme : pas de signal La présence d’antigène non marqué compétitionne avec l’Ag-Enz pour l’anticorps : Ag-Enz se retrouve libre et actif : signal. Signal proportionnel à la concentration ■Une des premières techniques disponibles en phase homogène ■Adapté aux multianalyseurs de chimie générale (mesure spectrophotométrique) ■Enzymes utilisées : Glucose-6-phosphate déshydrogénase, Malate déshydrogénase,Lyzozyme ■Peu coûteuse ■Limité aux petites molécules (médicaments, stéroides, vitamines)

Question 46

Qu'est-ce que CEDIA?

Answer 46

■Immunoessai en phase homogène ■Technologie développée en1966 ■Première technique homogène à utiliser le génie génétique afin d utiliser des fragments d une enzyme (la bêta galactosidase d E. Coli) comme marquage pour la détection d une réaction ■Enzyme clivée en 2 fragments inactifs mais capables de se réassocier pour former une enzyme active. ■Un des deux fragments est couplé à l antigène à doser. ■En absence d'antigène de l échantillon, l'anticorps lie le fragment Enz-Ag et l'empêche de se réassocier avec le 2 nd fragment d enzyme : pas de signal. ■En présence d'antigène de l échantillon : l'anticorps lie l antigène libre, ce qui libère le fragment Enz Ag qui peut se réassocier : signal. Concentration proportionnel au signal

Question 47

Qu'est-ce que le KIMS?

Answer 47

■KIMS = technologie ROCHE ■Équivalent chez Siemens = PETINIA (Particule enhanced turbidimetric inhibition immunoassay ■Immunoessai compétitif en phase homogène ■Détection turbidimétrqiue ■Microparticules conjuguées au médicament à doser. ■Anticorps anti-médicament lie les microparticules en absence de médicament libre : forme complexes immuns qui dispersent la lumière (turbidité augmentée) ■Présence de médicament libre compétitionne avec anticorps : diminue formation aggrégats et par conséquent la turbidité

Question 48

Qu'est-ce que le FRET?

Answer 48

■Transfert d’énergie qui n’est possible que si la distance est très faible entre un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur ■Distance typique 1 10 nm ■Une fois excité, le donneur transfert de l’énergie au fluorophore accepteur qui émet une fluorescence de longueur d’onde différente.

Question 49

Qu'est-ce que l'immunoessai TRACE/Kryptor?

Answer 49

■Immunoessai de type sandwich (signal propor à la concentration) ■Anticorps marqué avec un chélat d’Europium (donneur) ■Second anticorps marqué avec allophycocyanine (accepteur_ ■Une fois le complexe sandwich formé par la liaison avec l’antigène, une lumière incidente de 337 nm est irradiée : un transfert d’énergie a lieu entre le donneur et l’accepteur. ■En absence de complexe immun, la fluorescence de l’accepteur est de très courte durée (nanosecondes) ■En présence de complexe immun, le transfert d’énergie de l’Europium permet d’allonger considérablement le temps d’émission de fluorescence de l’accepteur à 665 nm.

Question 50

Qu'est-ce que l'immunoessai FPIA?

Answer 50

■Méthode en phase homogène ■Utilise le principe de polarisation de la fluorescence pour faire la distinction entre les complexes immunologiques (lumière reste polarisée) et le marqueur libre (lumière dépolarisée) ■Technique compétitive : signal inversement proportionnel à la concentration d’antigène ■Commercialisé par Abbott, était coûteux et n’est plus disponible P = (Iv - Ih ) / (Iv + Ih) P = polarisation Iv = intensité lumière émise plan vertical Ih= intensité lumière émise plan horizontal Signal inversement proportionnel à la concentration

Question 51

Qu'est-ce que l'immunoessai LOCI?

