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BIOLOGÍA MOLECULAR > IVd. Secueciación de proteínas y cristalografía > Flashcards

IVd. Secueciación de proteínas y cristalografía Flashcards

(72 cards)

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1
Q

Aportación de Frederick Sanger

A

determinar la secuencia de AA de las cadenas polipeptídicas de la hormona insulina

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Q

Si una proteína se aisla…

A

puede analizarse para encontrar la secuencia de AA que la conforman

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3
Q

Flujo de trabajo

A
  1. extracción de proteínas
  2. separación de las proteínas
  3. procesamiento para secuenciación
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4
Q
  1. extracción de proteínas
A

cuantificacióon

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Q
  1. separación de las proteínas
A

SDS PAGE
2D-criterio de pureza- cromatografía de exclusión molecular, de afinidad, de intercambio iónico

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6
Q

Procesamiento para secuenciación

A
  • agentes reductores
    -alquilación de cisteínas
    -hidrólisis
    -digestiones
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7
Q

aliminan los puentes disulfuro

A

agentes reductores

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8
Q

evitar puentes disulfuro

A

alquilación

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9
Q

Qué permite la hidrólisis completa

A

determinar cuales AA están presentes y en qué proporción

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10
Q

Digestiones ondividuales con dos diferentes agentes para obtener…

A

péptidos menos 3KDa
purificación de los fragmentos y secuenciación
determinación de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales

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11
Q

En la especificidad de algunos métodos para la fagmentación de cadenas polipeptídicas, todos son protesas excepto…

A

el bromuro de cianógeno

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12
Q

Dónde puede ocurrir la ruptura

A

en el extremo carboxilo C o en el amino N del aa indicado

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13
Q

Secuenciación de proteínas

A

reacciones para identificar el aminoácido N-t

espectrofotometría de masas

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14
Q

reacciones para identificar el aminoácido N-t

A

sanger
edman

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15
Q

Espectrofotometría de masas

A

MALDI
ESI
MS/MS

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16
Q

Secuenciación de Sanger

A

reactivo 2,4-dinitro-fluoro-fenilo

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17
Q

Degradación de Edman

A

reactivo de Edman: fenilisotiocianato

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18
Q

De dónde se obtiene la feniltiohidantoína

A

del aa N-terminal y queda el resto del péptido intacto

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19
Q

Dónde se empleó la degradación de Edman

A

en secuenciadores automáticos

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20
Q

Los secuenciadores automáticos solo pueden secuenciar…

A

los primeros 40 aa del extremo N-t

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21
Q

Por qué solo se pueden secuenciar 40aa

A

porque el rendimiento de la reacción no es del 100% y se pierde péptido poco a poco, al final no queda nada

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22
Q

En la degradación de Edman, se puuede hidrolizar la proteína original y…

A

realizar la secuenciación de cada fragmento por separado

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23
Q

En el perfil de alución de los PTH-aa

A

entre + pico, hay + aa

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24
Q

Se origina cuando la secuencia de la proteína es cortada

A

un péptido específico

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25
Los valores exactos del conjunto de las masas moleculares de los péptidos es...
la representación única de la estructura primaria de una determinada proteína
26
Espectro de masas
información BIDIMENSIONAL que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en función de la relación masa/carga
27
Qué evidencia el espectro de masas
la relación masa/carga de los péptidos analizamos y se convierte en una huella digital de la proteína analizada
28
Si la muestra inicial analizada no esta constituida únicamente de una sola proteína sino de una mezcla...
permite identificar cuales serían esas proteínas que conforman la mezcla
29
Espectrofotometría de masas
ionización de los componentes de la muestra en fase gaseosa
30
Separación de las especies iónicas resultantes de acuerdo a su...
relación masa/xarga eléctrica utilizando campos electromagnéticos en el vacío
31
La espectrofotometría de masas permite...
deducir la masa de la molécula con mucha precisión
32
m/z no se podía aplicar para...
macromoléculas ya que el calentamiento para transitar a fase gaseosa las descomponía
33
Componentes básicos de la espectrofotometría de masas
sistema de ionización analizador de masas detector de iones
34
Sistema de ionización
vaporización e ionización a partir de moléculas NEUTRAS
35
Analizador de masas
separación de los iones en función de su relación masa/carga
36
Deterctor de iones
detección de los iones formados y registro adecuado de la información
37
MALDI
muestras ne fase sólida
38
MALDI fases
1.irradiación 2.disrupción 3.ionización y desolvación
39
ESI
muestras en fase líquida
40
Analizadores de masas
TOF TOF-TOF Trampa de iones tridimensional Q
41
TOF
La muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de tiempos de vuelo
42
en TOF, para una energía determinada, los iones pesados...
se deslizan lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
43
TOF-TOF
se puede abrir y cerrar rápidamente la compuesta de paso entre el primer tubo y el TOF tube
44
En el TOF-TOF, el aislamiento ...
no funciona cuando es espectro demasiado congestionado
45
Trampa de iones
iones atrapados aplicando una radiofrecuencia en la dirección radial y un potencial continuo repulsivo en lente de salida
46
Cómo salen los iones de la trampa
por un voltaje auxiliar
47
Quadrupolo
cuatro barras matálicas de sección circular o hiperbólica, rectas y paralelas
48
En Quadrupolo, por pares alternos...
se aplica un potencial constante V que origina un movimiento lateral iscilante de los iones
49
Funciona como un verdadero filtro de masas
Qudrupolo
50
Arreglos MALDI
TOF
51
Arreglos ESI
Q trampa de iones
52
MS/MS
dos espectrómetros en tandem
53
Detección de iones e interpretación
se detecta el flujo iónico, se amplifica y se transmite a la computadora
54
En el eje abscisas (X)
la masa de los iones
55
En el eje de las ordenadas (Y)
la intensidad (abundancia)
56
El espectro de masas evidencia...
el número de componentes en la muestra y el peso molecular de cada componente
57
Cristalografía de rayos X
para determinar la estructura TRIDIMENSIONAL de una macromolécula mediante análisis del patrón de difracción de los rayos X por un compuesto cristalino
58
La cristalografía de rayos X determina...
la separación de los átomos de una red cristalina midiendo ubicaciones de manchas producidad en una película fotográfica
59
Resolución de forma general
distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas
60
De qué depende la resolución
de la longitus de onda de la luz
61
A menor longitud de onda de la luz...
mayor resolución
62
Un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede utilizarse para...
examinar detalles estructurales más pequeños que su propia longitud de onda
63
El espectro electromagnético lo podemos ver entre
400 - 750 nm
64
Los rayos X tienen longitudes de onda comparables a las...
distancias atómico-moleculares a 10 picómetros
65
Se producen al someter una carga eléctrica a una aceleración
rayos X
66
Cómo es la emisión de los e de la macromolécula
en todas direcciones
67
Interferencia constructiva
en la pantalla aparece una mancha
68
Interferencia destructiva
en la pantalla NO hay señal
69
La amplitus de onda aumenta cuando...
se encuentran en fase
70
Regiones brillantes
interferencias constructivas
71
Regiones oscuras
interferencias destructivas
72
Las distancias de las manchas son...
inversamente proporcional a las distancias en la red real

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