Introduction et microscopie électronique Flashcards
(143 cards)
1
Q
Définition biologie cellulaire
A
sciences des lois qui régissent les phénomènes communs aux différents types de cellules
2
Q
But biologie cellulaire
A
préciser les liens entre structure et fonction de ce qu’on observe au microscope
3
Q
De quoi est constitué un individu de 70kg ?
A
10^13 cellules et 10^14 bactéries
4
Q
De quoi est constitué une cellule ?
A
- de 3.10^9 paires de bases
- d’un ADN qui sera transcrit en ARNm puis traduit en protéines
5
Q
Combien de gènes s’expriment ?
A
30 000 à 40 000
6
Q
Quel est l’élément de fonctionnalité du génome ?
A
la protéine
7
Q
Combien existe-t-il de protéines différentes ?
A
10 à 20 millions
8
Q
Citez les étapes ayant permis d’arriver à 10^13 cellules
A
- fécondation d’une cellule donnant une cellule-oeuf puis une cellule diploïde
- multiplication et différenciation par cycles cellulaires et apoptoses
9
Q
Définition cellule
A
- unité structurale et fonctionnelle du vivant
- organisme dynamique pouvant produire certaines substances qui vint influencer l’organisme
10
Q
Caractéristiques cellule
A
- possède sa propre homéostasie
- doit répondre aux besoins de l’organisme et être réceptive
- capable de se reproduire
11
Q
Définition homéostasie
A
capacité d’un système à maintenir l’équilibre de son milieu intérieur, quelles que soient les contraintes externes
12
Q
Qu’a permis le microscope optique ?
A
la théorie cellulaire
13
Q
Qu’a permis le microscope électronique ?
A
définir l’ultrastructure des cellules et les organites intracellulaires
14
Q
Théorie cellulaire
A
elle permet de classer les être vivants en procaryotes et en eucaryotes
15
Q
Boucle de la construction d’une protéine
A
un gène code pour un message pour construire une protéine qui assure une fonction régulant le gène
16
Q
Étapes successives nécessaires à l’isolement des cellules ?
A
- dissociation mécanique des tissus
- dissociation enzymatique par des protéines
- Identification des cellules et enrichissement des différentes populations cellulaires
17
Q
Dissociation enzymatique des cellules de la MEC
A
utilisation d’enzymes protéolytiques qui digèrent la MEC
ex. trypsine
18
Q
Dissociation enzymatique des cellules de jonction
A
utilisation des agents chélateurs (=emprisonneurs) du Ca2+
=> dissociation chimique
ex. EDTA
19
Q
Enrichissement des différentes populations cellulaires grâce à …
A
- leurs propriétés physiques (taille, adhérence, densité)
- l’utilisions d’anticorps spécifiques couplés
- à la microdissection laser
20
Q
À quoi peut être couplé un anticorps ?
A
- à un support
- à une coloration fluorescente
21
Q
Principe centrifugation sur gradient de densité ?
A
séparer les cellules d’un tissu selon leur densité
ex. pour les lymphocytes
22
Q
Fibroblastes
A
cellules qui réparent les tissus lésés et sont responsables des fibroses provoquées par le tabac
23
Q
Tabac
A
détruit les alvéoles pulmonaires en épaississant leur paroi, et diminue par conséquent la diffusion d’O2, provoquant des essoufflement etc
24
Q
Principe anticorps couplé à un support
A
l’anticorps monoclonal couplé à un support ou à un colorant fluorescent va venir reconnaître un antigène situé à l’extérieur de la cellule
25
À quoi peut-on retrouver les anticorps libres ou couplé ?
- du collagène
- une colonne de billes de polysaccharides
- une colonne aimantée
26
CD34+
marqueur de surface que l'on retrouve à la surface des cellules souches hématopoïétique
27
Définition cellules souche
cellules peu ou pas différenciées
28
Définition hématopoïétique
cellules du sang qui, lorsqu'elles portent ce marqueur, se différencient en globules rouges, blancs ou en thrombocytes
29
Anticorps couplé à un support dans le cas du CD34+
- l'anticorps, lié à une bille magnétique, va reconnaître le marqueur de surface CD34+ et la cellule souche va venir avec.
