Intra II Flashcards
(143 cards)
1
Q
Combien de bases constituent le génome ?
A
3 milliards de bases
2
Q
Quel est le pourcentage des gènes codants dans le génome ? Des junk DNA ?
A
1-3%
2-75%
3
Q
Il y’a combien de types d’ARN transcrits ?citer les
A
Y’en a 4
1- ARNm
2-ARNr (ribosomal)
3- petits non codants ( sARN)
4- long non codants (lncARN)
Pseudo gènes
4
Q
Qu’est ce qui caractérisent les long ARN non codant (lncARN)?
A
1- ils forment une nouvelle classe d’arn
2-ils font parties des molécules les moins bien caractéristiques
3- certains jouent des rôles critiques dans plusieurs processus biologiques
4- plusieurs sont associés à un grand nombre de maladies ( cancer, maladies cardiovasculaires, maladies neurodegenerative…)
5
Q
Comment les lncRNA forment des structures complexes?
A
Par le biais d’interactions moléculaires ( ARN-protéines, ARN-ARN)
6
Q
Quelle est la capacité de l’ARN ?
A
De stocker les informations génétiques comme l’ADN et de catalyser des réactions chimiques comme les protéines, il serait le précurseur de la vie sur terre
7
Q
Que sont les acides nucléiques ?
A
Des polymères de nucleotides
8
Q
Quelles sont les pyrimidines et quelles sont les purines ? ( les bases azotées )
A
Pyrimidines:
1- cytosine( adn , ARN)
2- uracil (arn)
3- thymine (adn)
Purines:
1-adénine (adn, ARN)
2-guanine (ARN,adn)
9
Q
Tous les deux types de bases azotées sont des hétérocycles. Vrai ou faux
A
Vrai
Noyau pyrimidine est monocycliques et noyau purine est bicyclique
10
Q
Pour chacun des deux types de bases azotées , la liaison du ribose est à quelle position ?
A
Pour le noyau pyrimidines la liaison du ribose est à la position 1
Et pour le noyau purine à la position 9
11
Q
Quelles sont les pentoses des nucleotides? 1- chez l’Arn? 2- chez l’ADN ?
Quelle est la différence sur leur structure et quelles sont les conséquences de cette différence ?
A
1-D-ribose
2-D2-désoxyribose
Difference :2’-OH versus 2’-H, cette différence affecte la structure secondaire et tertiaire et la stabilité
12
Q
Par quoi sont composés les nucleosides?
A
Les nucleosides sont composés de base azoté lié à un Pentose
13
Q
La base azotée est liée par quoi et quelle est la particularité du carbone de cette liaison ?
A
La base azotée est liée par une liaison glycosidique , le carbone de la liaison glycosidique est anomerique
14
Q
Comment nommer les nucleosides?
A
En ajoutant au radical des pyrimidines la terminaison idine et la terminaison osine aux purines
15
Q
Comment peut être la conformation des nucleosides ?
A
Syn ou anti
16
Q
Entre la base azotée et le Pentose lequel des deux contribuent à la plus grande solubilité dans l’eau du nucleoside ?
A
Le pentose
17
Q
Que sont les nucleotides ?
A
Ce sont des nucleosides phosphorylés , généralement monophosphorylé , diphosphorylé et triphosphoryles
18
Q
Les nucleotides appartiennent à quel type d’acide ? Et qu’est ce qu’ils absorbent fortement ?
A
Ce sont des acides polyprotiques
La lumière ultraviolette
19
Q
Quelles observations fait on pour les nucleotides mono phosphates ,à PHneutre ?
A
Les bases azotées ne sont pas chargées
Les riboses ne sont pas chargés
La charge nette du nucleoside mono phosphate est de -2
20
Q
C’est quoi le pka de :
1- 5’AMP (N1)
2-5’GMP (N1)
3- 5’GMP (N7)
4-5’CMP(N3)
5-5’UMP (N3)
A
1-3,8
2-9,4
3-2,4
4-4,5
5-9,5
21
Q
Pour quelle raison les bases , nucleosides et nucleotides absorbent fortement la lumière ultraviolette? Et en quoi ceci est important ?
A
1- en raison de l’aromaticité des hétérocycles
2-ceci est important pour l’analyse quantitative des nucleosides ou nucleotides
22
Q
Que sont les acides nucléiques et comment se forment ils ?
A
Les acides nucléiques sont des polymères linéaires liés de 3’ en 5’ par des liaisons phosphodiesters
Ils se forment in vivo par l’addition successive d’un nucleotide 5’-phosphate au groupe 3’-OH du nucleotide précédent
23
Q
Chez l’ADN et l’ARN, quelles sont les structures prépondérantes ?
A
Les structures hélicoïdales
24
Q
Entre l’ADN et l’Arn, lequel des deux a une plus grande diversité de conformation ?
A
L’Arn
25
La capacité d’un ARN à exercer normalement ses fonctions physiologiques est déterminée par quoi ?
Sa structure tridimensionnelle/sa conformation
26
Combien d’angles de torsion définissent le trajet de la chaîne chez les acides nucléiques ? Citer les
6: alpha , beta , gamma , delta , epsilon , zeta
27
Combien d’angles de torsions endocycliques peuvent définir la conformation du ribose? Citer les
5 angles de torsion endocycliques : nu0, nu1, nu2, nu3, nu4
28
Quel est l’angle glycosidique et que permet il ?
