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Labo 3 théorie : les enzymes de restriction Flashcards

(87 cards)

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1
Q

Les enzymes de restriction : Les enzymes de restriction sont importants dans quelles techniques de biologie moléculaire? (4)

A
  • Cartographie physique de gènes ou d’ADN complémentaire
  • Transferts de type Southern
  • Clonage moléculaire
  • analyse de séquences d’ADN.
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Q

Les enzymes de restriction : Comment appelle-t-on les produits de la digestion d’un génome ou d’un segment d’ADN par une enzyme de restriction?

A

Des fragments de restriction.

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3
Q

Les enzymes de restriction : Comment est ce que les fragments de restriction peuvent être séparés selon leur taille?

A

Par électrophorèse.

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4
Q

Les enzymes de restriction : Qu’est ce que les enzymes de restriction (qui sont des endonucléases) peuvent faire?

A
  • Reconnaissent des sites particuliers sur l’ADN bicaténaire et coupent la molécule à ces sites.
  • Couper l’ADN à des sites de quatre à huit paires de bases qu’elles reconnaissent spécifiquement.
  • Digérer l’ADN étranger provenant d’une infection ou d’une transformation.
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5
Q

Les enzymes de restriction : Qu’est ce que les enzymes de restriction (qui sont des endonucléases) ne peuvent pas faire?

A
  • Incapable de couper leur propre ADN qui est protégé par des groupements méthyles aux sites de reconnaissance.
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6
Q

Les enzymes de restriction : C’est quoi un palindrome?

A
  • C’est une suite de 4 ou 5 acides nucléiques qui se lit de façon identique sur les deux brins.
  • Ils ont un axe de symétrie rotatoire au centre de leur séquence.
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7
Q

Les enzymes de restriction : Dans un palindrome, quand le site de coupure correspond à l’axe de symétrie, comment appelle-t-on l’extrémité libérée des fragments de restriction?

A

“Franche”

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8
Q

Les enzymes de restriction : Dans un palindrome, on dit que l’extrémité coupée est cohésive quand quoi?

A

Quand le site de coupure n’est pas dans l’axe de symétrie.

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9
Q

Les enzymes de restriction : Quelle est la particularité des extrémités cohésives?

A

Elles peuvent se réassocier par liaisons hydrogène entre les bases complémentaires libres.

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10
Q

Les enzymes de restriction : Que font les enzymes de restriction de type II ?

A

Ils se lient et coupent des séquences spécifiques de l’ADN double brin.

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11
Q

Les enzymes de restriction : Les enzymes de restriction vont reconnaitre des suites de combien de nucléotides?

A

4, 5 ou 6 nucléotides.

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12
Q

Les enzymes de restriction : Avec quelle solution est ce que la digestion de l’ADN est effectuée?

A

Avec une solution tampon dont la composition en sel varie selon l’enzyme. (Concentration 10X est fournie par le manufacturier)

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13
Q

Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps est ce que la plupart des digestions sont effectuées?

A

à 37°C pendant 1 à 2 heures.

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14
Q

Les enzymes de restriction : Comment est-il possible d’effectuer une digestion en moins de 15 minutes?

A

Avec le développement de tampons plus performants et en les combinants avec des enzymes de restriction génétiquement modifiées.

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15
Q

Les enzymes de restriction : Une unité d’enzyme peut normalement digérer combien de µg d’ADN dans 1 heure?

A

1 µg

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16
Q

Les enzymes de restriction : Si on veut faire la digestion complète de l’ADN et en particulier si l’échantillon n’est pas très pur, quelle quantité d’enzyme doit on ajouter?

A

Une quantité 2 à 4 fois supérieure.

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17
Q

Les enzymes de restriction : Quelle est la condition pour que l’ADN puisse se faire digérer avec plus d’une enzyme à la fois?

A

Il faut que les enzymes soient actives dans la même solution tampon.

