Le clonage moléculaire et ADN recombinant - Cours 6 Flashcards
1
Q
Que se passe-t-il dans les années 1950-1960 en biologie moléculaire?
A
Fondations de la biologie moléculaire
1953: James Watson et Francis Crick décrivent la structure en double hélice de l’ADN, jetant les bases de la compréhension moderne de la génétique. Prix Nobel de physiologie/médecine 1962 (avec Maurice Wilkins). Par contre, il ne faudrait pas oublier Rosalind Franklin …
2
Q
Que se passe-t-il à la fin des années 1960 en biologie moléculaire ?
A
Les scientifiques commencent à étudier les enzymes de restriction,
des protéines qui peuvent couper l’ADN à des endroits spécifiques.
3
Q
Que se passe-t-il dans les années 1970 en biologie moléculaire?
A
Naissance de la technologie de l’ADN recombinant
1972: Paul Berg crée la première molécule d’ADN recombinant en combinant l’ADN de deux organismes différents.
1973: Herbert Boyer et Stanley Cohen réussissent la première
expérience de clonage génétique.
1975: La conférence d’Asilomar
4
Q
Que se passe-t-il en 1982 en biologie moléculaire?
A
La FDA approuve l’insuline humaine produite par des bactéries
génétiquement modifiées, le premier médicament produit grâce à la
technologie de l’ADN recombinant.
5
Q
Que se passe-t-il en 1996 en biologie moléculaire?
A
Dolly est clonée !
6
Q
Que se passe-t-il à la fin des années 1980 en biologie moléculaire?
A
Les techniques de clonage moléculaire sont de
plus en plus utilisées pour étudier l’expression génique et produire
des protéines d’intérêt.
7
Q
Que se passe-t-il en 1990 en biologie moléculaire?
A
Début du Projet Génome Humain, une initiative internationale
visant à séquencer l’ensemble du génome humain.
8
Q
Que se passe-t-il en 2003 en biologie moléculaire?
A
Achèvement du Projet Génome Humain
9
Q
Que se passe-t-il de la fin des années 2000 à aujourd’hui en biologie moléculaire?
A
Développement de nouvelles
techniques de séquençage d’ADN et d’édition génomique, comme
CRISPR-Cas9.
10
Q
Expliquez ce qu’est la transcription
A
Chaque séquence de 3 nucléotides code pour un acide aminé.
Suite à la transcription, l’ARN est épissé.
Chez l’humain: ~100 000 transcrits
11
Q
Quelles sont les caractéristiques de l’ARNm?
A
- Ribose au lieu de 2-deoxyribose
- Simple brin
- Thymine (T) est remplacé par uracile (U)
12
Q
Expliquez ce qu’est la traduction
A
Il y a un code précis pour la conversion des nucléotides en acides aminés.
* Chaque codon code pour un acide aminé spécifique.
* Chez l’humain: > 1 000 000 protéines.
* Les différents isoformes d’ARNm produisent des protéines différentes.
* Les modifications post-traductionnelles (phosphorylation,
ubiquitination, etc.) contribuent aussi à la diversification protéique.
13
Q
Expliquez l’étape 1: Élaborer un test afin de mesurer le phénotype (dans le criblage classique)
A
- Simple
- Quantitatif
- Permettant de distinguer les animaux normaux de ceux qui ont
un phénotype anormal
13
Q
Quelles sont les étapes d’un criblage classique?
A
Étape 1: Élaborer un test afin de mesurer le phénotype
Étape 2: Obtenir un mutant
Étape 3: Dépistage d’un phénotype anormal
Étape 4: Regroupement des mutants
Étape 5: Localiser le gène
14
Q
Pourquoi effectuer un criblage classique?
A
Afin d’identifier des gènes causant un phénotype anormal.
14
Q
Qu’est-ce que le criblage classique (ou foward)?
A
- Identifier les gènes importants pour un phénotype biologique
- Milliers de gènes à la fois
- Permet de générer des hypothèses
15
Q
Qu,est-ce que le criblage inversé (ou reverse)?
A
- Sélectionner un gène et déterminer les phénotypes associés
- Un seul gène à la fois
- Permet d’évaluer une hypothèse
16
Q
Comment peut-on faire l’étape 2: Obtenir un mutant (dans le criblage classique) ?
A
- Mutations naturelles
- Mutagenèse chimique, ex. Méthanesulfonate d’éthyle (EMS) et
N-nitroso-N-éthylurée (ENU) - Mutagenèse par irradiation (UV haute-intensité)
- Mutagenèse par insertion (transposon)
17
Q
Que provoque les mutagenèses chimiques?
A
Provoque des mutations ponctuelles (un seul nucléotide)
18
Q
Que peuvent être les mutations?
