ispittt Flashcards
(10 cards)
- a) Objasnite djelovanje fizikalnih parametara na aktivnost i stabilnost enzima i njihovu važnost za industrijsku primjenu enzima u biotehnološkim procesima
Glavni fizikalni čimbenici koji djeluju na aktivnost i stabilnost enzima jesu pH i temperatura. pH i temperatura djeluju na kemijske reakcije (ionizacija, disocijacija, topljivost, promjena brzine reakcije, pomicanje kemijske ravnoteže i dr.) i djeluju na katalitičku aktivnost enzima(Km i Vmax), a svime time i na sveukupnu aktivnost enzima.
pH djeluje na ionizacijsko stanje aminokiselina i aktivnost enzima. Tipični izgled krivulje utjecaja pH na aktivnost je zvonolika krivulja (simetrična ili asimetrična s obje strane pH optimuma). Učinak pH je mnogo specifičniji za određeni enzim nego učinak temperature. Npr. dvostruki pikovi pH optimuma mogu pokazati da pripravak ne sadrži samo jedan enzim, već više od jednog enzima sa sličnim katalitičkim aktivnostima. Promjena pH može ireverzibilno denaturirati protein i dovesti do gubitka enzimske aktivnosti pa ga valja održavati konstantnim.
U industrijskim procesima je stabilnost ili aktivnost enzima vrlo različita u ovisnosti o temperaturi te ovisi o vremenu trajanja reakcije. Dva su utjecaja temperature na enzime - povećanje katalitičke aktivnosti i inaktivacija enzima zbog termolabilne proteinske strukture.
Važni podaci za industrijsku proizvodnju jesu brzina inaktivacije enzima i t ½ – vrijeme kroz koje aktivnost enzima opada na polovicu početne vrijednosti (posebno važno kod imobiliziranih enzima). I pH vrijednost i temperaturu potrebno je održavati u optimalnim okvirima, budući da imaju združeni učinak na enzimsku stabilnost i aktivnost. Prilikom skladištenja, enzimi se moraju čuvati na nižim temperaturama u kristalnom ili praškastom obliku. Za industrijsku primjenu enzim mora imati deklariranu aktivnost (obično 12 mjeseci na 4-8C).
- b) Objasnite utjecaj kemijskih supstancija na enzimsku aktivnost.
Nasuprot fizikalnim čimbenicima, koji djeluju nespecifično na proteinsku strukturu enzima, kemijske supstancije djeluju na aktivnost enzima precizno i specifično i često u vrlo malim koncentracijama. Pri tom ih mogu aktivirati, deaktivirati, stabilizirati i inhibirati. Pritom, aktivatori i deaktivatori nisu stabilizatori ili inhibitori.
- AKTIVACIJA-iskazivanje maksimalne enzimske akti. u prisutnosti supstance aktivatora (nije supstrat). Aktivatori iskazuju učinak djelovanjem na različita aktivna mjesta na enzimu i vrlo često su metalni ioni (potrebni u vrlo niskim koncentracijama).
- DEAKTIVACIJA je uklanjanje pozitivnog djelovanja aktivatora supstancijama (deaktivatorima) onemogućavanjem djelovanja ili uklanjanjem aktivatora. Primjer deaktivacije jesu detergenti i metaloproteinaze(ne mogu raditi bez metalnih iona, a detergenti imaju supstance koje ih vežu).
