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Biología Molecular > Manipulación de genes: ELISA > Flashcards

Manipulación de genes: ELISA Flashcards

1
Q

¿Qué es ELISA?

A

Test inmunológico muy sensitivo

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2
Q

¿Para qué se utiliza ELISA?

A

Para la detección y ciuantificación de:
- Anticuerpos
- Antígenos
- Proteínas
- Glucoproteínas
- Hormonas

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3
Q

Proteína elaborada por las células plasmáticas en respuesta a un antígeno

A

Anticuerpo

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4
Q

¿A qué se une un anticuerpo?

A

A un solo antígeno específico

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Q

¿Qué tipo de anticuerpos se utilizan?

A

De origen monoclonal

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6
Q
A

Anticuerpo

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7
Q

Molécula ajena o tóxica para el organismo que, una vez dentro del cuerpo, induce en este una respuesta inmunitaria

A

Antígeno

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8
Q

¿Qué provocan los antígenos dentro del cuerpo?

A

Formación de anticuerpos

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9
Q

¿Cómo se logra realizar un ELISA?

A

Realizando complejos antígeno-anticuerpo

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10
Q

¿Qué se requiere para realizar un ELISA? (4)

A
  1. Anticuerpos primario y/o secundario
  2. Antígeno
  3. Buffer
  4. Cromogeno o sustrato
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11
Q
A
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12
Q

Pasos generales para realizar un ELISA (4)

A
  1. Recubriemiento
  2. Bloqueo
  3. Detección
  4. Lectura final
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13
Q

¿Con qué se hace el recubriemiento?

A

Con un antígeno o anticuerpo

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14
Q

¿Con qué se hace normalmente el bloqueo?

A

Con la adición de albúmina de suero bovino [BSA]

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15
Q

¿Para qué sirve el bloqueo?

A

Para evitar que en las incubaciones se unan a la placa, de forma inespecífica otras moléculas que podrían interferir con los rescultados

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16
Q

Tipos de ELISA (3)

A
  • ELISA directo
  • ELISA indirecto
  • ELISA sandwich
17
Q
A

ELISA directo

18
Q
A

ELISA indirecto

19
Q
A

ELISA sandwich

20
Q

Pasos de ELISA directo

A
  1. Fijación del antígeno a la placa -> la placa se incuba -> lavado de la placa
  2. Bloqueo de la placa (rellenar los huecos que no fueron cubiertos por el antígeno) -> se añade la proteína bloqueante -> incubar -> eliminar sobrenadante -> lavado de placa
  3. Incubación con el conjugado -> se añade el conjugado (reconoce directamente al antígeno que se busca) -> incubar (conjugado + antígeno) -> si el conjugado reconoce al antígeno, tras la incubación se habrán formado inmunocomplejos que quedan inmovilizados en la placa -> retirar el sobrenadante y conjugado libre -> lavar la placa
  4. Incubación con el substrato/cromógeno -> añadir mezcla de substrato/cromógeno -> incubar (el sustrato se rompe) -> cromógeno cambia de color -> parada de reacción (añadir ácido para neutralizar)

Reacción positiva: color amarillo pálido a marrón

21
Q

Pasos para ELISA indirecto

A
  • El antígeno se inmoviliza sobre una placa
  • Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
  • Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
  • Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una luz visible
  • Detecta y/o cuantifica el antígeno de interés
22
Q

Pasos para ELISA sandwich

A
  • El anticuerpo de captura se inmoviliza
23
Q

Pasos para ELISA sandwich

A
  • El anticuerpo de captura se inmoviliza
  • Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo
  • Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su ves al anticuerpo de captura
  • Se añade un anticuerpo secundario marcado que se unirá al anticuerpo de detección
  • Se añade el sustrato y se proporcionará una señal visible
  • Detección y/o cuantificación del del antígeno
24
Q
A

ELISA directo

25
Q
A

ELISA indirecto

26
Q
A

ELISA sandwich

27
Q

Uso diagnóstico de ELISA directo

A

Analizar la respuesta inmune frente a un determinado antígeno

28
Q

Características de ELISA directo

A
  • Menor sensibilidad
  • Mayor ruido de fondo
29
Q

¿Por qué hay mayor ruido de fondo en ELISA directo?

A

Porque las proteínas de las muestras y los antígenos se quedan en el fondo

30
Q

Uso diagnóstico de ELISA indirecto

A

Determinar la concentración total del anticuerpo en una muestra

31
Q

Características de ELISA indirecto

A
  • Alta sensibilidad
  • Procemiento muy largo
  • Posible reacción cruzada
32
Q

Usos diagnósticos de ELISA sandwich

A

Análisis de muestras complejas

33
Q

Características de ELISA sandwich

A
  • Alta especificidad
  • Alta sensibilidad
34
Q

Tipo de ELISA más simple y rápido

A

ELISA directo

35
Q

¿Por qué ELISA directo tiene un uso limitado?

A

Por su menor sensibilidad y la dificultad para obtener un conjugado que reconozca directamente al antígeno

36
Q

¿Para qué sirven los controles?

A

Para saber que la muestra se realizó correctamente

Biología Molecular (45 decks)

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