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18
Q

Les enzymes de restriction : Si on veut digérer l’ADN avec plus d’une enzyme et si les enzymes requièrent des solutions tampon différentes, quelles sont les 2 démarches possibles?

A
  1. Choisir une seule solution tampon qui permet une digestion de plus de 50% avec les deux enzymes
  2. Digérer avec la première enzyme dans la solution tampon appropriée. Après une heure, l’ADN est précipité, solubilisé dans la solution tampon recommandée et ensuite la deuxième enzyme est ajoutée.
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19
Q

Les enzymes de restriction : Lors de la digestion, si l’échantillon est trop dilué ou si les enzymes doivent être éliminés pour procéder à d’autres manipulations, que doit-on faire?

A

Une nouvelle précipitation!

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20
Q

Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps les enzymes sont-elles actives?

A

De 1 à 5 heures à 37°C.

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21
Q

Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps doit-on incuber l’ADN si on veut inactiver complètement les enzymes (note: ça ne fonctionne pas pour toutes les enzymes)?

A

Pendant 10 minutes à 65°C ou à 80°C.

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22
Q

Les enzymes de restriction : Quelle est la deuxième réaction qui doit suivre l’utilisation d’une enzyme de restriction thermostable?

A

C’Est une dé-protéinisation par le phénol chloroforme à l’aide d’une solution saline (cours 2).

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23
Q

Les enzymes de restriction : Quelles sont les précautions à prendre avec les enzymes de restriction?

A
  • Il faut absolument les conserver à -20°C.
  • Quand on veut les utiliser, il faut les sortir et les placer sur la glace.
  • Il faut ensuite prélever le volume et le remettre immédiatement à -20°C.
  • Éviter de contaminer les enzymes en utilisant toujours un embout propre à chaque prélèvement.
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24
Q

Les enzymes de restriction : Quand on digère un court fragment d’ADN (plasmide, un phage, virus, fragment PCR, etc.) on obtient un certain nombre de fragments de longueur déterminé. Pour estimer le nombre de fragments potentiels ou le nombre de coupures qui peuvent être obtenus suite à une digestion par une enzyme de restriction, il faut connaitre quoi? (3 choses).