Answer 51

Immunoessai de type sandwich (non compétitif) mais en phase homogène. Peut être utilisé pour la détection de grosses molécules Utilise 2 types de particules : « sensitizer » et « chemiluminescer » qui forment un complexe avec la molécule d’intérêt Chaque particule est couplée à un anticorps anti antigène à détecter Signal proportionnel à la concentration La présence de l'antigène permet donc de former un complexe sandwich avec les deux particules La particule photosensitizer convertit l oxygène en singulet d oxygène en présence de lumière La deuxième particule contient un agent chemiluminescent qui réagit avec le singulet d oxygène pour former un dioxetane qui décompose et émet de la lumière ■Les singulets d'oxygène sont une espèce avec durée de vie extrêmement courte (environnement aqueux) ■Ne réagissent pas avec la particule émettant la chemiluminescence sauf si elle est en complexe et donc à distance très rapprochée

Question 52

QU'est-ce que l'ECLIA?

Answer 52

Le ruthénium (II) tris(bipyridyl ) subit une réaction électrochemiluminescente à 620 nm avec le tripropylamine à la surface d’une électrode. ■Ce marqueur sert dans les immunoessais ■Couplage sur billes magnétiques ■Billes captées par aimant à la surface de l’électrode ■Utilisation d’un dérivé d’antigène marqué au ruthénium ■Compétition pour l’anticorps avec l’antigène non marqué ■Isolation des complexes grâce aux microparticules magnétiques ■Existe aussi en version sandwich (non-compétitif) Peut donc être proportionnel ou inversement proportionnel au signal

Question 53

Comment est-ce que le signal est amplifié par la biotine?

Answer 53

■Petite molécule hydrosoluble de 344 Da ■Biotine = interaction très forte (lien non covalent) à l’avidine (blanc d’oeuf) et à la streptavidine Streptomyces avidinii ■Force de liaison 10¨3 à 10¨6 fois plus grande que celle observée pour les complexes Ag Ac ■Biotinylation change pas ou très peu l’activité biologique ni immunoréactivité des molécules conjuguées ■Utilisée pour pontage de plusieurs techniques immunos (fixation de l’Ag ou Ac à la surface du support solide) ■Utilisé également comme amplificateur de signal (formation de réseaux)

Question 54

Nomme moi les 2 classes principales d'interférence des immunoessais?

Answer 54

■Interférences endogènes Divisées en 2 classes Classe 1 = détectables avant l’analyse (indices sériques) Classe 2 = difficiles à détecter en phase pré analytique. Comprend les anticorps interférents (anticorps hétérophiles, biotine, auto anticorps, molécules interférentes autres). Les contrôles internes et externes ne détecteront pas ce type d’erreurs. ■Interférences exogènes Problèmes reliés au processus analytique ( calibrateurs , réactifs, pipettage ,Devraient être identifiées grâce aux contrôles de qualité internes, externes et aux messages d’erreurs sur les instrument s

Question 55

Nomme moi des exemples d'interférences exogènes

Answer 55

Question 56

Nomme moi des exemples d'interférences endogènes

Answer 56

*attention aux suppléments alimentaires et aux produits naturels

Question 57

Nomme moi des anticorps interférents

Answer 57

■Anticorps hétérophiles Anticorps de faible affinité et poly spécifiques qui sont produits tôt pendant la réponse immunitaire. Ils sont dirigés contre des épitopes mal définis. Comprend le facteur rhumatoïde. Terme qui devrait être utilisé quand il n’y a pas d’évidence d’exposition aux animaux ■Anticorps anti-animaux Anticorps monospécifiques de forte affinité dirigés contre des épitopes d’animaux définis (lapin, souris…) Estimé que les anticorps hétérophiles et anti-animaux peuvent causer des interférences dans 0,05% à 6% des immunoessais (dépendant de l’analyte, méthode) Facteur rhumatoïde est présent chez environ 5% de la population et 70% des personnes atteintes d’arthrite rhumatoïde.

Question 58

Comment identifier des interférents?