C’est l’angle Chi , il donne l’orientation de la base par rapport au ribose
29
Quelles sont les deux formes de conformation que peut adopter le ribose ? Et comment pouvez vous les décrires ?
La forme enveloppe E: 4 atomes dans un même plan , le 5e dépasse d’environ 0,5amstrong
La forme tordue , Twist T: 3 atomes adjacents dans un plan , 2 atomes adjacents de chaque côté du plan
30
Pour la forme enveloppe , quelles sont les deux conformations qui existent dépendant de la position du 5e atome par rapport à C5’?
Si le 5e atome est du coté opposé à C5’ on a la conformation exo
Si le 5e atome est du même cote que le C5’ , on a la conformation endo
31
Quelles les conformations idéales du furanose pour les hélices de type A et B?
Conformation c3’ endo nord pour l’hélice de type A et conformation C2’ endo sud pour l’hélice de type B
32
Quelles sont les conformations possibles pour l’angle glycosidique chi ? Et quelle est la conformation pour les hélices de types A et B ? Pourquoi?
Les conformations possibles , sont les conformations anti et syn
La conformation pour les hélices de type A et B , est la conformation anti , parce que cela permet d’éloigner la face watson- crick de la base par rapport au ribose
33
Comment est la formation de paires de paire de base par rapport à celle des structures des acides nucléiques ?
La formation des paires de base est centrale à la formation des structures d’acides nucléiques non seulement dans les structures hélicoïdales mais dans les autres types de structures
34
Qu’est ce qui permet la stabilisation des paires de bases ?
La formation de pont d’hydrogènes , quoique dans la structure hélicoïdale , l’empilement des bases dominé énergétiquement
35
Dans certaines structures , on retrouve aussi , d’autres types d’association entre les bases ? Comme quel type d’association ?
Les triplets et quadruplets de bases
36
Quelles sont les paires de bases canoniques ?
Ce sont les paires de bases watson-crick AU, GC et GU wobble
37
Quelles sont les paires de bases non canoniques ?
C’est toutes les paires de bases non watson-crick AU, non wobble GU
38
Une interaction AT avec A(syn) et T(syn) est canonique ou non canonique? Et si c’est A(anti), T(syn) ? Qu’en est il de A(anti) , T(anti)?
1- non canonique
2-non canonique
3-canonique
39
Quelle est la définition de la compilation géométrique de Leontis et westhof? Et en quoi cette nomenclature est utile ?
Definition : classification des paires de bases selon la géométrie d’interaction des bases tel qu’observé dans les structures d’ARN . Cette classification donne une emphase à l’isostericite (occupation similaire à l’espace 3D)
Cette nomenclature est utile: pour décrire précisément et sans ambiguïté les structures d’ARN( paires de bases , triplets de bases , quadruplets de bases, motifs d’ARN…)
Pour l’identification des motifs basés sur les séquences d’ARN
40
Quels sont les paramètres nécessaires pour spécifier la géométrie? ( les deux nécessaires et les deux accessoires)
-paramètres nécessaires : les faces d’interactions des deux bases ( 3faces)
L’orientation relative des liaisons glycosidiques( cis ou trans)
- paramètres accessoires: l’orientation syn ou anti des liaisons glycosidique , l’orientation locale relative des brins
41
Les bases enteragissent par l’entremise de quoi ?
Par l’entremise d’une ou plusieurs faces
42
Quelles sont les trois faces , et les atomes qui interviennent pour chacune des faces ?
Face watson-crick, face hoogsteen et face du sucre .
Pour purine :
Face watson crick: GN2 GN1 GO6 AC2 AN 1 AN6
Face hoogsteen: RN7 GO6 AN6
Face du sucre: GN2 AC2 RN3 RO2’
Pour pyrimidine :
Face watson crick: YO2 YN3 CN4 UO4
Face hoogsteen: CN4 UO4 YC5 YC6
Face du sucre: YO2 YO2’
43
Comment pouvez vous décrire les structures hélicoïdales ? Le type A typique de l’ARN ? Le type B typique de l’ADN?
Pour les structures hélicoïdales les paires de bases se retrouvent au centre et le squelette ribose- phosphate en périphérie
Le type A : est gros et trapu
Le type B:est long et mince
44
Quelle est la largeur du sillon majeur pour l’ADN et l’ARN? Et la profondeur du sillon majeur ?
Largeur sillon majeur:
-ADN: 11.7
-ARN:2.7
Profondeur sillon majeur :
-ADN: 8.5
-ARN:13.5
Unité : Angström
45
Quelles sont les conséquences des propriétés des sillons pour la reconnaissance des acides nucléiques par les protéines ?
1-le sillon majeur possède le plus grand potentiel pour la reconnaissance spécifique de la séquence de l’acide nucléique
2-l’hélice alpha et le feuillet bêta à 2 brins pénètrent facilement le sillon majeur de l’ADN pour permettre la reconnaissance d’une séquence spécifique de l’ADN
3- le sillon majeur de l’ARN est trop étroit pour une même pénétration de l’hélice alpha ou feuillet bêta
4-cependant , des perturbations dans l’hélice de l’Arn permettent un élargissement du sillon majeur pour la reconnaissance par une hélice alpha ou même un feuillet bêta
46
Quand est ce que les interactions tertiaires se forment ?
