Laboratorio 1

Question 1

¿Qué son los medios de cultivo? Nombre sus condiciones y utilidades

Answer 1

Sustratos nutritivos preparados en el laboratorio.. Los medios de cultivo son preparados estériles
que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos.

Las condiciones son:
1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los
microorganismos (tales como aminoácidos, carbohidratos, poli alcoholes,
vitaminas, minerales).
2. Tener un pH que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias
patógenas necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0 – 7.4), en cambio las
levaduras y hongos requieren un pH ácido (5.0).
3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas
4. Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé,
tapones de goma, tapas metálicas o roscas..

Utilidad de los medios de cultivo
1. Aislamiento de bacterias desde un muestra o material patógeno (secreción
purulenta, orina, órgano, heces, etc.) o de un alimento (leche, carne, etc.).
2. Estudio morfológico de las colonias.
3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario).
4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas
en medios diferenciales.
5. Obtención de toxinas o investigación de sus características.
6. Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos
(vacunas, antígenos, toxoides, etc.).

Question 2

¿Para qué se utilizan los medios de cultivos líquidos?

Answer 2

Se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de células
estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los medios
sólidos, por ejemplo, en la síntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc.

Ejemplo: Agua peptonada, Caldo nutriente, Caldo Cerebro Corazón, Caldo
Sabouraud, etc.

Question 3

¿Para qué se utilizan los medios de cultivos sólidos?

Answer 3

Se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias sobre la
superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las colonias, lo
que no permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de
sostén, que puede ser agar agar o gelatina

Ejemplo: Agar corriente, Agar SS, Agar Cerebro Corazón, Agar Sabouraud, etc.

Question 4

¿Para qué se utilizan los medios de cultivos semisólidos?

Answer 4

Se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje
de agar, de modo que, no siendo completamente sólidos, no solidifican totalmente
a la temperatura ambiente.

Ejemplo: Agar MIO, Agar TSI, Agar LIA, etc.

Question 5

¿Qué son los medios de cultivos corrientes, cómunes o básicos?

Answer 5

Son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de
la mayoría de las bacterias. Además, sirven de base para la preparación de los
medios especiales.

Ejemplo: Agar TSA, Caldo nutriente, Agua peptonada, Agar nutritivo, etc

Question 6

¿Qué son los medios de cultivos especiales y cúales son?

Answer 6

Son aquellos medios de cultivo que, por su riqueza nutritiva,
sirven para el cultivo de bacterias muy exigentes.
Los medios especiales son?
1. Medios Mejorados
Se obtienen añadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor valor nutritivo,
que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de
bacterias exigentes (Streptococcus, Corynebacterium, Neisseria, etc.).
2.Los medios selectivos se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas
especies bacterianas y a la vez inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite
el aislamiento y diagnóstico de las bacterias con facilidad y rapidez. Ejemplo: Agar Brucella, Agar MacConkey, Caldo Selenito Cistina, etc.
3.Son medios comunes o mejorados, con adicción de ciertas sustancias que ponen
de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, inherentes a algunas
especies bacterianas.
Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie
microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o
diferenciales.
Ejemplo: Agar Baird Parker, Agar Rambach, Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar
Salmonella-Shigella.

Question 7

Describa el agar corriente

Answer 7

Es un medio corriente usado para el crecimiento de bacterias en
general, principalmente aquellas que no son muy exigentes. Puede ser convertirse
en enriquecido y/o selectivo por la adición de sustancias adecuadas. Es uno de los
medios más utilizados en los laboratorios de investigación debido a su fácil
formulación.

Question 8

Describa el agar sangre

Answer 8

Es un medio de cultivo mejorado y diferencial en base a agar corriente
enriquecido con 5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias
nutricionalmente exigentes, como bacterias del género Streptococcus y también para
detectar y diferenciar distintos tipos de hemólisis.

Question 9

Describa el agar chocolate

Answer 9

Agar Chocolate: Al calentar el agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se
obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es más apropiado que
el agar sangre para el crecimiento de ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria
gonorrhoeae y Bordetella pertussis (agentes causales de gonorrea y tos convulsiva
respectivamente).

Question 10

Describa el agar manitol salado

Answer 10

Este agar es selectivo y diferencial, ya que inhibe el crecimiento
de bacterias Gram negativas y permite el crecimiento de Gram positivas, utilizándose
especialmente para el crecimiento e Staphylococcus y Micrococcus, además es
diferencial para las especies de Staphylococcus, diferenciando las que poseen la
enzima coagulasa de las que no.

