Labo 2 théorie : préparation d'ADN 2 Flashcards
Extraction de l’ADN cellulaire : Quand est-il nécessaire de briser les cellules avant de procéder à l’extraction de l’ADN?
Quand on fait affaire à des cellules végétales et de certains champignons qui ont entourées d’une paroi cellulaire.
Extraction de l’ADN cellulaire : Avec quoi est ce que la paroi cellule des levures est-elle digérée?
C’est avec l’enzyme lyticase (c’est une zymolyase).
Extraction de l’ADN cellulaire : La lyticase est isolée de quoi dans la nature?
D’un actinomycète.
Extraction de l’ADN cellulaire : Qu’est ce que possède la lyticase?
De l’Endo ß-1,3 glucanase;
Des protéases.
Les deux hydrolysent la paroi cellulaire de la levure.
Extraction de l’ADN cellulaire : Les méthodes d’extraction des acides nucléiques sont classés en 3 principales classes. Selon quoi sont-elles classées?
Selon le principe auquel elles font appel.
Extraction de l’ADN cellulaire : Quelles sont les 3 classes de méthodes d’extraction des acides nucléiques?
- Méthodes utilisant des solvants non organiques (ex. sels)
- Méthodes utilisant des solvants organiques (ex. phénol-chloroforme)
- Méthodes basées sur l’utilisation de microcolonnes de résines échangeurs d’ions (ex. produits commerciaux).
Extraction de l’ADN cellulaire : Les méthodes d’extraction et de purification des acides nucléiques sont basées sur quoi?
Sur la propriété qu’ont les particules de silice d’adsorber sélectivement les acides nucléiques.
Extraction de l’ADN cellulaire : Les solutions de lavage permettent de faire quoi?
De se débarrasser des contaminants tels que l’hémoglobine, les protéines plasmiques ou les ions Fe2+.
Extraction de l’ADN cellulaire : Quelle est l’autre méthode de purification des acides nucléiques pour les quantités industrielles?
C’est de centrifuger l’homogénat en gradient de densité.
Extraction de l’ADN cellulaire : En quoi consiste la centrifugation de l’homogénat en gradient de densité?
C’est quand on centrifuge à haute vitesse l’échantillon brut dans une éprouvelle contenant un gradient de densité formé par une solution de CsCl. Lors de la centrifugation, les macromolécules présentent dans la solution de CsCl forment des bandes distinctes selon leur densité.
Extraction de l’ADN cellulaire : En présence de quoi est ce que la protéinase K digère les cellules quand on veut préparer l’ADN entier de la levure?
Ça se fait en présence d’EDTA et d’un détergeant tel que les SDS suivi d’une déprotonisation utilisant une solution saline.
Extraction de l’ADN cellulaire : Chez la levure, suite à la préparation de l’ADN total par une digestion des cellules, l’ARN contaminant est éliminé comment?
Par une digestion avec l’enzyme RNase.
Extraction de l’ADN cellulaire : Chez la levure, suite à la préparation de l’ADN total par une digestion des cellules, et suite à l’élimination de l’ARN contaminant, que doit-on faire avec l’ADN?
On le précipite avec l’alcool éthylique ou de l’isopropanol.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Avec quoi est ce que l’on peut déterminer la pureté et la concentration de l’ADN dans une solution?
À l’aide de la spectrophotométrie.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Lors de la spectrophotométrie, l’absorbance de la solution à une longueur d’onde de 260 nm nous indique quoi?
La présence d’acides nucléiques dont l’ADN.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Lors de la spectrophotométrie, l’absorbance à 280 nm nous révèle quoi?
La présence de protéines.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Quel est le rapport que l’on doit faire pour nous indiquer s’il y a présence de protéines?
C’est le rapport entre les lectures obtenues à 260 nm et à 280 nm.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Le rapport 260/280 devrait être supérieur à quoi?
1,75.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Si le rapport260/280 est plus faible que 1,75 , ça indique la présence de quoi?
De protéines.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Que ce passe-t-il s’il y a des protéines dans la solution d’ADN?
Il va falloir refaire à nouveau l’extraction des acides nucléiques.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Si le rapport 260/280 est autour de 2,0 , ça nous indique quoi?
Qu’il y a contamination par l’ARN (qui absorbe aussi à 260nm.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : L’absorbance à 260 nm d’une extraction d’ADN ayant subi un traitement à la RNase n’a pas toujours seulement de l’ADN. Pourquoi?
Car le traitement ne fonctionne pas toujours bien.
Si le rapport 260/280 est supérieur à 2,5 — 3,0 , ça nous indique quoi?
Que la solution pourrait être contaminé par une ou des substance(s) non identifiée(s) qui absorbent aussi à 260 nm.
Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Comment fait-on pour déterminer si la solution est contaminée par de solvants organiques, que doit-on faire?
Il faut prendre une troisième lecture à 230 nm et faire un rapport 260/230. Ce rapport devrait d’approcher de 2 S’il y a absence de contamination.