A
- Non-sens (remplacement d’un codon codant un acide aminé par un codon-stop)
- Faux-sens (remplacement d’un codon codant un acide aminé par un autre)
- Dans la séquence non-codante (influence l’épissage et les éléments régulateurs)
19
Q
Quelles peuvent être les conséquences d’une mutation?
A
Changement de l’acide aminé
Création d’un codon stop
Création ou délétion d’un site d’épissage
19
Q
Que provoque les mutagenèse par irradiation?
A
Provoque des ruptures dans l’ADN double brin
Génère des grandes délétions ou réarrangements chromosomique
20
Q
Que sont les mutagenèse par insertion (transposon)?
A
Contient un gène marqueur
* Possibilité d’insertion dans la région codante (perturbe la séquence d’acides aminés)
* Possibilité d’insertion dans les régions non-codante adjacentes (perturbe l’épissage ou l’expression du gène)
21
Q
Expliquez comment l’on fait l’étape 3 : Dépistage d’un phénotype anormal (dans le criblage classique)
A
- La première génération est « instable » et mosaïque.
- Après plusieurs générations, la/les mutations sont fixées.
- Les lignées sont évaluées (on produit entre 100 et 1000 lignées) (test étape 1).
- Les lignées avec phénotype sont maintenues (possibilité de outcross).
22
Expliquez comment l'on fait l'étape 4: Regroupement des mutants (dans le criblage classique)
* Complémentation: fait la distinction entre mutation dans le même gène ou gènes différents.
* Test allélique: Est-ce que 2 mutants ensemble peuvent restaurer le phénotype normal?
23
Qu'est-ce que la complémentation génétique?
La complémentation génétique est une méthode qui permet d'identifier si deux mutations récessives affectent le même gène ou des gènes différents.
Cette technique est utilisée dans les études génétiques pour identifier des groupes de gènes fonctionnels impliqués dans un même processus biologique.
Les deux mutant sont complémentaires, le phénotype normal est restauré.
Mutations sur des gènes différents
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Que se passe-t-il en absence de complémetation?
Les deux mutant ne sont pas
complémentaires, le phénotype normal n’est pas restauré.
Mutations sur le même gène
24
Expliquez comment l'on fait l'étape 5: Localiser le gène (dans le criblage classique)
Utilisation de techniques permettant de cartographier le gène responsable d'une mutation ou d'un phénotype.
* Séquence du transposon (mutagénèse par insertion)
* Analyse de liaison (mutagénèse chimique et irradiation)
* À chaque croisement il y a recombinaison
* Des marqueurs (SNPs ou mutations) permettent de suivre les recombinaisons
* La détermination de l’empreinte génétique permet l’identification du locus/gène
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Pourquoi effectuer un criblage inversé?
Afin d’étudier un gène d’intérêt et son influence sur divers phénotypes.
On identifie donc un gène d’intérêt et on « perturbe » ce gène pour déterminer son rôle suivant la variation des phénotypes (knockout, édition du génome, etc.).
26
Quelles sont les fonctions de siARN et shARN?
Les siARN et shARN ont pour fonction principale de réduire ou arrêter l'expression d'un gène spécifique. Cela se fait en ciblant l'ARNm correspondant au gène pour provoquer sa dégradation, un processus appelé silencing génique.
27
Qu'est ce que siARN et shARN?
siARN: Petits ARN interférents
shARN: ARN courte épingle à cheveux
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Quelles sont les étapes de l'utilisation de siARN et shARN?
* shARN est délivré par plasmide ou virus, tandis que le siARN est directement injecté.
* Transcription du shARN
* Brisure de la forme « épingle à cheveux » du shARN
* Le complexe RISC vient défaire l’ARN double brin
* Reconnaissance de la séquence cible
* Arrêt/diminution de l’expression
29
Par quoi peut se faire l'édition du génome ?
Le triumvirat :
CRISPR/Cas9 (la méthode la plus utilisée)
TALEN = transcription-activator-like effector nuclease
Zinc Finger
30
Qu'est-ce que le ZNF?
ZFN = endonucléases qui combinent un domaine de liaison à l'ADN, appelé "doigt de zinc", avec une enzyme de coupure de l'ADN, en l'occurrence Fok1.
31
Quelle est la structure du Zinc finger ?
Chaque doigt de zinc reconnaît et se lie à une séquence spécifique d'ADN (environ 9 nucléotides). Pour chaque séquence cible, il faut deux domaines de liaison à l'ADN (un à gauche et un à droite) séparés par un espaceur de 5 à 7 nucléotides.
32
Quel est le domaine de clivage du Zinc Finger?
Le domaine de clivage est constitué de l'enzyme Fok1, une endonucléase qui doit former un dimère pour couper l'ADN.
33
Comment se fait la coupure de l'ADN par le Zinc Finger?