Stabilizatori enzimske aktivnosti vrlo su važni u komercijalnoj enzimologiji. Stabilizacija se, ovisno o vrsti enzima, vrši supstratom (viša T primjene i duži vijek trajanja enzimskog pripravka), zatim proizvodom (pri kraju reakcije sačuvana aktivnost), hidrolizatima proteina i metalnim ionima. Inhibitori su specifične supstancije koje u niskim koncentracijama smanjuju brzinu enzimom katalizirane reakcije. Važna svojstva inhibitora jesu reverzibilnost i specifičnost djelovanja. Reverzibilni inhibitori enzimske aktivnosti se obično vežu s enzimom (slično kao supstrat), ali umjesto da se prevode u produkt, zaustavljaju stupanj enzimskog kompleksa i tvore ravnotežni sustav s enzimom i supstratom. Tipovi reverzibilne inhibicije: kompetitivna, nekompetitivna, akompetitivna, miješana, djelomična, inhibicija supstratom i inhibicija proizvodom. Njihovo djelovanje se primjerenim metodama uklanja u industrijskim enzimskim procesima. Ireverzibilni inhibitori enzimske aktivnosti vežu se u aktivnom mjestu enzima i tvore kompleks koji ne disocira, obično kovalentnom vezom. Razgradnja EI kompleksa može se postići samo kemijskom reakcijom, te se zato ne može obnoviti enzimska aktivnost. Zbog toga predstavljaju najjače inhibicijske supstancije (nervni otrovi, organofosforni insekticidi, alkilirajući agensi
- Nacrtajte opću shemu izolacije enzima i usporedite postupke izolacije i pročišćavanja
ekstracelularno i intracelularno proizvedenih enzima!
SHEMA
Enzimi se iz mikroorganizma producenta mogu izlučiti u medij (ekstracelularni enzimi) ili pak ostaju zarobljeni u stanici (intracelularni enzimi). U slučaju intracelularnih enzima, pročišćavanje i izolacija su mnogo kompleksniji i zahtjevaju više koraka jer je stanice potrebno razarati kako bi im se sadržaj oslobodio u medij. Nakon razaranja slijede metode pročišćavanja enzima iz medija koji sadržava cijeli sadržaj stanice, pa zbog toga uključuje i izdvajanje nukleinskih kiselina te odvajanje željenog enzima iz smjese sa puno više proteina za razliku od pročišćavanja ekstracelularnih enzima. Za pročišćavanje i izolaciju ekstracelularnih enzima stanice nije potrebno razarati, već se centrifugom izdvoje iz medija, a dalje se enzimi pročišćavaju iz zaostalog supernatanta, čiji je sastav daleko manje složeniji, sa manje proteina i bez nukleinskih kiselina. Osim toga, pročišćavanje intracelularnih enzima dodatno komplicira razaranje koje znatno povećava mogućnost denaturacije enzima i gubitka aktivnosti.
- Objasnite na konkretnom primjeru razliku između kemijskom ravnotežom i kemijskom
kinetikom kontroliranog industrijskog enzimskog procesa?
Da bi enzimski proces bio uveden kao industrijska proizvodnja, mora biti kompetitivan i imati prednosti pred drugim, alternativnim procesima. To se najbolje može procijeniti kroz određivanje količine proizvoda i nusproizvoda koja nastaje biokatalizom supstrata s određenom količinom enzima u određenom vremenu. Obzirom na taj cilj, enzimski se procesi dijele u dvije kategorije:
1. Kemijskom ravnotežom kontrolirani enzimski procesi – maksimalna koncentracija proizvoda postiže se na kraju enzimskog procesa (kemijska ravnoteža ne ovisi o svojstvima enzima, ali ovisi o pH i temperaturi)
2. Kemijskom kinetikom kontrolirani enzimski procesi – maksimalna koncentracija proizvoda ovisi o svojstvima enzima, pH i temperaturi
* U oba tipa enzimskog procesa maksimalna koncentracija proizvoda ovisit će o koncentraciji enzima, svojstvima enzimskog procesa (endo- i egzotermni procesi, ovisnosti konstante)
Enzim -galaktozidaza, osim hidrolize laktoze (Gal + Glu), katalizira i kinetički kontroliranu sintezu tri- i tetrasaharida (prebiotičkih supstrata) koji mogu biti ciljani proizvodi enzimskog procesa. Kad je sva laktoza potrošena, dolazi do hidrolize tri- i tetrasaharida, pa nastaju nepoželjni nusproizvodi – monosaharidi. * Ako su ciljni proizvodi primjenom -galaktozidaze monosaharidi (Glu + Gal) kao zaslađivači, radi se o kemijskom ravnotežom kontroliranom enzimskom procesu, a kao nusproizvodi mogu nastati tri- i tetrasaharidi. * Za oba slučaja vrijedi da se odabirom -galaktozidaze poželjnih svojstava i optimiranjem procesnih parametara može svesti na najmanju mjeru nastajanje nepoželjnih nusproizvoda i maksimalna koncentracija željenog proizvoda
- Navedite primjere nekih uobičajenih anorganskih i organskih nosača za imobilizaciju
enzima! Objasnite koje su prednosti novih materijala kao nosača za imobilizaciju
enzima!