Lorsque deux lignes se croisent sur le diagramme en forme d’arc
47
Que contiennent les régions non appariées et en quoi elles sont importantes ?
Les régions non appariées contiennent des motifs structuraux et sont importantes pour la formation de la structure tertiaire et pour les interactions intermoléculaires
48
Quelles sont les différentes façon de représenter la structure secondaire ?
Graphe planaire , diagramme en forme d’arc , chaînes de caractères
49
Comment section définie généralement la structure tertiaire ?
La structure tertiaire se définie généralement comme étant l’arrangement tridimensionnel de motifs d’ARN, incluant la double hélice et les autres motifs qui s’assemblent pour former les interactions tertiaires
50
Quel rôle joue les liaisons hydrogènes et l’empilement des bases ?
Les liaisons hydrogènes et l’empilement des bases jouent un rôle énergétique très important dans la formation des doubles hélices et des autres éléments de structure secondaire. Les structures secondaires sont généralement très stables en raison de la formation des doubles hélices
51
La formation des structures tertiaires implique quelles autres interactions stabilisantes?
1- la structure des régions non pairées
2-l’empilement coaxial : l’empilement de bases bout à bout de doubles hélices
3- autres interactions tertiaires pour empaqueter les hélices
52
Entre les interactions tertiaires et les structures secondaires, lesquelles sont les stables ?
Les interactions tertiaires
53
Où se trouvent les charges négatives des phosphates dans les doubles hélices ( domaines helicaux)?
Dans les doubles hélices , les charges négatives des phosphates sont généralement à l’extérieur en contact avec le milieu aqueux
54
La formation des structures tertiaires implique le rapprochement des domaines helicaux chargés négativement. Quel rôle les ions métalliques y jouent?
Les ions métalliques généralement, Mg2+, jouent un rôle clé dans la formation des structures tertiaires en neutralisant les interactions de répulsion entre charge negative
55
Quelles sont les hélices à double brin régulières
Type A : double hélice d’ARN avec paire de bases watson crick et GU
Type B:jamais observée chez les ARN
Type Z: Observée pour les séquences rCrG sous des conditions de très hautes concentrations en sel
56
Qu’est ce que l’on retrouve dans les régions non pairées de l’ARN et quelles sont les régions ?
On y retrouve d’autres motifs structuraux ( motifs U-turn, motifs GNRA, empilement des purines inter-brins…)
Les régions non pairees de l’ARN:
1) simples brins
2)extrémités des hélices ( régulières, extrémité 5’ ou 3’ libre)
3)boucles terminales ( dans les épingles à cheveux)
4) boucles internes ( incluant renflement, boucle asymétrique , boucle symétrique)
5) jonction ( à 2, 3,4… tiges)
57
Comment pouvez vous décrire les régions simple brin , selon la concentration en sel et la température ?
1-A basse température et une haute concentration en sel , les bases s’empilent , les riboses adoptent la conformation C3’ endo , la forme hélicoïdale est à droite
2- Avec une augmentation de la température et une baisse de la concentration en sel , l’empilement des bases est moins important mais il n’y a pas de transition abruptes
Tendance à l’empilement : A, G > C > U
58
Comment pouvez vous caractériser les extrémités des hélices ? ( indice les prolongement simple brin , les prolongement à l’extrémité 3’, 5’, les purines, les pyrimidines)
1- les prolongements simple brins d’une hélice ( nucleotides non appariés) stabilisent les duplexes
2- les prolongements à l’extrémité 3’ sont thermodynamique ment plus stable que ceux en 5’
3- les purines stabilisent généralement plus que les pyrimidines
59
Quels sont les caractéristiques des boucles terminales , motifs U-turn ?
- Ils sont les premiers motifs de boucle terminale identifiés
- commun dans les boucles anticodon et T pseudouridine C chez L’ARNt , ARNr et plusieurs autres ARN
-sequence consensus UNR ( N n’importe quel nucleotide , R purine )
-caractéristique structural
1) pont H entre U1 H3 , R3 3’PO4
2) pont H entre U1 2’OH, R3 N7
3)angles du squelette particulier entre U1 et N2
60
Qu’est ce qui a révélé 3 classes importantes de boucles terminales à 4 nucleotides ?comment appelle t’on ces boucles terminales et quelles sont les 3 classes ?
La comparaison de séquences des ARN ribosomal a révélé 3 classes importantes de boucles terminales à 4 nucleotides
Ces boucles terminales sont les tétra-boucles.
Les 3 classes : GNRA , UNCG , CUYG
61
Que forment les Tetra- boucles ?
Des structures compactes relativement rigides et stabilisantes
62
Comment pouvez vous caractériser le nucleotide le plus variable de chaque Tetra boucle ?
C’est le plus flexible
63
Que pouvez vous dire sur les boucles GNRA ? ( indice : paire de base , pont H , empilement , abrupte , C3’, C2’)
. La structure de plusieurs membres de cette classe est caractérisée par RMN ou par cristallographie
1) paires de base GA ( Trans G sillon mineur , A hoogsteen)
2)pont H entre G1 H1 et R3 3’PO4
3) pont H entre G1 2’OH ET R3 N7
4) empilement NRA , meilleur empilement avec N R
5)tournant abrupte entre G1 et N2
6) C3’ endo pour G1 et A4, C2’ endo pour A2 et A3 : augmente la distance P-P entre nucleotides adjacents pour permettre la boucle
64
Quel rôle joue les boucles GNRA ?