Answer 58

Question 59

Techniques pour identifier les interférences

Answer 59

■Test de dilution : -En absence d’interférence, les différentes dilutions pour un échantillon donneront tous environ le même résultat (linéaire) -En présence d’une interférence, il y aura des discordances dans les résultats de différentes dilutions (non linéaire) -Utiliser le diluant du manufacturier lorsque possible, sinon un patient négatif ou de l’eau/saline. -L’obtention de dilutions linéaires ne signifie pas nécessairement qu’il n’y a pas d’interférence ■Précipitation au PEG -Précipitation favorisée des plus grosses protéines -Utilisé pour répondre à l’hypothèse qu’un anticorps est responsable de l’interférence observée ■Comparaison avec une autre méthode Différentes méthodes utilisent différents anticorps et auront donc des interférences différentes. Peut être utile de comparer avec plusieurs méthodes Agents bloquants Cocktail d'immunoglobulines pouvant neutraliser des anticorps endogènes. Souvent déjà ajoutés aux réactifs afin de limiter les interférences, mais s'achète commercialement et possible d en ajouter en cas de doute.

Question 60

Exemples de questions à poser aux cliniciens?

Answer 60

1.Cross-réactivité structures stéroidiennes (prednisone, spironolactone etc ), addictions (amphétamines, décongestionnants nasaux), insuffisance rénale (accumulation fragments de PTH c-terminaux, présence de métabolites de certains médicaments…), antidotes ( Fab digoxin) 2.Immunisation ou maladie autoimmune (anticorps anti animaux, anticorps hétérophiles, autoanticorps): traitements anticorps monoclonaux, contact avec animaux, infections, transfusions, vaccination… 3.Effet crochet et paraprotéines : diagnostic récent ou suivi en oncologie 4.Biotine : suppléments protéiques, maladie métabolique, sclérose multiple 5.Protéines de transport: femmes enceintes, pilule contraceptive, antiépileptiques, acidocétose diabétique, héparine 6.Agents de contraste 7.Interférences connues dans le dossier médical du patient (ou de la mère pour un nouveau-né)

Question 62

Qu'elle principe utilise la néphélométrie et turbidimétrie?

Answer 62

■La néphélométrie et la turbidimétrie utilisent le principe de dispersion lumineuse pour quantifier une réaction. ■Cette technique est appropriée à la détection des méthodes d’ immunoessais ■Dispersion lumineuse : –Phénomène qui se produit lorsque de l’énergie lumineuse traversant une solution rencontre une molécule et subit une collision élastique. La lumière est alors dispersée dans toutes les directions. –Collision élastique Eabsorbée = E réémise

Question 63

Qu'est-ce que la dispersion de Rayleigh?

Answer 63

La collision élastique se caractérise par une perte d’énergie négligeable : la longueur d’onde dispersée est la même que la longueur d’onde incidente. À l’inverse, une collision inélastique résulte en une perte d’énergie : la longueur d’onde résultante est plus grande que la longueur d’onde incidente (fluorescente) ■Dispersion de Rayleigh : dispersion ≈ à l’arrière et à l’avant, un peu plus faible à 90 ■Molécules un peu plus grosses : dispersion avant plus importante. Beaucoup moindre à 90 ■Cette asymétrie et différence angulaire = très utile pour caractériser et différencier des classes de cellules et macromolécules : cytométrie de flux (formule sanguine) ■Pour les particules beaucoup plus petites que la longueur d’onde de la lumière incidente (< λ /10) ■Dans un tel cas chaque particule est sujette à la même force d e champ électrique au même moment ■Les rayons lumineux dispersés sont alors en phase et se renforcent. ■Avec des particules plus larges que la longueur d’onde incidente, les rayons lumineux dispersés ne sont plus tous en phase : du renforcement se produit dans certaines directions et des interférences destructives dans d’autres. ■Les patterns de dispersion sont caractéristiques de la forme et taille des particule s

Question 64

Au niveau de la lumière, qu'elle est la différence entre turbidimétrie et néphélométrie?

Answer 64

Néphélométrie : Faible proportion de la lumière incidente est dispersée Turbidimétrie : Majeure proportion de la lumière incidente est transmise

Question 65

Qu'elle est l'équation de la dispersion de Rayleigh

Answer 65

Donc : intensité de la dispersion est inversement proportionnelle à la longueur d’onde incidente. Inversement proportionnel à la distance : le détecteur ne doit pas être loin de la lumière dispersée.