A
  • Connaître le nombre de bases que contient l’ADN.
  • Connaitre le nombre de paires de bases qui sont reconnues par l’enzyme
  • Connaitre la longueur en paire de bases du fragment de départ.
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25
Les enzymes de restriction : Quand on veut estimer le nombre de fragments potentiels ou le nombre de coupures qui peuvent être obtenus suite à une digestion dans un court fragment d’ADN et que l’on connait les 3 choses que l’on doit connaitre, que faire par la suite?
Il faut prendre le nombre de bases et l’élever à la puissance du nombre de paires de bases reconnues par l’enzyme = ceci nous donne le nombre de paire de bases potentiel pour que se reproduise l’alignement de la même séquence de pb. Il suffit de diviser le nombre de pb du fragment de départ par ce chiffre.
26
Les enzymes de restriction : Quand on veut digérer l’ADN génomique d’un organisme, on obtient quoi sur un gel d’agarose?
Un ensemble de fragments de longueur variable qui donne l’allure d’une distribution hétérogène de fragments après la migration sur gel d’agarose.
27
Les enzymes de restriction : Après la migration sur gel d’agarose, que représente la présence de bandes d’épaisseur distincte à travers l’ADN hétérogène?
À des séquences qui sont répétées plusieurs fois.
28
Les enzymes de restriction : Après la digestion et suite à la migration sur gel d’agarose, comment fait-on pour déterminer la présence de contaminants d’ARN?
On repère facilement les fragments de l’ARN ribosomal par des bandes plus intenses sur le gel.
29
Les enzymes de restriction : Après la digestion et la migration, quelle est la meilleure indication qu’un ADN génomique sans contaminants d’ARN est bien digéré?
C’est avec la présence de fragments de longueur hétérogène (traînée).
30
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Que permet la PRC?
Ça permet de sélectionner et d’amplifier à volonté n’importe quelle séquence à partir d’un mélange de fragment d’ADN.
31
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Pour faire la PCR, que doit-on mélanger ensemble pour que ca fonctionne?
- Deux amorces (oligonucléotides) complémentaires aux extrémités du fragment d’ADN qu’on veut amplifier. (en grand excès) - Des dNTPs - Tampon réactionnel - Solution de MgCl2 - ADN polymérase thermostable (Taq) - Petite quantité d’ADN contenant la séquence à amplifier.
32
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Comment se produit l’amplification à chaque cycle de la PCR?
Le nombre d’exemplaires de la séquence synthétisée par les deux amorces sont doublés à chaque reprise du cycle. - Amplification exponentielle!
33
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : À quelle T° et pendant combien de temps est ce que l’ADN est dénaturé pour une réaction typique?
À 94°C ou 95°C pendant 5 à 10 minutes.
34
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Après la dénaturation, les cycles de la PCR commencent. Quels sont les 3 cycles?
1. 95°C pendant 30 secondes. 2. 45°C et 65°C pendant 30 secondes pour permettre aux amorces de s’hybrider spécifiquement à l’ADN. 3. 72°C pendant 30-60 secondes pour l’élongation des fragments.
35
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Pour une amplification importante de la séquence choisie, combien de fois les 3 étapes de la PCR doivent-elles être répétées en boucle?
De 25 à 40 fois.
36
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Après les 15 à 40 répétitions des 3 étapes de la PCR, que doit-on faire?
Il y a une période d’élongation supplémentaire qui se situe entre 68°C et 72°C pendant 10 minutes pour permettre à l’enzyme de bien compléter tous les fragments d’ADN.
37
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Comment se termine la réaction PCR?
Quand le thermocycleur descend sa T° à 4°C pour une période “infinie”.
38
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Pour optimiser une PCR, quels sont les paramètres sur lesquels on peut jouer? (4)
1. Choix des amorces 2. Quantité d’ADN 3. Température d’hybridation 4. Quantité de magnésium (sel présent dans la solution tampon).
39
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : À quoi servent les additifs pour PCR?
Ils sont des agents d’amélioration et peuvent augmenter le rendement, la spécificité et la cohérence des réactions PCR.
40
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Où doivent se trouver les amorces pour la PCR?