- il ne restera plus qu'a venir récupérer avec un allant ce complexe associatif
=> isolation de cellules souches
30
Principe FACS
mesurer les propriétés optiques de cellules transportées dans un liquide vecteur jusqu'à une source d'excitation lumineuse (laser)
31
Définition FACS
Florescence Activated Cell Sorter
32
Que permet le FACS
- analyser les cellules individuellement et de façon automatique
- étudier le cycle cellulaire
- isoler les sous population pures et stériles
- quantifier et répartir les sous populations cellulaires
33
Avantages FACS
- rapidité : 10 000 cellules en quelques minutes
- application aux cellules vivantes
- haut débit
- intégration de plusieurs paramètres
- marquages multiples
- possibilité de remis en culture
34
Application du FACS aux cellules vivantes
on peut trier les cellules en fonction de leur activité cellulaire selon l'angle de diffraction de la lumière qui les traverse
35
Que signifie un petit angle de diffraction en FACS ?
cellule en pleine activité dont la complexité interne est grande => beaucoup de faisceaux déviés
36
Que signifie un grand angle de diffraction en FACS ?
cellule en activité calme dont la complexité interne est plus faible
=> beaucoup de lumière la traverse
37
Que permettent les marquages multiples en FACS ?
d'isoler des populations très spécifiques
38
Fonctionnement FACS
- passage d'une population de cellules dans une chambre où il y a émissions d'un laser
- en fonction de l'excitation et de l'incidence du laser sur la cellule, on détermine des éléments sur la cellule
39
Que se passe-t-il si on utilise un flurorochrome en FACS
le laser va toucher la cellule marquée et émettre une longueur d'onde d'émission dans une autre gamme de fréquence
ce qui permet le repérage des cellules
40
Quelles informations nous donnent le FACS ?
- tailles cellule ; noyau ; REG
- quantité de mitochondries
- complexité interne
- clusters de différenciation
41
Principe microdissection laser
prélèvement de quelques cellules dans une coupe de tissu ou un tissu
42
Combien de types cellulaires la microdissection laser permet-elle d'étudier ?
un seul
ex. épithélium, structure vasculaire)
43
Sur quel tissu est-il inutile d'utiliser la microdissection laser ?
sur les tissus hématopoïétiques
=> ils y sont indépendants
44
Définition culture cellulaire
maintien in vitro des cellules pendant une durée variable
45
Combien de type de milieu de culture existe-t-il ? Lesquels ?
2 :
- milieux classiques
- milieu chimiquement définis sans sérum (SVF)
46
Milieu de culture classique
à une température de 37°C, on peut y mettre des substances nutritives élémentaires et des suppléments pour la division
47
Milieu de culture chimiquement défini
on y met des substances nutritives de base et des facteurs de croissance spécifiques
48
Substances nutritives élémentaires
- eau
- acides aminés
- glucose
- vitamines
- sels/ions
- oligoéléments
49
Suppléments pour la division
- sérum de veau foetal
- hormones
- facteurs de croissance
- protéines
- lipides
50
Substances nutritives de base
- insuline
- transferrine
- albumine
51
Facteurs de croissance
- EGF (endothelial growth factor)
- NGF ( neuronal growth factor)
- IL-2
52
Que peut-on ajouter dans ces milieux stériles ?
un indicateur coloré
ex. rouge phénol
53
Dans quel cas le milieu de culture est-il acide ?
s'il y a division
54
Que permet de détecter l'indicateur coloré ?
des infections bactériennes
=> les bactéries produisent de l'acide lactique qui fait diminuer le pH
55
Élevage dans la stérilité
- 37°
- CO2 à 5%
- manipulé avec un incubateur et sous une hotte
56
Dans quel cas sont utilisés ces milieux de culture stériles ?
- FIV
- vaccins
- thérapie cellulaire
- production de molécules
57
Principe culture primaire
prélèvement d'une cellule dans un organisme pluricellulaire et cultivation in vitro
58
Limites culture primaire
- non immortelle (max 1 semaine)
- phénomène de sénescence
59
Principe culture secondaire
repiquage des cellules dans une nouvelle boîte de culture avec un milieu de culture neuf
60
Quelles propriétés expriment les cellules in vitro ?
celles de leur tissu d'origine
61
Définition lignée
ensemble homogène de cellules dérivant toutes du même précurseur
62
Cellules normales en culture
- prolifération contrôlée
- nombre limité de divisions voire pas de divisions (>raccourcissement des télomères)
63
Cellules cancéreuses en culture
- autonomisées => pas de contrôle, n'écoutent pas l'organisme
- pas d'ancrage nécéssaire, peu de facteurs de croissance, perte d'inhibition totale
- immortelle (télomérase)
- métastases et migration
64
Définition métastase
foyer de cellules cancéreuse
65
Télomérase
enzyme ; complexe ribonucléoprotéique formé de 2 sous unités :
- TERT (protéique)
- TERC ( ARN)
66
Que permettent les cellules isolées à partir de tumeur ?
la création de lignées cellulaires (car possibilité de nombreux repiquages)
67
Comment peuvent évoluer les cellules normales ?
elles peuvent être transformées par des virus ou des mutations oncogènes et devenir immortelles
68
À quoi seraient dus 15 à 20% des cancers selon l'OMS ?