Neki uobičajeni anorganski nosači jesu porozno staklo (SiO2), porozni silikati (SiO2) i aluminosilikati, a neki uobičajeni organski nosači jesu polisaharidi (derivati agaroze, unakrsno vezani dekstrani, celuloza), proteini (želatina) i biomasa (npr. bakterije) i sintetski poliakrilamid i polivinilacetat.
Novi materijali kao nosači za imobilizaciju enzima sintetizirani su iz kombinacija prekursora anorganskog, organskog i miješanog anorganskog i organskog podrijetla (hibridni materijali). Prednost im je ta da su dizajnirani tako da imaju stabilnost, velik afinitet za enzim i funkcionalne skupine kompatibilne strukturi proteina. Enzimi se na njih vežu uglavnom kovalentnim vezama što osigurava višekratnu ponovnu upotrebu i radnu stabilnost biokatalitičkog sustava potrebnu za industrijsku primjenu. Novi materijali uključuju otpadne biomaterijale, nanomaterijale (promjera do 30 nm), sintetičke smole, mezoporozne i elektropredene materijale.
- Navedite i shematski prikažite 9 tipova uobičajenih reaktora za biokatalizu, primjenom
slobodnih ili imobiliziranih enzima!
shema jbg neam premium brainscape pa nerem stavljat slike upsy
- Objasnite kako difuzijska ograničenja utječu na kinetiku reakcije s imobiliziranim
enzimom kroz parametre kao što su difuzijski koeficijent, faktor učinkovitosti
(djelotvornosti) դ i i Thieleov modul (Φ). Kako se može postići smanjenje internih
difuzijskih ograničenja?
Kada je enzim imobiliziran, supstrat mora difundirati iz okolne otopine kroz stacionarni film (nepoketni sloj) tekućine do površine nosača, te ako je nosač porozan, u pore nosača pa difuzijski proces može ograničiti brzinu reakcije. Pri primjeni imobiliziranih enzima (vezanog na čvrsti nosač) treba uzeti u obzir ograničenja u prijenosu mase. Veća razlika u koncentraciji supstrata u otopini i tankom sloju osigurava bržu reakciju.
Lokalno (mjesno) smanjenje difuzijskog koeficijenta (D, m2s -1) mjerenog u okolnoj tekućini zbog poroznosti (Є) i zavojitosti (τ) pora čestice se izražava jednadžbom:De=(Dϵ)/τ
Brzina reakcije u malom dijelu (sekciji) čestice može se izraziti Michaelis Menteničinom kinetikom
Stupanj ograničenja prijenosu mase se često izražava faktorom učinkovitosti (djelotvornosti) դ. Faktor učinkovitosti դ ovisi o različitim parametrima: svojstvima izabranog enzima, načinu provođenja procesa imobilizacije, uvjetima tijekom trajanja enzimske reakcije.
Signifikantne varijable koje djeluju na veličinu i ograničenje interne difuzije su kvantificirane Thieleovim modulom (Φ) koji se za enzime izražava u obliku (bezdimenzijski): Φ=Lλ=LVmax/(KmDe) L = polovina debljine čestice.
Smanjenje internih difuzijskih ograničenja postiže se: a) uporabom niskomolekularnih supstrata b) uporabom velikih koncentracija supstrata c) primjenom malih koncentracija enzima d) primjenom malih vrlo poroznih čestica nosača u kojima su pore velike, nisu zavojite i međusobno su povezane e) vezanjem enzima isključivo na površinu čestice.
- Objasnite industrijsku primjenu imobiliziranog enzima za odvajanje L-aminokiselina iz
racemične smjese N-acil-DL-aminokiselina!