Question 66

Qu'elle est l'application concrète de la dispersion de Rayleigh

Answer 66

■C’est le phénomène de dispersion de Rayleigh qui explique la couleur du ciel ■Les petites longueurs d’onde correspondent à la longueur d’onde bleu du spectre visible ■Beaucoup de petites particules sont présentes dans l’atmosphère : beaucoup de dispersion

Question 67

Donne moi des exemples de dispersion lumineuse

Answer 67

Question 68

Qu'est-ce que la néphélométrie?

Answer 68

■Détection de la lumière dispersée par un détecteur qui n’est pas situé directement dans le chemin lumineux ■Directement proportionnel à la concentration en particules et leur poids moléculaire ■Généralement détecteur à 90 ■Instrument idéal : –Pas de lumière contaminante –Aucun signal lorsque solution devant le détecteur ne contient pas de particules –Solution avec faible concentration en antigènes –Absorption et réflexion minimales ■Certains néphélomètres ont détecteurs à un angle différent de 90 pour profiter de l’intensité augmentée vers l’avant en présence de plus grosse particules (complexes immuns!) ■Design néphélomètre = similaire au principe de mesure de fluorescence. ■Longueur d’onde incidente et de détection = la même ■Perte de signal plus le détecteur est loin de la lumière dispersée

Question 69

Peux-tu m'expliquer le néphélomètre?

Answer 69

■Composantes principales : –Source lumineuse (lampes quartz halogène, xénon, lasers) –Lentille de collimation (production d’un faisceau de lumière parallèle) –Cuvette réactionnelle –Ensemble de détection ■Schéma montre positions possibles pour les différents types de détection a)Turbidimètre b)30 forward scatter néphélomètre c)Néphélomètre à 90

Question 70

Qu'est-ce que la turbidimétrie?

Answer 70

Mesure de la différence d'intensité entre la lumière incidente et la lumière dispersée par les particules : on mesure donc une « perte » de signal. Moinssensible. Loi de Beer Lambert s applique sur plus petite plage de mesure que néphélo Problématique principale = ratio signal/bruit

Question 71

Qu'elles sont les limitations des techniques de dosage de lumière dispersée

Answer 71

■Excès d’antigène Méthodes très sensibles à l’excès d’antigènes puisque le principe repose sur la dispersion lumineuse par les complexes immuns (dans le cas des immunoessais En cas d’excès d’antigène : les complexes immuns se solubilisent et donc perte de dispersion faux négatifs Nécessite systèmes qui détectent l’excès d’antigènes ■Effets de matrice Présence de particules, solvants et macromolécules qui dispersent la lumière. Les lipoprotéines et chylomicrons causent le plus haut taux d’interférence (bruit) dans les essais néphélométriques et turbidimétriques. Particules larges telles poussières peuvent aussi être problématiques. Solutions : filtration de toutes les solutions et méthode cinétique ■Détection de dispersion lumineuse sature après 20 secondes car : –Aggrégation des complexes immuns qui précipitent hors solution –Taille grandissante complexes cause interférences destructive s

Question 72

Peux-tu me donner les inconvénients et avantages de la technique point final

Answer 72

■Point final La mesure est faite une fois que la réaction a atteint sa complétion ou le maximum de formation de complexes immuns (à l’équilibre). Vitesse quasi nulle. –Avantages ■Plus simple –Inconvénients : ■Plus long ■Sujet aux interférences intrinsèques à l’échantillon ■Faux négatifs par excès d’antigène ■Correction requise pour blanc de réaction ( échantillon)

Question 73

Peux-tu me donner les inconvénients et avantages de la technique cinétique?

Answer 73

-Plus d’une mesure est effectuée au début de la réaction : c’est le différentiel de la vitesse de réaction dans le temps -Avantages : Plus rapide Permet l’analyse simultanée de plusieurs échantillons Plus précis Correction non requise pour le blanc d’échantillon ou de réactif -Inconvénients : Coût $$

Question 74

est-ce que l'excès antigène est possible en mode cinétique?

Answer 74

-Même en mode cinétique, l’excès d’antigène est possible : La vitesse maximale de dispersion lumineuse varie avec la concentration d’antigène. Suit une courbe analogue à la courbe de Heidelberg

Question 75

Comment détecter un excès d'antigènes? Qu'elle est la cause principale d'excès d'antigènes?