Les bouclent GNRA joue un rôle dans la reconnaissance de l’ARN et dans la reconnaissance des protéines
65
Quels sont les caractéristiques de CUYG ? ( indice paire de base , fermé , C2 , consensus , U3)
- la boucle CUYG est généralement fermée par une paire de base CG , la séquence consensus est donc G1C2U3 Y4 G5 C6
-les caractéristiques structurales:
1)paire de base C2G5 watson crick , il s’agit donc d’une boucle à 2 nucleotides
2)U3 se retrouve dans le sillon mineur et interagit avec G1 G5 et C6
3) C2 U3 Y4 et G5 sont C2’ endo
66
Quels sont les caracateristiques de UNCG ? Indice ( exceptionnellement, GNRA , paire de base )
- les boucles UNCG sont exceptionnellement stables. Elles sont plus stables lorsqu’une paire de base CG ferme la boucle
- souvent UNCG peut remplacer GNRA sans affecter la fonction
- caractéristiques structurales ( différentes de GNRA )
1) paire de base U1 G4pair avec G4 syn
2) pont H avec C3 NH2 et U1 PO4
3) C3 empilé sur U1
4) C3’ endo pour U1 et G4 et C2’ endo pour N2 et C3
67
Que sont les protubérances ?
Les protubérances sont des boucles internes à un ou plusieurs nucleotides non appariés sur un des deux brins
68
Comment pouvez vous décrire la protubérance à un nucleotide?
La base non appariée s’intercale dans l’hélice où se retourne vers l’extérieur tou dépendant du type de base , du contexte séquentiel, des facteurs externes
69
Donner un exemple d’une protubérance à 3 nucleotides
ARN TAR. du VIH
70
Que pouvez vous dire sur les boucles internes : les paires de base non-canoniques ? ( indice à 2 nucleotides et à 4 nucleotides)
Les boucles internes à 2 nucleotides forment souvent des paires de bases non canoniques. Ces boucles déstabilisent les hélices d’ARN . Elles créent des distorsions dans les hélices de type A qui deviennent des sites potentiels pour les ligands b
Les boucles internes à 4 nucleotides forment souvent des paires de bases non canoniques . Elles déstabilisent ou stabilisent les hélices d’ARN. L’orde de stabilité est : UG/GU, Gu/ug, Ga/ag, Ag/ga, uu/uu, ca/ac, cu/uc, uc/cu, cc/cc, ca/ca , aa/aa. Parmi les plus stables on retrouve les empilements de purine inter-brins
71
Que pouvez vous dire sur l’empilement des purines inter-brin?
L’empilement de fait entre brin opposés et non pas sur le même brin comme dans le cas de la double hélice . Ici A d’empile sur A et G sur G ( pas A sur G)
72
Que pouvez vous dire sur les boucles internes asymétriques ?
Certains forment des structures stables ( motif boucle E, A en plate-forme, motif protubérances-hélice-protubérance…)
Tandis que d’autres sont flexibles et peuvent se replier en présence de ligands ( aptamère ATP, ARN RRE du HIV-1…)
On y retrouve souvent des paires de bases non canoniques
73
Que pouvez vous dire sur le motif boucle E ? ( c’est quelle boucle comment elle est longueur ? Conserver où? Caractéristiques structurales , empilement, paire de base , squelette, G, paire de base )
Boucle interne asymétrique de 9nt
Sous catégorie avec N G : motif à bulge G
Très conservé chez l’ARN 5S des eukaryotes et l’ARNr 23S/28S
Caractéristiques structurale ( ARNr 5s):
1) empilement inter brin entre 2 A
2) paire de base non canonique GA, triplet de base GUA
3)Squelette ribose phosphate sévèrement déformé, il se dirige vers la direction opposé pour un résidu formant un tour S
4) G non conservé est libre
5)la paire de base AA est entre deux brins parallèles
74
Que pouvez vous dire sur les jonctions? Indice ( régions , comment peuvent ils être , rôle , coaxial , groupes phosphates )
1)régions où les tiges des doubles hélices interconnectées se retrouvent
2)les jonctions peuvent être parfaitement appariées ou contenir des paires de bases non canoniques , des bases non appariées ou d’autres motifs d’arn
3) les jonctions jouent un rôle important dans le positionnement des domaines helicaux à des angles spécifiques, ils déterminent la conformation globale des molécules d’arn
4)l’empilement coaxial de deux hélices stabilisent la jonction
5) en raison de la densité des groupes phosphates , on retrouve des sites de liaison des métaux divalents
75
Quelles sont les trois méthodes de base pour la prédiction des structures secondaires ?
Calcul thermodynamique ou méthodes du minimum d’énergie libre: détermine les régions complémentaires qui sont enrgetiquement stables ( Mfold , vienna package , Sfold, RNAstructure )
Analyse comparative de séquences ou analyse de covariation : prend en comptes les patrons des paires de bases conservés durant l’évolution ( turbo fold )
Basée sur la connaissance ( knowledge- based, ex: MC FOLD/ MC-sym, contrafold
76
Quels sont les 4 types d’énergie considérées dans les calculs thermodynamiques ?
