Livro - Cap1 e 2 Flashcards
(87 cards)
Qual a origem histórica do sistema CRISPR-Cas e seu uso em bactérias?
O sistema CRISPR-Cas teve origem no sistema imune adaptativo de bactérias e archaeas, que atuam para clivar e eliminar DNA invasor de bacteriófagos e plasmídeos.
Este sistema envolve loci CRISPR com repetições e “spacers” derivados de elementos invasores, e genes cas.
Como o sistema CRISPR-Cas9, derivado de bactérias, se tornou uma ferramenta poderosa de edição gênica?
O trabalho crucial que marcou o início do CRISPR como ferramenta biotecnológica foi a demonstração de que as enzimas Cas9 podem ser reprogramadas para direcionar uma sequência de DNA desejada em bactérias.
A partir daí, o CRISPR-Cas9 emergiu como uma ferramenta de edição gênica poderosa, simples e eficiente, capaz de modificar rapidamente genes endógenos em diversos tipos de células e organismos, superando as limitações de métodos anteriores como:
- a recombinação homóloga,
- ZFNs e
- TALENs
Quais são os componentes chave do sistema CRISPR-Cas9 de Streptococcus pyogenes e como ele direciona o DNA?
O sistema tipo II CRISPR-Cas9 de S. pyogenes, o mais amplamente utilizado, funciona como uma endonuclease guiada por RNA que utiliza um duplo guia de RNA (composto por crRNA e tracrRNA) ou um guia simples de RNA (sgRNA) para reconhecimento e clivagem do alvo.
A atividade da nuclease Cas9 é direcionada a qualquer sequência de DNA no formato N20-NGG pela alteração dos primeiros 20 nucleotídeos do RNA guia, que correspondem à sequência alvo.
O reconhecimento de um PAM (Protospacer Adjacent Motif) adjacente ao sítio alvo é uma etapa inicial obrigatória no reconhecimento do alvo por Cas9-RNA.
Além da clivagem de fita dupla (DSBs), quais outras variantes da proteína Cas9 existem?
E para que são usadas?
Existem variantes de Cas9, como:
- as “nickases” - que cortam apenas uma fita do DNA alvo.
- Variantes cataliticamente inativas de Cas9 (dCas9) - são usadas para recrutar domínios efetores para locais específicos do genoma, o que permite aplicações além da edição, como a regulação gênica (ativação ou repressão, conhecidas como CRISPRa e CRISPRi)
O que são os Base Editors (editores de base) e qual sua principal vantagem?
Base Editors são agentes de edição genômica de “segunda geração” baseados em CRISPR que podem converter precisamente uma única base em outra (por exemplo, C para T ou A para G).
A principal vantagem é que eles realizam essa edição sem a necessidade de induzir quebras de fita dupla no DNA (DSBs), que podem levar a mutações indesejadas.
Editores de base são tipicamente construídos fundindo uma nickase Cas9 a uma enzima deaminase.
Como a tecnologia CRISPR tem sido aplicada na engenharia do epigenoma e regulação epigenética?
Abordagens baseadas em dCas (Cas9 inativo) podem ser usadas para manipular o epigenoma.
- Isso inclui o direcionamento de modificações epigenéticas como metilação de DNA e modificações de histonas (metilação, acetilação).
Também podem ser usadas para alterar a expressão de long non-coding RNAs (lncRNAs) via CRISPRi/a e para estudar a organização do genoma e interações com a cromatina.
Quais são alguns exemplos diversos de aplicações da tecnologia CRISPR-Cas mencionadas nas fontes, além da edição gênica básica?
As aplicações incluem:
- Criação de modelos de doenças em linhas celulares e animais.
- Edição gênica in vivo no cérebro de mamíferos.
- Edição multiplex (de vários genes simultaneamente).
- Edição em zigotos/embriões humanos para corrigir mutações ou estudar função gênica.
- Geração eficiente de modelos murinos com alelos condicionais ou de inserção (Easi-CRISPR).
- Desenvolvimento de Gene Drives para controle de populações de vetores de doenças.
- Rastreamento de linhagem celular em nível unicelular.
- Direcionamento e clivagem de RNA (por sistemas como Cas13a).