à des virus
69
Que permettent les cultures ?
- obtenir un grand nombre de cellules
- étudier l'influence du milieu
- étudier les interactions cellulaires (co-culture)
- obtenir une colonie
- créer un modèle cellulaire (=tester des médicaments)
70
Objectif clones de cellules mutantes
- étudier le contrôle du cycle de division cellulaire
- production d'anticorps monoclonaux
71
Quelles cellules peut-on prendre comme modèle pour un clone ?
- levures, protophytes eucaryotes
- xénope
72
Pourquoi les levures sont intéressantes en clonage ?
thermosensibles => possibilité d'induire ou d'inhiber les gènes avec la température
73
Pourquoi le xénope est intéressant en clonage ?
possibilité de tester l'impact tératogène des médicaments (car gros oeufs)
74
Comment est formé le phénotype ?
génotype + influence de l'environnement
75
Types de microscopie photonique
- à lumière blanche
- épifluorescence
- confocale
76
Types de microscopie électronique
- à transmission
- à balayage
77
Quelle est la différence entre microscopie électronique et photonique ?
- microscope électronique = faisceau d'électrons
- microscope photonique = faisceau de photons
78
Pouvoir de résolution oeil nu
0,2 mm
79
Pouvoir de résolution microscope optique/photonique
0,2 μm = 200nm
80
Pouvoir de résolution microscope électronique
- 2nm en MET
- 10nm en MEB
81
Quel est le facteur entre la résolution du MO et du ME
facteur 100
82
Taille atome, virus, bactérie, mitochondrie et cellule eucaryote
- atome : 0,2nm = 2Å
- virus : 100nm
- bactérie : 1 μm
- mitochondrie : μm
- cellule eucaryote : 10 à 30 μm
83
Combien vaut 1 μm ?
10^-6 m
84
Combien vaut 1 nm ?
10^-9 m
85
Combien vaut 1Å ?
10^-10m
86
En quelle année fut introduit le ME ?
1940
87
Qu'a permis le MO ?
le développement de la théorie cellulaire en 1838
88
Définition résolution
distance minimale entre deux objets distinguables
89
Formule résolution D
D = 0,61 x (λ/n.sinα)
avec n : plus petit indice de réfraction du trajet optique
α : angle du cône de lumière entrant dans la lentille
90
Comment évolue la résolution en fonction de la longueur d'onde ?
Si λ diminue, la résolution augmente
91
Comment évolue la résolution en fonction de la concentration de lumière
Si n ou α augmente, la résolution augmente
92
Que signifie augmenter le pouvoir de résolution
diminuer la limite de résolution D
93
Principe du microscope photonique
augmentation du contraste grâce à des colorations avec + ou - d'immunomarquage
(possibilité de contraste de phase ou de contraste interférentiel)
94
Carte préparations pour une observation au microscope (p.171)
par coeur
95
La résolution est proportionnelle à ...
la longueur d'onde de la radiation utilisée pour interférer avec les structures
96
Longueur d'ondes des électrons
10^-3 à 1 nm
97
Longueur d'ondes des photons
400 à 700 nm
98
Quelle influence a la vitesse des électrons sur la longueur d'onde
plus la vitesse est élevée, plus la longueur d'onde diminue
99
Que permet la microscopie électronique ?
- voir des objets très petits
- voir des détails
- faire des reconstitutions 3D
100
Quelle préparation nécessite le ME ?
- fixation
- coupe fine (pas de coupe pour le MEB)
- utilisation de métaux lourds
101
Que permet d'observer le MET ?
l'intérieur de la cellules avec les différentes structures, les différents constituants et la surface de l'échantillon
102
Que permet l'observer le MEB ?
des représentations 3D avec relief et profondeur de champ
103
Grossissement MET
1500 à 500 000
104
Limite de résolution MET
2nm
105
Principe MET
faire passer un faisceau d'électrons dans un environnement rempli de vide et à travers une coupe ultrafine d'un échantillon biologique, contrastée par un dépot métallique.
Ce faisceau est ensuite agrandi par des électroaimants et vient former une image sur un écran fluorescent ou sur un film photographique
106
Que permet le vide dans un MET ?
l'accélération des électrons
107
Grossissement MEB ?
20 à 400 000
108
Limite de résolution MEB ?