Une fois les deux ZFN liés aux séquences cibles, Fok1 clive l'ADN au niveau de l'espaceur, ce qui génère une cassure double-brin. La réparation de cette cassure par la cellule peut entraîner des mutations (indel sur le graphique) qui perturbent le gène cible.
34
Qu'est-ce que le TALEN?
Nucléases qui utilisent des domaines d'effecteurs TAL pour reconnaître des séquences spécifiques d'ADN, couplées à l'enzyme Fok1 pour cliver l'ADN.
35
Quelle est la structure du TALEN?
Chaque domaine TAL reconnaît une séquence spécifique de nucléotides (16 -17 nucléotides par site cible). Comme avec ZFN, les domaines TAL sont utilisés par paires pour cibler des séquences spécifiques des deux côtés d'une région d'ADN à couper, séparées par un espaceur de 16-19 nucléotides.
36
Quel est le but de CRISPR/Cas9?
Inactiver l’ADN viral exogène en induisant une cassure double brin
36
Quel est le domaine de clivage et comment se fait la coupure de l'ADN pour TALEN?
Comme avec ZFN, Fok1 doit être dimérisé pour fonctionner. Lorsque les deux TALEN se lient à leurs séquences cibles respectives, Fok1 coupe l'ADN au niveau de l'espaceur, provoquant une cassure double-brin. Une fois l'ADN coupé, la cellule tente de réparer cette cassure, générant des mutations qui peuvent désactiver un gène.
37
Quelles sont les 2 composantes essentielles de CRISPR/Cas9?
1. La protéine associée au CRISPR (Cas 9)
2. Un ARN guide (ARNg)
38
Qu'est-ce que Cas9?
Endonucléase clivant l’ADN et encodé dans l’opéron Cas du chromosome bactérien
39
Qu'est-ce que le locus CRISPR?
Instructions essentielles à la synthèse de différents ARNg
40
Quels sont les 2 segments de l'ARNg?
1. ARN CRISPR (ARNcr). Sert au criblage de l’ADN viral par appariement de bases
2. ARN CRISPR trans-activant (ARNtracr). Séquence palindromique qui adopte une structure 3D servant d’échafaudage moléculaire pour l’ancrage de l’ ARNg
41
Qu'est-ce que la séquence PAM?
Mécanisme de sécurité. Motif de 3-5 nucléotides présent uniquement de l’ADN cible du coté 3’
42
Quel est le principe du CRISPR/Cas9 (étapes générales)?
* Créer un ARNg synthétique en modifiant la portion ARNcr pour cibler une séquence cible.
* Un complexe Cas 9/ARNg est créer et s’hybride a la séquence cible.
* La séquence PAM peut varier selon l’origine de la Cas 9.
* Deux voies de réparation:
1. Jonctions d’extrémités non homologues (NHEJ)
2. Réparation par recombinaison homologue (HDR)
* L’addition d’un brin d’ADN sœur contenant une séquence précise peut être utilisé comme matrice pour incorporer une mutation précise
43
Quelles sont les étapes de CRISPR/Cas9?
1. Sélection de la cible (gène à inactiver)
2. Conception des ARN guides (gRNA)
3. Préparation du système CRISPR/Cas9
4. Introduction des mutations (KO)
5. Validation du Knock-Out
6. Contrôle des effets hors-cibles
43
Comment se fait l'étape 1 : Sélection de la cible (gène à inactiver) (pour CRISPR/Cas9)?
Identification du gène d’intérêt: Par exemple, dans une étude sur la maladie de Parkinson, on pourrait choisir de cibler le gène SNCA qui code pour l'alpha-synucléine.
Détermination de la région cible: En général, on vise une région exonique importante du gène (souvent les premiers exons) pour garantir que la mutation entraîne une perte complète de la fonction de la protéine. On peut choisir un exon essentiel à la fonction de la protéine ou qui, lorsqu'il est muté, entraîne un décalage du cadre de lecture (frameshift).
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Comment se fait l'étape 2 : Conception des ARN guides (gRNA) (pour CRISPR/Cas9)?
Le CRISPR/Cas9 repose sur des ARN guides (gRNA) pour cibler la séquence d’ADN spécifique.
* Choix de la séquence cible: Le gRNA doit être conçu pour cibler une séquence proche du site de coupure souhaité. Cette séquence doit être adjacente à un site PAM (Protospacer Adjacent Motif), qui est essentiel pour l’activité de Cas9 (généralement la séquence "NGG").
* Conception des gRNA efficaces: Des algorithmes en ligne, comme ceux proposés par des outils tels que CRISPOR, CHOPCHOP ou Benchling, aident à identifier les séquences d'ARN guide optimales. Ces outils tiennent compte de critères comme :
* La spécificité (éviter les sites hors-cibles).
* L'efficacité (probabilité de coupure réussie).