De part et d’autre de la région d’intérêt que nous souhaitons amplifier par PCR.
41
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Combien de nucléotides contiennent les amorces habituellement?
De 18 à 22.
42
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Quel est le nombre minimal de nucléotides que peut contenir un amorce et pourquoi?
14 nucléotides, car une amorce plus petite risque de ne pas amplifier spécifiquement la séquence désirée.
43
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Vrai ou faux, si faux, corriger. «Plus l’amorce est petite, plus elle sera spécifique» ?
Faux, | «Plus une amorce est longue, plus elle est spécifique.»
44
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Quelles sont les caractéristiques que l’on doit avoir pour les amorces?
- Amorces riches en G+C (jusqu’à 50 à 60%) - Tm (T° de fusion) doit être la même pour les 2 amorces. - Amorcent devraient commencer et terminer par un C ou G.
45
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Quelle est la formule de Wallace et à quoi sert-elle?
Permet de calculer la Tm des oligonucléotides entre 14 et 26 pb. Tm = 2x(A+T) + 4x(C+G) = Température en °C.
46
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Dans quel sens doit-on dessiner la première amorce (F=forward)?
De 5’ vers 3’ quelques bases avant la séquence d’intérêt.
47
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Comment s’hybridera l’amorce F sur le fragment complémentaire?
De 3’-5’.
48
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Dans quel sens doit-on dessiner la deuxième amorce (R=reverse)?
De 3’ vers 5’ à la fin de la séquence d’intérêt.
49
Le choix des amorces (oligonucléotides) : Comment s’hybridera l’amorce R sur le fragment complémentaire?
Elle sera inversée en 5’-3’ pour la commander et elle va s’hybrider en 5’-3’ sur l’ADN.
50
Les amorces dégénérées : Est ce qu’il est possible d’utiliser plus d’une paire d’amorces dans une réaction et pourquoi?
Oui, car on peut avoir des oligonucléotides complémentaires aux deux versions du gènes.
51
Les amorces dégénérées : Comment appelle-t-on une paire d’amorce avec des oligonucléotides complémentaires aux 2 versions du gène?
Des amorces dégénérées.
52
Les amorces dégénérées : Quand une séquence codante doit être amplifiée, qu’est ce qu’il est possible de faire à partir de la séquence de la protéine?
De transformer les 5 ou 6 premiers codons qui codent pour les acides aminés en ARN, puis de les transformer en ADN.
53
Les amorces dégénérées : À quoi ça sert de transformer les premiers codons d’une protéine en ARN puis en ADN?
Ça permet de déterminer la séquence d’ADN qui nous servira d’amorce F.
54
Les amorces dégénérées : Que doit-on faire pour déterminer la séquence de l’amorce R?
Procéder de la même manière que pour F (Protéine->ARN->ADN), mais il ne faut pas oublier de transformer la séquence en base complémentaire à la fin.
55
Les amorces avec des sites de restriction : Est ce que c’est possible d’ajouter en 5’ de l’amorce des nucléotides qui ne se trouvent pas dans le fragment à amplifier? Expliquer?
Oui, car ils vont créer un site de clivage pour une enzyme de restriction.
56
Les amorces avec des sites de restriction : Comment faire pour insérer notre fragment amplifié dans le site EcoR1 d’un plasmide?
En ajoutant un 2e site pour l’enzyme EcoR1 (G/AATTC) à l’amorce à l’autre extrémité du fragment à amplifier.
57
Tampon réactionnel : Quelle est la concentration des tampons de réaction habituellement?
de 5x ou 10x selon les compagnies.
58
Tampon réactionnel : À quelle concentration le tampon doit-il être dans le volume réactionnel final?
1X. | Donc on doit calculer le nombre de µl à utiliser.
59
Tampon réactionnel : Que doit-on rajouter au tampon de réaction?
Du chlorure de magnésium (mais parfois il est déjà intégré).
60
Concentration de magnésium : Combien de mM de chlorure de magnésium devrait-il y avoir pour une réaction PCR?
entre 0,5 et 5 mM.
61
Concentration de magnésium : À quoi servent les cations bivalents Mg2+?
Ils sont des cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase.
62
Concentration de magnésium : Est ce qu’une concentration plus faible ou plus élevée de magnésium va favoriser une réaction plus spécifique?
Une réaction plus faible = plus spécifique.
63
Les additifs PCR pour augmenter le rendement : Quel est l’additif qui est le plus souvent ajouté pour amplifier l’ADN fossile ou les échantillons qui contiennent des inhibiteurs de la PCR?