Question 11

Describa el agar Maconkey

Answer 11

Agar MacConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares
y cristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram positivas y lactosa para distinguir
aquellas bacterias que la fermentan de las que no. En agar MacConkey las bacterias
entéricas que utilizan lactosa, tales como Escherichia coli forman colonias rojas
debido a que los productos ácidos que se forman a partir de lactosa afectan el
indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no
usan lactosa (por ejemplo, Salmonella) forman colonias incoloras.

Question 12

Describa el agar salmonella-shigella

Answer 12

Agar Salmonella-Shigella: El agar Salmonella-Shigella es un medio de cultivo
selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por las sales biliares y el verde
brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas. Es diferencial debido
a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del
tiosulfato de sodio. Este medio si bien es utilizado principalmente para las bacterias
de los géneros Salmonella y Shigella, es también utilizado para la mayoría de las
enterobacterias

Question 13

Describa el agar Hektoen entérico

Answer 13

Agar Hektoen entérico: El agar Hektoen Entérico contiene sales biliares que inhiben
el desarrollo de la microbiota comensal, azul de bromotimol y fucsina ácida como
indicadores de la fermentación de carbohidratos, y el citrato de hierro como un
indicador de la formación de H2S a partir del tiosulfato. Este medio, al igual que el
Salmonella-Shigella si bien es utilizado principalmente para las bacterias de los
géneros Salmonella y Shigella, es también utilizado para la mayoría de las
enterobacterias.

Question 14

Describa el agar XLD

Answer 14

Agar XLD: El agar XLD es utilizado principalmente para el aislamiento y la
identificación de patógenos entéricos, en especial de Shigella. Este medio fue
formulado para favorecer el crecimiento de Shigella, que a menudo no crecía en otras
fórmulas debido a inhibidores tóxicos. Este medio también puede ser utilizado para
otras enterobacterias.

Question 15

Describa el agar sabouraud

Answer 15

Agar Sabouraud: Este medio es recomendado para el aislamiento y desarrollo de
hongos. En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para
el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de
cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de
bacterias. Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos
de crecimiento.

Question 16

Describa el agar
EBU

Answer 16

Agar EBU: También llamado agar Evans Blue Urenina o placa verde, contiene un
indicador de pH el cual mantiene el color verde a pH neutro, y azul oscuro a un pH
ácido. Las colonias lisogénicas y no lisogénicas forman colonias claras y de un
tamaño mayor, las colonias pseudolisogénicas tienen muchas células entrando en
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lisis celular lo que disminuye el pH de la colonia, haciendo que esta sea de tamaño pequeño y de aun azul oscuro.

Question 17

Técnicas de siembra hacia tubo de agar tendido

Answer 17

1. Rotule el tubo con los datos correspondientes (microorganismo, fecha,
   curso, grupo, mesón).
2. Flamee el asa para su esterilización y enfríe el asa.
3. Tome un inóculo de su muestra problema.
4. Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes,
   hasta el fondo. Ascienda el asa imprimiéndole un movimiento de zigzag
   tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper ni
   arrastrar el agar.
5. Flamee la boca del tubo y tápela.
6. Flamee el asa para su esterilización.
7. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Question 18

Técnica de siembra hacia placa de petri

Answer 18

1. Rotule la placa con los datos correspondientes.
2. Flamee el asa para su esterilización.
3. Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido de
   condensación.
4. Tome un inóculo de su muestra problema.
5. Levante la tapa de la placa lo necesario para introducir el asa.
6. Imprima al asa un movimiento de zigzag, tocando superficialmente el medio
   de cultivo, procurando no romper el agar.
7. Tape la placa y flamee el asa para su esterilización.
8. Incube la placa sembrada a la temperatura adecuada.

Question 19

Técnica de siembra hacia medio líquido

Answer 19

1. Rotule la placa con los datos correspondientes.
2. Flamee el asa para su esterilización.
3. Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido de
   condensación.
4. Tome un inóculo de su muestra problema.
5. Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes,
   agítela en el medio de cultivo y retírela con cuidado.
6. Flamee la boca del tubo y tápelo.
7. Flamee el asa para su esterilización.
8. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Question 20

Técnica de siembra y aislamiento en ZigZag

Answer 20

Se toma el asa con la muestra y se procede a hacer una estría en zigzag desde un
extremo a otro de la placa. Sin esterilizar el asa se puede repetir la misma operación
en una segunda o tercera placa para llegar a obtener colonias aisladas. Es preciso
actuar con rapidez para evitar la contaminación con microorganismos presentes en
el aire. Esta técnica es poco recomendable para personas que poseen poca práctica
en laboratorio microbiológico