* La proximité des sites exoniques essentiels du gène.
45
Comment se fait l'étape 3 : Préparation du système CRISPR/Cas9 (pour CRISPR/Cas9)?
Une fois les gRNA conçus, il faut préparer le système d'édition CRISPR. Deux principales méthodes sont utilisées pour introduire le complexe CRISPR/Cas9 :
* Vectorisation via plasmides: Les gènes codant pour l’enzyme Cas9 et le gRNA sont introduits dans les cellules à l'aide de plasmides. Ce système permet une expression durable du complexe CRISPR/Cas9.
* Électroporation de ribonucléoprotéines (RNPs): Le complexe protéique Cas9 et le gRNA peuvent être directement introduits dans les cellules via électroporation ou transfection, ce qui permet une action plus rapide et réduit les risques de mutations hors-cibles.
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Comment se fait l'étape 4 : Introduction des mutations (KO)(pour CRISPR/Cas9)?
Lorsque Cas9 est exprimée dans la cellule, elle va couper l’ADN double brin au site cible, induisant un mécanisme de réparation par non homologous end joining (NHEJ). Ce processus est souvent sujet à des erreurs, ce qui conduit à …
Indels (insertions/délétions): Ces petites mutations provoquent souvent un décalage du cadre de lecture (frameshift), entraînant la production d'une protéine tronquée non fonctionnelle, aboutissant au knock-out du gène.
47
Comment se fait l'étape 5 : Validation du Knock-Out (pour CRISPR/Cas9)?
Après avoir introduit les mutations, il est essentiel de valider que le gène ciblé est bien inactivé :
* Séquençage du locus cible: On utilise le séquençage pour vérifier que les mutations attendues (indels) sont bien présentes dans notre gène (SCNA dans ce cas)
* Analyse de l'expression génique/protéique: Une analyse par qPCR et Western blot/immunohistochimie permet de vérifier si les ARNm et la protéine codée par le gène KO est effectivement absente ou réduite.
Tests fonctionnels: électrophysiologie, tests comportementaux chez les animaux KO, etc, pour vérifier que la fonction neuronale ou le comportement est altéré en conséquence de l’inactivation du gène.
48
Comment se fait l'étape 6 : Contrôle des effets hors-cibles (pour CRISPR/Cas9)?
Il est important de vérifier que le système CRISPR/Cas9 n'a pas introduit de mutations indésirables dans d'autres parties du génome.
Séquençage des sites hors-cibles potentiels: Les algorithmes utilisés pour concevoir les gRNA génèrent également des listes de sites génomiques similaires (potentiels hors-cibles). Ces sites peuvent être séquencés pour vérifier l’absence de mutations.
49
Pourquoi effectuer un criblage génétique chez l'humain?
Afin d’identifier un locus d’intérêt associé avec un phénotype.
50
Quels sont les 2 types de marqueurs utilisés en criblage génétique?
Marqueurs microsatellites
Micropuce SNPs (nucleotides polymorphiques simples)
51
Quel est l'avantage des marqueurs microsatellites en criblage génétique?
Très polymorphique
52
Quel est le désavantage des marqueurs microsatellites en criblage génétique?
Couverture inégale, parfois des gaps
53
Qu'est-ce que permet les marqueurs microsatellites en criblage génétique?
* Amplification par PCR
* Lecture de la taille des fragments
* La taille des différents marqueurs est utilisée pour construire l’haplotype
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Quel est l'avantage des micropuces SNPs en criblage génétique?
Grande quantité de marqueurs
55
Quel est le désavantage des micropuces SNPs en criblage génétique?
Peu polymorphique
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Comment est fait le cirblage génétique avec avec les micropuces SNPs?
* Pour chacun des SNPs présents sur la puce, il y a deux sondes (correspondant à chacun des nucléotides).
* L’ADN est extrait et couplé à une molécule fluorescente.
* L’ADN est ensuite chargé sur la puce et les séquences complémentaires s’hybrident.
* Suite à l’hybridation la molécule fluorescente émet un signal et un lecteur enregistre les signaux fluorescents.
* Le génotype de chacun des SNPs est utilisé pour construire l’haplotype.
57
Que sont les études d'association (GWAS) en criblage génétique?
* Nécessite beaucoup d’individu
* Pour les maladies ou traits complexes
* Utilisent les SNPs comme marqueurs
* Comparaison de la fréquence d’un/des variants dans chacun des groupes
* Le graphique de type Manhattan démontre les SNPs avec une association aux traits/maladies étudiés
57
Que sont les analyse de liaison en criblage génétique?
* Nécessite des grandes familles
* Pour les maladies Mendéliennes
* Les recombinaisons déterminent les jonctions du locus
* Calcul de score LOD (significatif établi à 3)
58
Qu'est-ce que le séquençage de l'exome en criblage génétique?