Kemijski sintetizirana racemična smjesa N-acil-DL-aminokiselina se razdvaja selektivnom hidrolizom N-acil-L-aminokiselina imobiliziranom L-aminoacilazom pri pH 8,5 te se dobije slobodna Laminokiselina i nehidrolizirana N-acil-D-aminokiselina. Produkt se lako razdvoji diferencijalnom kristalizacijom (razlika u broju naboja molekula: - ili + i -). Acilirana D-aminokiselina je nus-proizvod koji se zatim kemijski racemizira.
Enzim se može imobilizirati na anionskim izmjenjivačkim smolama (DEAE-sefadeks), vrijeme poluživota aminoacilaze je oko 65 dana pri 45°C i pri primjeni PFR, vrijeme zadržavanja je 30 min. U novije vrijeme se koristi i membranski reaktor sa šupljim vlaknima. Reaktori oba tipa se mogu reaktivirati jednostavnim dodatkom enzima in situ. Enzim se koristi za priređivanje: metionina, alanina, valina, fenilalanina.
- Navedite primjere „nosivih“ biosenzora za kontinuirano praćenje fizioloških parametara
i primjenu u medicini!
*Biosenzor baziran na grafenu - apliciran na zubnu caklinu, za određivanje bakterija
* Biosenzor u formi kontaktne leće - za određivanje glukoze u suzama
* Biosenzor za usnu šupljinu - određuje mokraćnu kiselinu u slini
* Biosenzor kao privremena tetovaža – za praćenje koncentracije glukoze
*Mikrofluidni senzor - za određivanje elektrolita i metabolita u znoju - laktata, glukoze
*Kolorimetrijski biosenzor - za određivanje elektrolita i metabolita u znoju - laktata, glukoze
* Integrirani biosenzor - multifunkcionalni biosenzor za analizu znoja in situ - laktata, glukoze
*Bežični biosenzor na bazi naočala za određivanje elektrolita i metabolita u znoju
* Na grafenu temeljen biosenzor za znoj s termoreaktivnim mikroiglama za praćenje i terapiju dijabetesa
* „Nosivi” biosenzor u formi tetovaže na koži za neinvazivno praćenje alkohola u induciranim uzorcima znoja.
- Objasnite prednosti industrijske primjene ekstremno termofilnih bakterija i njihovih
enzima.
- općenite prednosti: manja viskoznost medija, čime se povećava kvaliteta miješanja i omogućuje lakša separacija tekuće-kruto. Veća topljivost većine reaktanata i ubrzana difuzija pruža mogućnost rada s većim koncentracijama reaktanata.
- produktivnost bi se povećala s povećanjem brzina reakcija (organizma ili enzima).
- uzgoj termofilnih bi bio jeftiniji od uzgoja mezofilnih bakterija zbog smanjenih ulaganja u opremu za izmjenu topline. Temperaturni gradijenti bi bili dovoljno visoki, te bi se kontrola temperature provodila samo hlađenjem.
- uzgoj termofilnih bakterija bi bio jeftiniji od uzgoja mezofilnih bakterija zbog znatno smanjenih problema kontaminacije.
- reaktori za termofilne enzime ne bi bili izloženi kontaminacijama.
- zbog veće stabilnosti enzima, povećali bi se njihovi prinosi, što je vrlo bitno pri pročišćavanju enzima.
- izolacija i pročišćavanje termofilnih enzima bi se moglo provoditi pri sobnoj temperaturi.
- termostabilni enzimi su općenito otporniji na denaturirajući učinak detergenata i organskih otapala, te je moguća upotreba viših koncentracija reaktanata i djelotvornije čišćenje sistema s organskim otapalima.
- rad s anaerobnim kulturama bi bio lakši zbog manje topljivosti kisika.
- (Ekstremni) termofili ne bi trebali biti patogeni.
- preferiranje termofilnih mikroorganizama zbog: lakšeg
odvođenja topline tijekom biosinteze, rjeđe kontaminacije pri
uzgoju, enzimi su termostabilniji pri uporabi - optimalna termperatura rasta i sinteze enzima često nisu iste