Answer 75

-Important car impacts cliniques -Cause principale : présence de paraprotéines -Algorithmes informatisés existent dans les appareils pour détecter ces excès : basés sur cinétique différentielle de formation des complexes -Lorsqu’informé d’un possible excès pour un échantillon : dilution et redosage -Autre possibilité : ajout d’anticorps ou d’antigène à la fin de la réaction et observation de la variation obtenue permet de voir si signal se remet à augmenter ou diminue -Ajoute du temps technique de faire des ajouts et des dilutions. -Aussi possible de pooler des patients et redoser le pool : s’il y a une discordance avec la valeur attendue, on sait qu’il y a possiblement un échantillon avec excès d’antigène. Évite de contrôler tous les échantillons.

Question 76

Pourquoi normaliser les analyses?

Answer 76

-Dosage d’un même analyte dans différents labos peut résulter en de grosses variations de concentration. -Plusieurs facteurs en cause : --Conditions préanalytiques --Appareils --Méthodes --Valeurs de référence --Unités de mesure --S’observe même pour des méthodes standardisées -Justesse des mesures -Accréditation -Suivi des patients : différents centres, devrait pouvoir comparer les résultats. -Harmonisation des valeurs de référence -Guides de pratique clinique (seuils de décision) : impact si variations entre méthodes -Sécurité des patients, confiance du public -Harmonisation globale du réseau de labos (SILP), des dossiers électroniques de patients (DSQ)

Question 77

Que peut-on normaliser?

Answer 77

-Harmonisation des protocoles -Technologie, traçabilité, commutabilité -Conditions pré-analytiques diverses, dont stabilisation et conservation des échantillons -Les rapports d’analyses et la transmission des résultats (SILP) -Noms des tests, unités, valeurs de référence, limites critiques (SILP, comités provinciaux) -Niveaux d’harmonisation : local (grappe), régional, provincial, national, international

Question 78

Comment est-ce que les calibrateurs sont traçés?

Answer 78

-Chaîne de traçabilité métrologique : «Succession d’étalons et d’étaonnages qui est utilisée pour relier un résultat de mesure à une référence», selon le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) propriété d'un résultat de mesure selon laquelle ce résultat peut être relié à une référence par l'intermédiaire d'une chaîne ininterrompue et documentée d'étalonnages dont chacun contribue à l'incertitude de mesure NOTE 7: L'ILAC considère que les éléments nécessaires pour confirmer la traçabilité métrologique sont une chaîne de traçabilité métrologique ininterrompue à un étalon international ou un étalon national, une incertitude de mesure documentée, une procédure de mesure documentée, une compétence technique reconnue, la traçabilité métrologique au SI et des intervalles entre étalonnages (voir ILAC P-10:2002).

Question 79

Qu'est-ce qui peut être un matériel de référence?

Answer 79

Matériel de référence - Matériau dont les propriétés physiques et/ou chimiques sont suffisamment bien déterminées pour permettre son utilisation dans : --L’étalonnage des instruments --La validation des méthodes --L’assignation de valeurs à d’autres produits (calibrateurs..) --L’évaluation et la comparabilité de résultats -Matériau de référence certifié : En plus des caractéristiques ci-dessus, le matériau est accompagné de documentation délivrée par un organisme faisant autorité. Cette documentation fournit une ou plusieurs valeurs de propriétés spécifiées avec les incertitudes et traçabilités associées (fait en utilisant des procédures valables)

Question 80

Qu'est-ce que la commutabilité?

Answer 80

Propriété d’un matériau de référence qui permet d’obtenir des résultats concordants entre des mesures faites avec le même matériau, mais en utilisant deux méthodes différentes Pour qu’un contrôle externe de la qualité soit évalué de façon adéquate et donne une justesse des résultats, il faut que le matériau soit commutable. Ce n’est souvent pas le cas. Pour que l’utilisation d’un matériau soit jugé adéquate pour l’étalonnage, il faut que le matériau de référence utilisé dans la chaîne de traçabilité soit commutable