Le séquençage de l’exome permet d’identifier les variants codants.
* Fragmentation de l’ADN génomique
* Hybridation avec des sondes correspondant aux exons des différents gènes
* Nettoyer pour enlever ce qui n’est pas hybride et capture de l’ADN hybride
* Préparation de la librairie (ajout d’adaptateurs)
* Séquençage et analyses bio-informatiques
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Quels sont les avantages du séquencage de l'exome en criblage génétique?
Identifie directement les variants potentiels, ne nécessite pas de grandes familles, toutes maladies/traits
60
Quels sont les désavantages du séquencage de l'exome en criblage génétique?
Couvre 2% du génome (régions codantes seulement), plus dispendieux
61
Qu'est-ce que le séquençage du génome en criblage génétique?
Le séquençage de l’exome permet d’identifier les variants codants et non- codants, CNVs et expansion de répétitions
Le criblage classique chez l’humain va souvent être suivi d’un criblage inversé dans un modèle animal afin de valider l’association génotype phénotype.
* Fragmentation de l’ADN génomique
* Préparation de la librairie (ajout d’adaptateurs)
* Séquençage et analyses bio-informatiques
62
Quels sont les avantages du séquencage du génome en criblage génétique?
Identifie directement les variants potentiels, ne nécessite pas de grandes familles, couvre le génome en entier (ou presque …)
63
Quels sont les désavantages du séquencage du génome en criblage génétique?
Dispendieux, limitation dans l’interprétation des données (que font les introns ?)
64
Pourquoi effectuer un criblage in silico?
Afin d’identifier par une approche bio-informatique des gènes ou protéines d’intérêts
65
Quels sont les types de criblages in silicon?
BLAST (NCBI)
Ensembl
UCSC Genome Browser
66
Expliquez ce qu'est le BLAST (NCBI) en criblage in silico
* Compare les séquences d’ADN et protéines
* Librairie de séquences provenant de toutes les espèces
* Comparaison basée sur la similarité de séquence
67
En quoi le criblage in silico est utile?
Utile pour obtenir de l’information sur les loci (analyse de liaison) ou gène d’intérêts (GWAS, séquençage)
68
Expliquez l'Ensembl en criblage en silico
* Emphase sur les analyses génomique
* Génomes complets des organismes modèles ainsi que d’autres espèces
* Alignement de séquence et homologie entre les gènes
* Extraction de séquences d’intérêts
69
Expliquez l'UCSC Genome Browser en criblage in silico
* Similaire à Ensembl
* Possède une fonction BLAT (même chose que BLAST)
* Beaucoup d’information additionnelle (maladies, marqueurs génétiques, etc.)
70
Quels sont les types de criblages moléculaires?
Micro-puce ADNc (regarder l’expression des gènes)
Séquençage de l’ARN
71
Pourquoi faire un criblage moléculaire?
Afin d’identifier des gènes en lien avec un processus biologique spécifique
72
Expliquez la micro-puce ADNc en criblage moléculaire
* Un ADNc est produit suite à l’extraction de l’ADN.
* Les molécules d’ADNc sont couplées à un fluorochrome.
* La puce contient des sondes correspondantes à la séquence de chacun des gènes (quelques-unes par gène).
* L’ADNc est ensuite charge sur la puce et les séquences complémentaires s’hybrident.
* Suite à l’hybridation la molécule fluorescente émet un signal et u lecteur enregistre les signaux fluorescents.
* La présence de signal ou l’intensité du signal est utilisée pour déterminer l’expression.
73
Quels sont les avantages de la micro-puce ADNc en criblage moléculaire?
Analyse simple, peu coûteux
74
Quels sont les déavantages de la micro-puce ADNc en criblage moléculaire?
Sondes prédéterminées
75
Expliquez le séquençage de l'ARN en criblage moléculaire
* L’ARN est extrait des tissus/cellules d’intérêts
3 protocoles diffèrent peuvent être utilisés :
1. Sélection poly-A
2. Déplétion d’ARN ribosomale
3. Sélection par la taille (cible les petits ARNs)
* Conversion en ADNc
* Production de la librairie
* Séquençage et analyses bio-informatique
76
Quels sont les avantages du séquençage de l'ARN en criblage moléculaire?
Séquençage de tous les transcrits exprimés dans le tissu, possibilité de détecter les transcrits de faible abondance
77
Quels sont les désavantages du séquençage de l'ARN en criblage moléculaire?
Plus coûteux, nécessite expertise
78
Qu'est-ce que la PCR?
La PCR permet d’amplifier les fragments d’ADN.
La PCR repose sur une ADN polymérase thermostable, la Taq polymérase, et nécessite des amorces d'ADN conçues spécifiquement pour la région d'ADN d'intérêt.