C’est l’albumine de sérum bovin (BSA). | Mais il existe aussi des produits commerciaux.
64
La température de dénaturation : Quelle est la T° de dénaturation et pendant combien de temps?
94 ou 95°C pendant 30 sec à 1 min.
65
La température de dénaturation : Si on a un ADN riche en G+C que doit-on faire?
La température de dénaturation doit être plus élevée.
66
La température de dénaturation : Si on augmente la température de dénaturation à cause qu’il y a beaucoup de G+C dans l’ADN, quelle est la conséquence sur la Taq?
La demi-vie de la polymérase Taq est réduite avec des T° plus élevées.
67
La température de dénaturation : Quelle est la demi-vie de l’enzyme polymérase Taq à 92°C, celle à 95°C et celle à 97°C?
- 2 heures à 92°C - 40 minutes à 95°C - 5 minutes à 97°C
68
Température d’hybridation (Ta) : Selon quoi est ce que la Ta va-elle varier?
Selon la Tm des amorces.
69
Température d’hybridation (Ta) : Quelle est la Ta habituellement?
entre 50°C et 60°C.
70
Température d’hybridation (Ta) : Quelle est la Ta que l’on doit choisir comme première tentative?
Une T° qui est égale à Tm moyen (des 2 amorces) -5°C. | Et ceci pendant 30 secondes à 1 minute.
71
La température d’élongation : À quelle T° et pendant combien de temps et combien de fragments peuvent être amplifier avec cette méthode?
- 72°C - pendant 30 secondes à 1 minute - Jusqu’à 2kb
72
La concentration des amorces : Quelle est la concentration des amorces?
entre 0.2 et 1 µM
73
Concentration d’enzyme (polymérase) : Quelle est la concentration d’enzyme utilisée?
Entre 1 et 2.5 unités d’enzymes | 2 est typique
74
Concentration d’enzyme (polymérase) : Comment appelle-on l’enzyme de polymérisation?
Taq
75
Concentration d’enzyme (polymérase) : Taq est habituellement fournie à quelle concentration?
1 unité par µl.
76
Concentration d’enzyme (polymérase) : Certaines polymérases ont été modifiées pour qu’elles soient activées après une certaine période de dénaturation. À quoi ça sert?
À obtenir de meilleur résultats d’amplification.
77
La concentration d’ADN : Le nombre de molécules d’ADN à amplifier est critique et varie proportionnellement avec la complexité du génome. Une réaction de PCR avec un rendement élevé prend combien d’ADN humain (1), d’ADN de levure (2), d’ADN d’E. coli (3) et d’ADN plasmidique (4).
1) 500 ng d’ADN humain 2) 10-20 ng d’ADN de levure 3) 2-4 ng d’ADN d’E. coli 4) 1 à 2 pg d’ADN plasmidique
78
Les désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) : Quelle est la concentration des dNTPs?
200 ou 250 µM pour chaque dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
79
Les désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) : Quelles sont les précautions à prendre pour obtenir des échantillons de qualité? (7)
1. Éviter de contaminer avec de l’ADN étranger 2. Utiliser des microtubes, des embouts et des tampons stériles 3. Porter des gants 4. Centrifuger les microtubes s’il y a des petites quantités de la solution 5. Ajouter l’ADN dernier 6. Faire une expérience témoin négatif (sans ADN) 7. Faire un témoin positif si possible.
80
Gène de la profiline : Est ce qu’on connait la séquence en nucléotides du gène de la profiline de la levure Saccharomyces cerevisiae?
Oui (voir annexe 8)
81
Gène de la profiline : Que trouve-t-on dans la partie transcrite du gène?
On trouve les régions 5’ non codantes du gène, la région codante avec un seul intron et 210 nucléotides et la région 3’ non codante.
82
Gène de la profiline : Le gène code pour quoi?
Pour une protéine contenant 126 acides aminés.
83
Gène de la profiline : Nous avons fait synthétiser deux amorces qui servent à l’amplification du gène par la réaction de PCR. Que ce trouve-t-il à l’extrémité 5’ de l’amorce F et de l’amorce R?
Un site pour l’enzyme de restriction EcoR1.
84
Gène de la profiline : Après avoir construit un site pour l’enzyme de restriction EcoR1 à l’extrémité 5’ de chacune des deux amorces, qu’à-t-on ajouté?
2 nucléotides à chaque extrémité (GG pour F et CG pour R).
85
Gène de la profiline : À quoi sert la présence des sites EcoR1?
Ça nous permet d’insérer le fragment amplifié dans le site EcoR1 d’un plasmide.
86
Gène de la profiline : l’amorce F est un oligonucléotide qui amorce la polymérisation de quoi?
Du promoteur de la profiline.
87
Gène de la profiline : l’amorce R est un oligonucléotide qui amorce la polymérisation de quoi?
De la région non codante du gène de la profiline.

5. Bio mol (labo) (11 decks)

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