Va. Extracción, cuantificación y purificación de AN Flashcards
(52 cards)
Primer paso en la tecnología del DNA recombinante
aislamiento del DNA
extracción de DNA genómico
- muestra de células
añadir buffer de lisis para mantener pH, romper membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
- muestra de células
- precipitación de proteínas
- precipitación del DNA con alcohol frío y sal
- lavados
- resuspensión en agua libre de nucleasas
-cuantificación y determinación de la pureza
Qué contiene el buffer de lisis
50 mM tris-HCl
pH 8
Buffer para mantener el pH en el cual el DNA se mnntiene estable y con carga negativa
50 mM tris-HCl
1% SDS
detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA
desnaturaliza proteínas
Qué pasa cuando el SDS entra en contacto con la célula
captura los lípidos y las proteínas
Qué es la proteinasa K
una seriana proteasa
Cuando está activa la proteinasa K
bajo condiciones desnaturalizantes
En dónde se encuentra activa la proteinasa K
sobre proteínas nativas y desnaturalizante
Qué inactiva la proteinasa K
RNAsas
DNAsas
Qué incrementa la proteinasa K
la pureza del DNA
la calidad / cantidad de DNA no degradado
Con qué se pueden precipitar las proteínas
con acetona
En la precipitación de proteínas, dónde se encuentra el pellet
en el precipitado
En la precipitación de proteínas, dónde se encuentra el ácido nucleico
sobrenadante
Qué se necesita para la precipitación del DNA
alta concentración de sales
alcohol frío
Neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfatos
los iones Na+
En la precipitación del DNA, las moléculas de DNA se juntan o se separan
se juntan
El DNA NO es soluble en …
etanol
Polaridad RNA >
DNA
RNA no precipita
Lavados
etanol al 75% remueve sales e impurezas
NO DISUELVE DNA
Resuspensión del DNA
se solubiliza en agua libre de nucleasas
Coeficiente para la determinación de la pureza
260/280
Pureza DNA óptima
1.8-2
pureza - contaminación con RNA
> 2.1