Produit PCR utilisé pour séquençage Sanger, mettre sur gel électrophorèse, cloner
79
Qu'est-ce que la PCR standard ?
ADN à ADN
80
Qu'est-ce que la PCR transcription inverse (RT-PCR)?
ARNm à ADNc
81
Quelles sont les étapes d'une PCR?
1) Créer des oligonucléotides complémentaires à chacun des brins de la région à amplifier.
Aussi appelés primers, oligos, amorces
2) Tous les ingrédients pour la recette PCR sont mis ensemble dans un tube.
Taq polymerase + amorces + nucléotides + H20 + buffer = Master mix
Attention, il ne faut pas oublier d’ajouter sa matrice !
3) On met dans la machine ! La réaction va suivre plusieurs étapes:
* Dénaturation: séparation des brins
* Hybridation: liaison des oligos a la matrice
* Extension: la Taq synthétise de nouveaux brins
* On répète ! (Jusqu’à 40 fois)
82
Comment se fait l'analysèrent quantitative de l'ARNm?
Détection du signal fluorescent qui est créé proportionnellement aux produits amplifiés par la PCR
Mêmes étapes que PCR mais l’incorporation de fluorescence permet de mesurer le signal pendant l’amplification (au début de la phase exponentielle)
83
Expliquez la technique de quantification fluorescence SYBR green
* Colorant qui émet une fluorescence (λmax = 497 nm)
* Lie de manière préférentielle l’ADN double brin
83
Quelles sont les 2 approches pour quantifier l'amplification de l'ARNm?
Fluorescence SYBR green
Sonde Taqman
84
Expliquez la technique de quantification sonde Taqman
Réaction PCR a 3 oligos
2 oligos d’amplification (amorces PCR)
1 sonde
La sonde est couplée à une molécule fluorescente et un quencher. Lors de l’amplification, le quencher est détaché et donc le fluorochrome libéré émet un signal.
85
Qu'est-ce que le clonage moléculaire?
Processus qui vise à faire plusieurs copies de l’ADN d’intérêt.
Les bactéries sont souvent utilisées comme hôte.
Système d’entreposage: Le vecteur
Caractéristique: Une origine de réplication, peut être combiné à d’autres morceaux d’ADN, marqueur de sélection.
85
Quels sont les types de vecteurs utilisés en clonage moléculaire?
* Plasmide, phage, cosmide, chromosome artificiel
* Vecteur de clonage: ADN répliqué mais pas exprimé. L’ADN sera extrait
* Vecteur d’expression: ADN est répliqué et peut être exprimé grâce à un promoteur approprié
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Quelles sont les étapes du clonage moléculaire?
Préparation du vecteur
* On ouvre le vecteur avec des enzymes de restrictions.
Préparation de l’insert
* Amplifié par PCR préalablement.
* Digestion avec enzymes de restrictions.
Ligation
* L’insert et le vecteur se lient.
Transformation
* Le vecteur/insert est introduit dans bactéries.
* Les bactéries sont électro ou chimiquement compétentes.
86
Comment peu se faire le criblage des colonies en clonage moléculaire?
Bleu-blanc: Sélection négative
Sélection positive
Digestion enzymatique
PCR
Séquençage Sanger
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Comment se fait le criblage des colonies en clonage moléculaire selon la technique : Bleu-blanc: Sélection négative
* Utilise le métabolisme du lactose
* A-peptides présent dans vecteur et produit b-galactosidase (bleu réaction avec X-gal)
* L’insert perturbe ce peptide
88
Comment se fait le criblage des colonies en clonage moléculaire selon la technique : Sélection positive
* Vecteur exprime un gène léthal
* L’insert perturbe ce gène
89
Comment se fait le criblage des colonies en clonage moléculaire selon la technique : PCR
* Amplification avec des oligos du vecteur spécifique ou insert spécifique
89
Comment se fait le criblage des colonies en clonage moléculaire selon la technique : Digestion enzymatique
* Digestion avec enzyme de restriction
* Vérification sur gel agarose
90
Quelles sont les étapes de l'électrophorèse sur gel d'agarose?
Cathode (-) → anode (+)
L’ADN est chargé négativement
Étapes :
1. Préparer le gel d’agarose
* Typiquement entre 1-2%
* Mettre un peigne pour former des puits
* Une fois refroidit un obtient une matrice solide
2. Préparation des échantillons
* Ajouter un colorant de chargement (parfois déjà dans la PCR)
3. Chargement sur le gel
* Enlever le peigne et mettre le tampon dans la cuve
* Charger les échantillons dans les puits (Attention !)
4. Mettre le courant
* Entre 20 et 100 volts
* Élevé = migration rapide; Bas = séparation plus claire
Possibilité de faire des mini-prep/midi-prep/maxi-prep pour isoler notre plasmide
91
Comment peut se faire la purification de l'ADN?