1) énergie d’empilement des paires de bases
2)énergie des boucles terminales
3) énergies des boucles internes et des bulges
4)énergie des jonctions et des bases libres
77
Les règles d’énergie ont été dérivés en premier lieu pour quelles régions ?
L’énergie totale calculée est donnée par quoi ? C’est quel modèle ?
Que comprennent ces énergie d’empilement ?
Pour les hélices intermoléculaires , qu’est ce qui est ajoutée?
1) pour les régions double brins contenant des paires de bases canoniques : Watson-crick et wobble
2)l’énergie totale calculée est donnée par la somme des énergies d’empilement, une pour chaque paire de base adjacente
3) c’est le modèle du plus proche voisin de tinoco
4)les énergies d’empilement comprennent effectivement les contributions énergétique d’empilement des bases et des liaisons hydrogènes entre les bases
5)pour les hélices intermoléculaires , une énergie libre d’initiation intermoléculaire de + 4.10kcal/mol est ajoutée
78
Le modèle du plus proche voisin de tinoco , fonctionne pour quelles paires de base et est moins efficace pour quelles paires de bases ?
Le modèle du plus proche voisin de Tinoco fonctionne pour les paires de base Watson Crick et pour les paires de bases isolées GU . Il est moins efficace pour les paires de base non canonique et les paires de base GU consécutives
79
Qu’est ce qui ne sont pas favorables au repliement et que font ils ? Et que font ils ?
Les boucles internes , les boucles terminales ou bulges ne sont pas favorables au repliement et augmente le delta G de repliement
80
Quelles sont les boucles terminales les moins déstabilisantes ?
GNRA ET UNCG
81
Est ce que les calculs du logiciel Mfold permettent de prédire la structure en toute confiance ? Si oui pourquoi ? Si non pourquoi ?
Ces calculs ne permettent pas de prédire la structure en toute confiance car toutes les contributions énergétiques n’y sont pas incluses( effet du sel , stabilisations dans certaines séquences de boucles…) . Des données expérimentales sont nécessaires pour vérifier la structure
82
Quel est le procédé de l’analyse comparative de séquences et sur quoi la méthode est basée ?
1) Les séquences apparentées sont collectées et comparées afin d’extraire l’information sur les structures communes
2)la méthode est basée sur le fait qu’en général , l’architecture structurale liée à la fonction évolue moins rapidement que les séquences qui ne sont pas importantes pour la fonction
83
Quelle est l’utilité de la méthode d’analyse de séquence ?
Cette méthode est très utile pour la prédiction de structure secondaire d’ARN et d’éléments de structure tertiaire . La relation entre structure et séquence est beaucoup plus explicite chez l’Arn que chez les protéines
84
Quelles sont les 4 étapes de l’analyse comparative de séquences ?
1) collections des séquences apparentées
2) alignements des blocs de séquences conservées
3) les positions qui changent de manière concertées sont sélectionnées et les patrons de covariations sont analysés en terme de contacts moléculaires
4) un model de structure secondaire est établie, qui dans certains cas , peut contenir des informations sur la structure tertiaire
85
D’ où proviennent les séquences pour l’analyse comparative de séquences ?
Qu’est ce qui est important pour le succès de l’approche?
Quelle est la supposition importante ?
1) les séquences proviennent de produits de sélection naturelle ou de mutants produits in vitro ( mutants fonctionnels)
2) la quantité et la diversité de séquences sont importantes pour le succès de l’approche
3) la supposition importante est que toutes les séquences collectées sont fonctionnelles
86
Sur quoi est basée l’arbre phylogénétique universel ?
Il est basé sur l’analyse quantitative de différences de séquences d’ARN de diverses espèces
87
L’analyse phylogénétique a eu un effet révolutionnaire sur la science biologique . Qu’est ce qu’elle soutient et qu’est ce qu’elle a définit de nouveau?
Elle soutient une charpente evolutionnaire .
Elle définit un nouveau domaine pour les etres vivants en plus des bactéries et des eucaryotes: les archees
88
Sur quoi sont basées les méthodes biochimiques pour sonder la structure ? Sur quels ARN , sont elles applicables? Pourquoi les conditions sont optimisées pour cette méthode ?
Basées sur la réaction spécifique de certains composés chimiques ou enzymes avec l’Arn
Elles sont applicables sur l’Arn libre ou lié
Les conditions sont optimisées pour permettre une seule coupure ou une modification par molécule d’ARN
89
Qu’est ce qui coupe le squelette ribose phosphate de l’ARN ?
Les nucléases
90
Que permet la RNase VI du venin de cobra ?
C’est une ribonuclease qui permet de démontrer l’existence de structure double brin hélicoïdale
91
Quels sont les avantages et inconvénient des nucleases ?
1) certaines enzymes ( T1, U2, Phym) sont actives dans des conditions dénaturantes et sont donc très utiles pour le séquençage de l’ARN
2) L’utilisation combinée d’enzymes spécifiques aux régions simples brins ou doubles brins permet de déterminer la structure secondaire dans des conditions semi-dénaturantes qui empêche la formation de la structure tertiaire
3)la grosse taille des nucleases entraînent un encombrement stérique chez les gros ARN et ne permet pas donc la détermination de la structure tertiaire
92
Comment se passe l’attaque de l’Arn par des composés chimiques ?