Question 21

Técnica de siembra y aislamiento por siembra en cuadrantes

Answer 21

Se toma la placa con la mano izquierda y se distribuye la siembra en una pequeña
área junto a su borde. Se esteriliza el asa, se enfría y se arrastra un poco de la bacteria
ya sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa con movimiento en
zigzag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continúan los movimientos
hasta ocupar toda la superficie de la placa

Question 22

Técnica de siembra y aislamiento por ocho sectores

Answer 22

Se marca la parte inferior de la placa para dividirla en 8 sectores. Se siembra el
primero con el asa que posee la muestra, efectuando movimientos en zigzag. Se
esteriliza el asa, se enfría, se arrastra bacterias del primer sector ya sembrado y se
esparcen en los demás mediante movimientos en zigzag. Esta técnica es utilizada al
igual que la anterior para diluir muestras y poder tener colonias bacterianas.

Question 23

Técnica de simbra y aislamiento de césped

Answer 23

Se pone sobre el agar una gota de medio líquido con la muestra y se esparce por
toda la placa con un rastrillo hecho con una pipeta Pasteur de vidrio (su ayudante le
enseñará como), debe esparcir la muestra por toda la placa hasta que esta se
encuentre seca. Esta técnica es utilizada para obtener una gran cantidad de bacterias
en medio sólido, y en pocos casos es posibles ver colonias bacterianas

Question 24

Nombre y explique los pasos para realizar una correcta tinción de Gram

Answer 24

Fijación de bacterias
Aplicación del colorante.- Cristal Violeta
El colorante básico difunde por todo el organismo. La especificidad del colorante
primario reside en la habilidad de los trifenil-metanos de teñir la pared celular de los
organismos Gram positivos. Correlativamente el carácter de Gram negativo yace en
la relativa incapacidad de su pared celular de retener el colorante primario.
2. Aplicación del mordiente. - Lugol
Donde sea que penetre el yodo y encuentre colorante, forma un complejo insoluble
en agua. Teóricamente la formación del complejo en la estructura externa
constituirá una barrera de permeabilidad a la penetración posterior de mordiente en
el resto de la estructura del organismo.
3. Aplicación del decolorante. - Alcohol-cetona
A diferencia de los organismos Gram positivos, en los organismos Gram negativos
ocurre un verdadero lavado del complejo colorante-yodo al tratarlo con la solución
de solvente orgánico. La presencia de agua aumenta la decoloración,
presumiblemente por aumento en la penetración del solvente orgánico.
4. Tinción de contraste. - Safranina
En general, los mejores colorantes de contraste son aquellos colorantes básicos que
no sean trifenilmetanos. Estos colorantes reemplazan al colorante primario en los
Gram negativos, el que había sido removido por el solvente. Los Gram positivos son
resistentes al decolorante, por lo tanto, no se tiñen con el colorante de contraste.

Question 25

¿Para qué se utiliza la tinción negativa?

Answer 25

Esta técnica es utilizada principalmente para observar cápsulas de distintos
microorganismos. Utiliza tinta china para evidenciar la presencia de la cápsula
microbiana, pues tiñe de color negro todo el frotis, salvo la cápsula (queda un
espacio blanco, sin teñir). El resto del microorganismo se tiñe de color rosado con
el colorante de contraste (fucsina). Se observa con objetivo de inmersión (100x).
Ej. Tinción de cápsula (Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae).

Question 26

¿Para qué sirve la tinción de SCHAEFFER-FULTON?

Answer 26

Técnica utilizada para observar endosporas bacterianas. Utiliza el colorante verde
de malaquita que tiñe esta forma de resistencia de algunas bacterias. El resto de la
bacteria se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se observa
con objetivo de inmersión (100x).
Las esporas pueden ser terminales o subterminales o pueden encontrarse libres de
la célula bacteriana. Ej. Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis.

Question 27

¿Para que sirve la tinción de ZIEHL NEELSEN?

Answer 27

Es de gran importancia en microbiología ya que permite evidenciar la presencia de
bacilos ácido-alcohol resistentes como Mycobacterium tuberculosis, agente
etiológico de la tuberculosis, y que no pueden ser teñidos con otra técnica de tinción.
En esta tinción se pueden diferenciar dos tipos de bacterias, las que son Alcohol
Ácido Resistentes (AAR+) y las que no lo son (AAR-).
Fundamento:
La fucsina que es un colorante básico forma un complejo con los ácidos micólicos
de la pared de las Mycobacterias. Este complejo es resistente a la decoloración con
alcohol-ácido (alcohol clorhídrico) permaneciendo de color fucsia a diferencia de
las otras bacterias que se decoloran. El azul de metileno se usa como tinción de
contraste.