Électrophorèse sur gel d’agarose
92
Comment se fait la visualisation de l'ADN dans un gel?
Utilisation d’agents intercalants :
* Bromure d’éthidium (EtBr - ATTENTION)
* RedSafe
Les agents intercalants fluorescent lorsqu’exposé aux UV.
L’intensité de la bande d’ADN est basée sur le nombre et la taille des fragments
Attention si on veut quantifier la bande!
Le chargement d’un poids moléculaire permet de déterminer la taille (bp).
Le gel d’agarose ne permet pas de savoir la séquence de l’ADN.
93
Quelles sont les étapes du séquençage de type Sanger pour la vérification de l'identité de l'ADN?
1. Réaction de synthèse des brins (produit PCR comme matrice de départ) avec polymérase et des dNTPS.
2. Des dNTPS couplés a des fluorochromes sont aussi ajoutés.
3. Lors de la synthèse du brin, dès qu’un dNTP avec fluorochrome est ajouté la réaction se termine.
4. La réaction est chargée dans un capillaire (gel acrylamide).
5. Un laser fait la lecture des fluorochromes.
94
Quelles sont les méthodes pour déterminer le rôle que joue les protéines?
1. Production d’anticorps
2. Purification des protéines
3. Expression des protéines
4. Interaction protéines-protéines
5. Interaction protéine-ADN
95
Que sont les anticorps?
Protéines utilisées par le système immunitaire pour détecter un antigène.
En laboratoire, les anticorps sont utilisés pour isoler/lier une protéine.
96
Qu'est-ce que l'épitope?
Région de l’antigène reconnue par l’anticorps.
97
Comment se fait la production d'anticorps de manière monoclonal?
1. L’antigène est injecté dans l’animal (souris).
2. Les cellules immunogéniques B sont isolées de la rate.
3. Co-culture avec cellules tumorales (myélomes).
4. Les cellules fusionnent pour produire un hybridome.
5. Les hybridomes sont cultivés et les cellules qui expriment l’anticorps sont sélectionnées.
6. Il y expansion des clones et production de l’anticorps.
98
Comment se fait la production d'anticorps de manière polyclonal?
1. L’antigène est injecté dans l’animal (lapin).
2. On laisse le temps au cellules B de produire des anticorps.
3. Prélèvement du sang et centrifugation pour isoler le sérum.
4. Purification des anticorps en utilisant une colonne qui contient l’antigène.
99
Qu'est-ce que l'on peut faire avec des protéines purifiées?
* Produire des anticorps
* Déterminer la séquence protéique
* Identifier les interactions entre protéines
100
Quelles sont les deux méthodes de purification de protéines?
1. Chromatographie
2. Immunoprécipitation
101
Expliquer la méthode de purification des protéines : Chromatographie
Une façon de séparer un mélange de protéines sur une colonne.
Interaction des protéines avec la matrice:
* Séparation par charge, taille, hydrophobicité
* Affinité d’une protéine
* La séparation est dépendante du type de matrice, du tampon et des propriétés intrinsèques de la protéine.
102
Avec quoi se fait la purification des protéines par immunoprécipitation?
Utilisation des anticorps pour la purification d’une protéine d’intérêt
103
Quelles sont les méthodes pour mesurer l'expression des protéines?
Western blot
ELISA
Radioimmunoassay
Immunomicroscopie électronique
Immunohistochimie
103
Quelles sont les étapes de la purification des protéines par immunoprécipitation?
1. Préparation du lysat cellulaire (contient plusieurs protéines)
2. Ajout d’anticorps pour capturer la protéine à l’ étude
3. Le complexe protéine-anticorps est précipité (lie billes)
4. Les billes sont récupérées et la protéine est purifiée (changement de concentration saline, pH)
104
Expliquez la méthode pour mesurer l'expression des protéines Western Blot
Méthode la plus utilisée pour mesurer l’expression d’une protéine
Extraire les protéines d’un échantillon (ex. Morceau de cerveau, muscle)
Dans le gel de polyacrylamide
* Les protéines de grande taille migrent lentement (en haut du gel)
* Les protéines de petite taille migrent rapidement (en bas du gel)
* On dose les protéines avant de les mettre sur gel
Habituellement Gel dénaturant (SDS-PAGE)
* Migration en fonction du poids
Gel natif (sans détergeant)
* Migration en fonction du poids et de la charge
Transfert sur une membrane
* Nitrocellulose
* PVDF
Lorsque nos protéines sont transférées sur notre membrane, on peut faire l’immunobuvardage.
105
De quoi avons-nous besoin pour mesurer l'expression des protéines de manière Western Blot?