Certains composés chimiques de petites tailles ciblent des atomes spécifiques au niveau de la base , du ribose et du phosphate
Certains de ces composés entraînent la coupure et d’autres la modification de l’Arn , la détection spécifique se fait dans les deux cas
93
Que pouvez vous dire sur les réactifs des bases ? Les réactifs du squelette ribose phosphate ? Les agents de pontage?
1) les reactifs des bases , en général , ils permettent de distinguer les nucleotides appariés de ceux qui ne sont pas appariés
2) les réactifs du squelette ribose phosphate ne sont généralement pas sensibles à la structure primaire ou la structure secondaire mais dépendent plutôt de l’accessibilité du squelette. Ils permettent de cartographier les sites accessibles et enfouies chez les gros ARN repliés . Ils permettent aussi de cartographier les surfaces d’interactions dans les complexes ARN- métaux , ARN-ligand et ARN-protéines
3)les agents de pontages , composés chimiques réagissant avec deux cibles rapprochés et qui permettent l’identification d’interactions tertiaires
94
Quelles sont les deux méthodes de détection pour l’analyse biochimique ?
1) la detection du clivage du squelette ribose phosphate de l’ARN. Marqué au P32 en 5’ ou 3’
2)la détection d’une modification chimique qui n’entraîne pas le clivage du squelette. Par exemple, le DMS entraine la methylation du N1 des A et N3 des C , dans ce cas , la détection se fait par extension d’une amorce marqué au P32 à l’aide d’une transcriptase inverse
95
Où se localisent les protéines dans la cellule ?
Membrane , noyau , cytoplasme, reticulum endoplasmique
96
Quelles sont les propriétés physico-chimiques des protéines ?
Taille moléculaire , point isoélectrique , glycosylation- phosphorylation- methylation , liaison avec métal ou ligand
97
Quelles sont les sources des protéines les plus communes ?
Tissus d’animaux , bactéries, levures , cellules d’insectes , cellules humaines
98
Quels sont les avantages de l’isolation de protéines de tissus d’animaux ? Quelles sont les limites ?
Avantages :
Proteine native
Pas cher
Modifications post traductionnelles
Limites:
Source limitée
Petite quantité de protéines spécifique
Pas toujours reproductible
Pas d’étiquette
99
Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans la bactérie ? Quelles sont les limites ?
Avantages
Beaucoup de protéines , milieux pas chers
Culture at expression rapide
Beaucoup de vecteurs d’expression différents (tags étiquettes )
L’expression de protéines marquée est facile
Limites
Pas de modifications post-traductionnelles ou de ponts disulfures
Différents codons chez la bactérie ( problème de codon rare)
Pas bon pour les protéines membranaires
100
Quels sont les avantages et les limites de l’expression de protéines dans la levure ?
Avantages
Beaucoup de protéines et milieux pas chers
Pont disulfure et certaines modifications post traductionnelles ( phosphorylation)
Expression de protéines marquées est possible ( RMN)
Limites
Moins rapide que la bactérie
Différents codons chez la levure
Pas bonne pour les membranes glycosylees
101
Quels sont les avantages et les limites de l’expression de protéines chez l’insecte ?
Avantages:
Ponts dissulfures modification post traductionnelles
Bon pour les protéines glycosylees
Vecteur avec his-tag et gst-tag
Meilleurs codons , bon pour les grosses protéines humaines
Limites:
Moins rapide (1-2 semaines) peu de protéines
Milieux spéciaux ( plus chers)
La production de protéines marquée est difficile
102
Que pouvez vous dire sur le vecteur pTT et les cellules HEK293-E6 , pour l’expression dans les cellules humaines ?
Vecteur pTT:
Pour expression intracellulaire ou sécrétion extracellulaire
Jusqu’à 10 fois plus efficace que pCDNA
possibilité de produire entre 20et 60 mg de protéines recombinantes par litre
Protéines avec His-tag
Cellule HEK293-E6:
Aucun problème de codon rare pour expression de protéines humaines
Chaperon pour un repliement optimal
Croissance en suspension= possibilité de densité cellulaire plus élevée
103
Quels sont les avantages et les limites de l’expression dans les cellules humaines ?
Avantages
Ponts dissulfures , modifications post traductionnelles, protéines membranaires
Protéines contaminants ne sont pas immunogènes
Vecteurs production avec his-tag
Codons parfaits , meilleurs choix pour les très grosses protéines humaines
Limites
Pas rapides moins de protéines
Besoin d’un fermenteur pour une grosse production
Milieux spéciaux ( plus chers)
Production de protéines marquées est impossible
104
Quelles sont les 3 étapes de stratégie de purification ?
1- capturer , isoler , concentrer : précipitation saline , chromatographie d’affinité , chromatographie par échanges d’ions
2- purifier , retirer les grosses impuretés : chromatographie d’affinité , chromatographie par échange d’ions
3- polir, retirer les petites sous unites : chromatographie par filtration sur gel , chromatographie en phase inverse
105
Comment se passe la précipitation saline d’ammonium ?