Question 28

¿Cúal es el uso correcto del microscopio?

Answer 28

a) Iluminación correcta del microscopio con luz artificial.
Coloque el espejo cóncavo frente a la fuente de luz. Proceda a centrar la fuente
luminosa, para ello retire el ocular del tubo y coloque el objetivo. Observando a través
del tubo, aprecie el instante en que, al mover el espejo, obtenga una iluminación,
accionando el diafragma del condensador y mirando por el tubo, note el momento en
que la luz proyectada cubra toda la lente posterior del objetivo, una vez obtenida ésta,
coloque el ocular en su sitio. Ahora está en condiciones de observar.
b) Para enfocar una preparación.
Una vez colocado el frotis sobre la platina, accione el macrométrico y vaya subiendo
la platina, mientras va mirando a través del ocular del microscopio. Cuando observe
la imagen en el foco debe accionar el micrométrico, para lograr enfocar la muestra.
Para observar las bacterias con tinción de Gram, tinción de Ziehl Neelsen, tinción
negativa y tinción de Schaeffer-Fulton es necesario utilizar el objetivo de inmersión
(100x). Para ello una vez realizado el extendido y la tinción se debe:
1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio.
2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de
inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con el objetivo 40x (seco), eligiendo la zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión (100x,
línea negra) (figura A) EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS
SECOS CON EL ACEITE DE INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite (figura B), el
objetivo deberá estar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá
ocupar este pequeño espacio (figura C)
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL
OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LENSPAPER.

Question 29

Indique los pasos de un frotis bacteriano

Answer 29

1. Flamee la lámina rápidamente.
2. Coloque una gota de agua en el centro de la lámina. (Sólo si la muestra o cultivo es
   sólido).
3. Transfiera con un asa estéril una pequeña cantidad de cultivo o de muestra y
   mézclelo con la gota de agua formando una suspensión, apenas opalescente.
4. Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama de un mechero hasta que esté
   completamente seco. Pruebe el calor de la lámina sobre el dorso de su mano (si está
   demasiado caliente se alterará la morfología bacteriana).

Question 30

Indique los pasos en la práctica de una tinción de Gram

Answer 30

1. Cubra el frotis con cristal violeta y déjelo en reposo por 1-2 min.
2. Lávelo con solución de lugol y déjelo escurrir suavemente hasta que se hayan
   desprendido unas laminillas de aspecto metálico. Déjelo con lugol por 30
   segundos.
3. Decolore rápidamente, dejando escurrir en forma alternada alcohol-acetona y
   posteriormente con agua de la llave (chorro suave), hasta que se desprenda todo el
   colorante violeta.
4. Cubra su frotis con el colorante de contraste, safranina, por 1 min.
5. Lávelo suavemente con agua de la llave, séquelo suavemente y obsérvelo con
   inmersión

Question 31

Indique los pasos prácticos para la tinción de Schaeffer-Fulton

Answer 31

1. Realice un frotis en la forma habitual.
2. Cubra con verde de malaquita y caliente suavemente para SOLO emisión de vapores,
   EVITE QUE HIERVA (Es cancerígeno). La Mancha no sale ni del suelo ni de las manos
   ni del delantal.
3. Lave con agua de la llave.
4. Contratiña con safranina por 60 seg.
5. Lave, seque y observe con inmersión.

Question 32

Indique los pasos de la tinción negativa

Answer 32

1. Coloque una gota moderada de tinta china sobre un portaobjeto y emulsione sobre
   ella la bacteria en estudio.
2. Con otro portaobjeto, extienda la muestra hasta que quede la lámina negra
   completamente. Obtendrá dos laminas con la muestra.
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3. Deje secar al aire.
4. Cubra con fucsina por 30 segundos.
5. Lave con agua, seque y observe con inmersión.

Question 33

Indique los paso de la Tinción de Ziehl-Neelsen

Answer 33

1. Cubra el frotis con fucsina y déjelo en reposo por 1-2 min.
2. Decolore rápidamente, dejando escurrir en forma alternada alcohol-HCl y
   posteriormente con agua de la llave (chorro suave), hasta que se desprenda todo el
   colorante.
3. Cubra su frotis con el colorante de contraste, azul de metileno por 1 min.
4. Lávelo suavemente con agua de la llave, déjelo secar y obsérvelo con inmersión.