- Métodos de detecção de ácidos nucleicos ou outros alvos (usando a atividade de clivagem trans de enzimas como Cas12a, ou sistemas reporter como CROSS-FIRE).
- Integração de DNA guiada por RNA (INTEGRATE).
- Titulação da expressão gênica usando RNAs guias modificados.
Existem outras famílias de proteínas Cas além da Cas9 que são usadas para edição ou direcionamento genômico?
Sim.
- As fontes mencionam a família Cas12a (anteriormente Cpf1), que é uma endonuclease guiada por RNA com um domínio RuvC e OBD e reconhece um PAM diferente (5′-YTN-3′), capaz de clivagem de DNA e edição multiplex.
- Também mencionam a família CasX, descrita como uma terceira classe distinta de sistemas CRISPR-Cas com domínios únicos e dobras de RNA e proteína novas, também capaz de regulação e edição genômica direcionada.
Quais são os principais desafios e riscos práticos/técnicos do uso da tecnologia CRISPR-Cas mencionados nas fontes?
Alcançar precisão e eficiência ideais na clivagem e no reparo.
- Entrega eficiente dos componentes CRISPR (Cas9, RNAs guias) a tipos celulares ou órgãos específicos.
- Controlar as vias de reparo do DNA após a clivagem.
- Prever o resultado mutacional após quebras de fita dupla.
- O potencial para efeitos off-target (edição em locais não alvo).
- Indução de deleções grandes e complexas e rearranjos nos sítios alvo ou off-target.
- A introdução de Cas9 pode ativar uma resposta de dano ao DNA mediada por p53, levando à parada do ciclo celular e potencialmente selecionando células com vias p53 deficientes, o que é um risco para certas aplicações.
- A existência de mecanismos de evasão em invasores, como proteínas anti-CRISPR (Acrs) produzidas por vírus para inibir sistemas CRISPR, ou barreiras físicas (como a estrutura núcleo-símile de fagos gigantes).
Quais são as preocupações éticas e sociais destacadas em relação ao uso do CRISPR, especialmente em embriões humanos?
Existem aspectos éticos e morais significativos no uso da edição gênica em embriões humanos.
É crucial que mais estudos sobre os mecanismos moleculares e os efeitos off-target sejam realizados em modelos humanos antes de qualquer aplicação clínica.
What is the primary function of CRISPR-Cas systems?
Editing, regulating, and targeting genomes.
What has genome editing mediated by CRISPR-Cas systems enabled?
Rapid, easy, and efficient modification of endogenous genes in various biomedically important cell types.
What modification has been made to the CRISPR-Cas9 system?
Development of a modified version to recruit heterologous domains for regulating gene expression or labeling genomic loci.
What is the significance of CRISPR-Cas9 systems in biological research?
They can perform targeted, highly efficient alterations of genome sequence and gene expression.
What were early methods for targeting DSB-inducing nucleases based on?
Protein-based systems with customizable DNA-binding specificities, such as meganucleases, ZFNs, and TALENs.
How do RNA-guided nucleases (RGNs) differ from ZFNs (zinc finger nucleases) and TALENs (transcription activator-like effector nucleases) ?
RGNs use base-pairing rules between engineered RNA and target DNA, while ZFNs and TALENs rely on protein-DNA interactions.
What is the role of the protospacer-encoded portion of crRNA in CRISPR?
It directs Cas9 to cleave complementary target-DNA sequences adjacent to PAMs.
What type of CRISPR system is primarily adapted for inducing sequence-specific DSBs?
Type II CRISPR system from S. pyogenes.
What are Cas9 nickases?
Variants of Cas9 that cut one strand of the target DNA site instead of both.
What approach is used to assess the specificity of RNA-guided Cas9 nucleases?
Creating gRNA variants with nucleotide mismatches and examining their ability to direct Cas9 activity.
True or False: Deep sequencing of individual cell clones is effective for defining the full genome-wide spectrum of Cas9 off-target sites.
False.
What strategies can reduce off-target effects of Cas9 nucleases?
Using paired Cas9 nickases and truncated gRNAs (tru-gRNAs).
What is a tru-gRNA?
A truncated gRNA with 17 or 18 nucleotides of complementarity that shows decreased off-target effects.
What are some methods for implementing CRISPR-Cas technology in cells?
Electroporation, nucleofection, and Lipofectamine-mediated transfection.