1) commence par la fraction soluble
2)augmenter la concentration de sulfate d’ammonium de 10% à la fois
3) centrifuger et resuspendre le culot pour analyse
4) répéter les étapes 2 et 3 jusqu’à 80-90% de sulfate d’ammonium
5)electrophorese pour identifier les culots avec la protéines
6) resuspendre les culots avec la protéine dans le tampon original pour une purification additionnelle
106
Qu’entraîne l’augmentation de sels ( sulfate d’ammonium ) ?
Une baisse de la solubilité
107
Quelles sont les 4 méthodes chromatographiques les plus communes ?
1)chromatographie d’affinité
2) chromatographie par échange d’ions
3) chromatographie par filtration sur gel
4)chromatographie en phase inverse
108
Comment pouvez vous décrire les types de chromatographies ( FPLC , HPLC) ?
FPLC: pression moyenne( 1500-3000psi maximum), débit faible à rapide , tube de PEEK
HPLC: Haute pression ( 6000psi maximum), débit très faible à rapide , tube d’acier ou de titane
109
Quelle est la différence entre l’élution linéaire et l’elulion par gradient ?
Elution linéaire : un Tampon
Le protocole est plus simple
L’équipement est moins cher
La séparation est moins efficace
Elution par gradient : 2 tampons ou plus
Le protocole est plus compliqué
L’équipement est plus cher
La séparation est plus efficace
110
Parler de la loi de beer Lambert dans la détection aux ultraviolets (UV) ?
La loi de beer Lambert relie la quantité d’absorption de la radiation ( à une longueur d’onde donnée) à la nature des espèces absorbantes: A= ElC
111
Parler de la détection aux ultraviolets des protéines ( indice groupe amide et les acides aminés aromatiques )
Le groupe amide et certains groupes fonctionnels des chaînes latérales absorbent dans l’ultraviolet en bas de 250 nm
Les acides aminés aromatiques absorbent de manière plus importante dans l’ultraviolet au dessus de 250 nm
112
Quels sont les filtres UV les plus importants pour des protéines ?
1)214-218nm: le plus sensible , détecte le lien amide de tous les acides aminés
2)254nm: moins sensible - détecte seulement le noyau aromatique de la phenylalanine, de la tyrosine et du tryptophan
3)280 nm : détecte seulement le noyau aromatique de la tyrosine et du tryptophan
113
Que pouvez vous dire sur la chromatographie d’affinité ( Principe , qu’est ce qu’on exploite ici , évaluation de la méthode )
Le principe de base est une liaison spécifique entre une protéine et une résine qui est facilement réversible
On exploite une propriété biochimique unique de la protéine d’intérêt
Très bonne méthode pour les deux premières étapes de la purification
114
À quoi sert le bras espaceur ?
À minimiser la liaison avec la matrice et les protéines
115
Quelles sont les avantages de la fusion de GST et les inconvénients aussi ?
Avantages :
Augmente la solubilité de la protéine
Purification facile avec résine glutathion
Elution facile avec un petit ligand ( glutathion)
Inconvénients:
Forment un dimere donc pas favorables pour les essais biologiques
Purification impossible avec dénaturants
Une grosse étiquette ( 250 acides aminés , 26kda
116
Quelles sont les 3 proteases les plus populaires ?
La thrombine , le facteur XA , la TEV
117
Quels sont les avantages et les inconvénients de la fusion poly-histidine ?
Avantages
Purification facile avec la résine du nickel
Elution facile avec un petit ligand ( imidazole)
Purification possibles avec des détergents et dénaturants
Petite étiquette/ tag ( 6 acides aminés)
Inconvénient
Purification impossible avec des antioxydants comme le DTT
Pas bon pour la purification des protéines qui lient les métaux de transition
Augmente la formation de corps d’inclusion
118
Quelles sont les propriétés essentielles pour le compétiteur ?
Liaison spécifique mais aussi liaison facilement réversible ( avec la résine ou l’étiquette tag )
Stable chimiquement et inerte ( pas de réaction )
Pas trop cher
Petite taille moléculaire: séparation par dialyse après purification
119
Pouvez vous parler de la chromatographie par échange d’ions ? (Le principe de base , qu’est ce qu’elle exploite , ses deux formes $
Le principe de base est une interaction entre des ions de charge opposées
Elle exploite les groupes chargés de la protéine d’intérêt.
Les deux formes de base :
- la chromatographie par échanges de cation
- la chromatographie par échange d’anions
120
Comment se décrit la colonne et la résine pour chacune des deux premières étapes de la purification?
Pour la première étape : grosse colonne , résine avec beaucoup de capacité
Pour la deuxième étape : moins grosse colonne , résine plus uniforme avec de plus petites particules
121
Qu’entraîne l’augmentation de la charge nette de la molécule ?
Une augmentation de l’adsorption de la résine
122
Comment provoquer une desorption ?
1) diminuer la charge nette de la molécule par changement de PH
2) Augmenter la concentration d’ions compétitifs ( NaCl , KCl)
123
Qu’est ce qui sera nécessaire après une augmentation de la charge nette de la protéine ?