≥ 10nm
109
Profondeur de champ MEB ?
quelques millimètres
110
Principe du MEB
les électrons sont réfléchis sur l'objet puis repris par un détecteur.
Les dessiccations se font sans rétraction et on y dépose de l'or
111
Définition dessiccation
l'eau est retirée
112
Comment se fait la préparation au MEB ?
- prélèvement
- fixation (glutaraldéhyde)
- déshydratation (acétone)
- métallisation (or et platine)
113
Qu'est-ce qu'on observe au MEB ?
Une image 3D de cellules intactes et de leurs constituants cellulaires
114
Principe cryofracture au MET
- congélation de la cellule à -196°C
(azote liquide)
- séparation des hémicycles-couches de la membrane
- application d'un ombrage et d'une réplique sur chaque moitié
115
Principe fractionnement subcellulaire
separation, isolation et purification des organites et macromolécules pour étudier leurs fonctions
116
Etapes fractionnement subcellulaire
- homogénéisation
- centrifugation
117
Homogénéisation en fractionnement subcellulaire
rupture de la membrane plasmique par :
- choc osmotique ou ultrasons
- choc mécanique (=Potter)
118
Ultrasons
dégraissage agissant sur les lipides
119
Schémas centrifugation p.175
par coeur !!!
120
Comment peut se faire la séparation des organites ?
sédimentation à l'équilibre grâce à un gradient de sucrose : on met plusieurs couches de sucrose de densités différents, les différents organites vont se placer entre les deux couches de densité voisine par ultracentrifugation
121
Définition coefficient de sédimentation
vitesse à laquelle un constituant sédimente : loi de Stockes
> s'exprime en Svedberg (S)
122
Que peut-on utiliser pour analyser la sous partie isolée ?
des enzymes spécifiques de cette fraction
123
Avec quoi le coefficient de sédimentation est-il en relation ?
avec les caractéristiques de taille et de forme des objets
124
Les coefficient de sédimentation sont-il additif ?
non
125
Caractéristiques ADN
- longueur démesurée (1,80m)
- chimiquement monotone
- 6.10^9 nucléotides = 3.10^9 pb
126
Sur quoi agit la technique Southern ?
ADN
127
Sur quoi agit la technique Northern ?
ARN
128
Sur quoi agit la technique Western ?
protéines
129
Étapes techniques Southern, Northern, Western
- électrophorèse
- transfert sur un filtre par capillarité (=blotting)
- hybridation
- révélation
130
Qu'utilisation pour la révélation (Northern, Southern, Western)
- une chromatographie
- une électrophorèse sur gel de polycrymalide en 2D
- un séquençage de protéines (forme et fonction)
131
Comment peut être estimé le poids moléculaire de l'ADN, ARN et des protéines ?
par l'électrophorèse sur gel
132
Principe hybridation des acides nucléiques
une sonde d'ADN est couplée à un radio-isotope ou à un marqueur chimique/fluorescent . Les sondes ne s'hybrident qu'avec les séquences complémentaires
133
Définition stingence
sélectivité
134
Comment peut on augmenter la stingence ?
en augmentant la température ou en diminuant la concentration du gel
135
Principe des protéines chimères fluorescentes
on construit un gène codant pour la protéine d'intérêt en ajoutant de green fluorescent protein (GFP), permettant d'obtenir une protéine fluorescente
136
Transfection des protéines chimères fluorescentes
on introduit le tout dans la cellule avec un vecteur (car la protéine étant chargée négativement, elle a besoin d'aide pour passer la membrane)
137
Que permettent les protéines chimères fluorescentes ?
une visualisation cellulaire, souvent au microscope confocal
138
Que permet l'utilisation de précurseurs ?
des études cinétiques
139
Citez les différents types de précurseurs
- radioactifs
- autre
140
Précurseurs radioactifs et leurs rôles
- 3H-thymidine : l'ADN est synthétisé dans le noyau et y reste
- 3H-uridine : l'ARN est synthétisé dans le noyau et migre dans le cytoplasme
- 3H-leucine : pulse-chalse des protéines du RE vers Golgi
141
Principe flux d'ions
- utilisation d'une pipette en verre pour isoler un canal ionique (=patch)
- électrodes reliés à un système d'enregistrement prenant en compte les variations de tensions
- passage d'ion = potentiel de membrane
142
A quoi sert la technique de flux d'ions ?
à préciser les conditions électro-physiologiques pour l'état d'ouverture ou de fermeture des canaux ioniques
143
La biologie cellulaire est une discipline...
expérimentale
> les résultats se complètent (=combinaison)
> l'évolution est rapide
> les techniques et les connaissances se complexifient