1. Anticorps primaire (reconnaissance de notre protéine d’intérêt)
2. Anticorps secondaire conjugué avec un isotope radioactif, une enzyme (HRP), ou un fluorophore (reconnaissance de notre anticorps primaire)
106
Comment se fait le fractionnement cellulaire (méthode d'enrichissement)?
Les organelles individuelles dans une cellule, qui variant selon leur poids, peuvent être séparées dans la solution par une série d’étapes de centrifugation.
107
Quelles sont les différences entre le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et le Western Blot?
* Peut quantifier des nanogrammes de protéines (WB – microgrammes)
* Pas de dénaturation
* Ne permet pas de distinguer les isoformes (protéines tronquées)
* Quantification plus précise
108
Expliquez la méthode pour mesurer l'expression des protéines Essai radioimmunologique (RIA)
* Concept: déterminer le ratio de protéines liées: non-liées afin d’identifier la concentration d’un échantillon
* Très sensible pour mesurer les concentrations très basses de protéines
* Les échantillons proviennent habituellement du sang, liquide extracellulaire, ou liquide céphalorachidien
* Exemple d’application: neuropeptides dans le CSF
109
Quelles sont les 2 techniques d'interaction protéine-protéine?
Co-immunoprecipitation
Spectrométrie de masse
110
Expliquez l'interaction protéine-protéine Co-immunoprecipitation
Extension d’IP
Si les partenaires sont connues: Séparer et identifier par SDS PAGE/WB
Si les partenaires sont inconnues: Déterminer par spectrométrie de masse
111
Expliquez l'interaction protéine-protéine Spectrométrie de masse
Détermination effectuée par le ratio masse à charge des protéines, peptides et leurs fragments
Les logiciels comparent la masse calculée des fragments de protéines et peptides à une base de données
112
Quels sont les 3 méthodologies principales de l'interaction protéine-ADN?
1. Test de mobilité électrophorétique (EMSA)
2. IP de chromatine (ChIP)
3. Essai de luciférase
112
À quoi sert l'interaction protéine-ADN?
Étudier l’impact des protéines sur la transcription
113
Expliquez le test de mobilité électrophorétique (EMSA) pour l'interaction protéines-ADN
Utilisé pour déterminer si une protéine est capable d’interagir directement avec une courte séquence spécifique d’ADN
Basé sur le principe que le complexe ADN-protéines migre plus lentement
* L’ADN est marqué radioactivement ou avec la fluorescence
* On mélange l’ADN avec des protéine purifiées
* On charge sur gel et on fait migrer migration
114
Quels sont les avantages du test de mobilité électrophorétique (EMSA) pour l'interaction protéines-ADN?
Détecte les événements de faible quantité, peut tester plusieurs sondes avec le même lysat
114
Quels sont les désavantages du test de mobilité électrophorétique (EMSA) pour l'interaction protéines-ADN?
in vitro, pas quantitatif
115
Expliquez l'IP chromatine (ChIP) pour l'interaction protéines-ADN
Utilisé pour déterminer si une protéine interagit avec une région d’ADN spécifique
1. Liaison de la protéine a l’ADN
2. Sonication pour fragmenter
3. Immunoprécipitation avec un anticorps
4. Inverser la liaison
5. PCR et chargement sur gel
Contrôle négatif: anticorps non spécifique (Ig) et amorces non-spécifiques. On ne devrait pas avoir de signal
Contrôle positif: input. ADN avant immunoprécipitation
116
117
Quels sont les avantages de l'IP chromatine (ChIP) pour l'interaction protéines-ADN?
Matériel de départ = cellules vivantes
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Quels sont les désavantages de l'IP chromatine (ChIP) pour l'interaction protéines-ADN?
Impossible de déterminer si une protéine interagit avec une séquence d’ADN directement ou si elle fait partie d’un complexe
119
Quels sont les désavantages du ChIP-seq pour l'interaction protéines-ADN?
Dispendieux, nécessite plus de tissus et une expertise pour l’analyse
119
Expliquez le ChIP-seq pour l'interaction protéines-ADN
Maintenant très utilisé.
Même approche que le ChIP , mais l’ADN libéré est séquencé (séquençage à haut débit).
L’analyse bio-informatique permet de distinguer les interactions.
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Expliquez l'essai luciférase pour l'interaction protéines-ADN
Concept: Déterminer si une protéine peut activer ou réprimer l’expression d’un gène cible
Bioluminescence (luciférase: enzyme de luciole)
120
Quels sont les avantages du ChIP-seq pour l'interaction protéines-ADN?
Pas limité par des sondes prédéterminées
121
Quels sont les avantages de l'essai luciférase pour l'interaction protéines-ADN?
Connection fonctionnelle, quantitatif
122
Quels sont les désavantages de l'essai luciférase pour l'interaction protéines-ADN?
Ne peut pas détecter si interaction directe