Une augmentation de la concentration de sels pour la désorption
124
Quels sont les types d’échangeur ? Et citer des exemples pour chaque type
Échangeurs d’anions :
DEAE: diethylaminoethyl
QAE : quaternary aminoethyl
Q : quaternary d’ammonium
Échangeur de cations :
CM: carboxymethyl
SP: sulfopropyl
S: methyl sulfonate
125
Quels sont les types de résine échangeuse d’ions que vous connaissez ?( préciser le type d’échange et la taille de la particule )
1)mini Q anion fort. 3
2)mini S. Cation fort. 3
3) mono Q anion fort. 5
4) mono S. Cation fort 5
5) mono P. Anion faible 5
6) Q sepharose HP anion fort 24-44
7) S sepharose HP cation faible 24-44
8) Q sepharose FF anion fort. 45-165
9) S sepharose FF cation fort 45-165
10) DEAE sepharose FF anion faible 45-165
126
Quels sont les avantages de la chromatographie par échanges d’ions ?
1) une méthode tres flexibles ( ph sel )
2) le choix entre échangeur cationique et échangeur ionique
3) il y’a beaucoup de résines différentes
4) les résines ne sont pas chers
5) purification est possible avec détergents sans charge et en présence d’urée
127
Quelles sont les limites de la chromatographies par échange d’ions ?
Généralement la méthode n’est pas très spécifique
Il n’est pas possible d’utiliser le dénaturant guanidine parce que la guanidine est chargée
Système de chromatographie avec deux pompes est nécessaire pour une performance optimale
128
Comment se passe la séparation avec la chromatographie par filtration sur gel ?
La séparation est basée sur la taille moléculaire
Les gels sont poreux et les protéines pénètrent dans les gels
129
Parmi les 3 étapes de la purification, dans quelles étapes pouvons nous utiliser la chromatographie par filtration sur gel ?
La deuxième et la troisième étape
130
Dans la chromatographie par filtration sur gel , comment se passe la partition des protéines ?
Les protéines sont partionnees entre la phase mobile et la phase stationnaire
131
Quels sont les avantages de la chromatographie par filtration sur gel ?
1)Il y a beaucoup de résine différentes ( tailles de particules écart de séparation)
2) les résines ne sont pas chers
3) la purification est possible avec des détergents et en présence de dénaturants
4)bonne méthode pour la purification des protéines dans les corps d’inclusions
5)l’équipement n’est pas cher possible avec Elution linéaire
132
Quelles sont les limites de la chromatographie par filtration sur gel ?
1) la méthode n’est pas très bonne pour purifier de grandes quantités de protéines
2) les résines ne sont ni très résistantes ni très durables
3) les vitesses d’écoulement sont faibles ( flow rates )
133
Que pouvez vous dire sur la chromatographie en phase inverse ? ( séparation , principe )
1) la séparation est basée sur les interactions hydrophobes
2) le principe est la désorption des protéines avec solvant organique
134
Parmi les 3 étapes de la purification, dans quelles étapes pouvons nous utiliser la chromatographie en phase inverse ?
La 3e étape
135
Comment varie l’adsorption de protéines ?
L’adsorption de protéines est en équilibre réversible et varié selon le changement de polarité du solvant
136
Quelles sont les différentes colonnes que nous pouvons choisir ? Quelles sont les colonnes appropriées pour les petites protéines et les grosses protéines ?
Les différentes colonnes : C18 , C8, C4, C3, C2, C1
Petite protéine : C18
Grosse protéine : C2-C1
137
Quels sont les avantages pour la chromatographie en phase inverse ?
• Il y a plusieurs types de résines qui donnent une très bonne résolution
• Bon pour la purification de protéines dans les corps d'inclusion
• Les résines sont très résistantes et très durables
• Les vitesses d'écoulement sont très variées (faible à vitesse)
138
Quelles sont les limites de la chromatographie en phase inverse?
1) les colonnes sont chères
2) pas bon pour toutes les protéines , spécialement pour les grosses protéines et les protéines très hydrophobes
3) la méthode peut provoquer une dénaturation de la protéine d’intérêt
4) l’équipement est très cher ( HPLC)
139
Quelle méthode utilisée pour la détermination de la pureté de la protéine ?
Electrophorese en gel de polyacrylamide SDS PAGE
140
Quelle méthode utilisée pour la vérification de l’identité de la protéine ?
Spectrométrie de masse , méthode très précise et très sensible mais l’équipement est chère
141
Quels sont les avantages et les limites des méthodes standard pour la purification de l’ARN ?
Avantages
Très bonne résolution
Pas besoin d’instrument de chromatographie
Purification de grosses quantité d’ARN
Limites
Long et fastidieux
Dénature l’Arn de façon systématique
Contamination avec des oligomeres d’acrylamide
142
Que pouvez vous dire sur la purification de l’Arn par chromatographie d’affinité ?
1) quelques nouvelles approches développes offrent une rapidité de purification exceptionnelle
2) toutes ces approches nécessitent l’expression initial de l’ARn de fusion
3) l’ARN de fusion contient l’Arn d’intérêt et le tag
4) le tag contient une séquence spécifique d’arn ayant une forte affinité avec une protéine ou un peptide
5) ces approches nécessitent la fabrication d’une résine avec protéine ou peptide ayant une forte affinité pour le tag
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Quelles sont les étapes de la purification par affinité avec la ARIBO-Tag ?
1) transcription in vitro de L’ARN fusionné à ARIBO
2) Immobilisation de l’ARN
3) Autoclivage avec la glcN6p et Elution de l’Arn
