Mikroskopi Flashcards
(32 cards)
Vad definierar upplösning?
Hur nära två punkter i preparatet kan vara och fortfarande urskiljas som två punkter
Beskriv skillnaderna mellan Hematoxylin och Eosin vid infärgning (H&E)?
Frågorna som skall besvaras är:
Färg?
Vad den färgar?
Binder till?
PH?
Strukturer som färgas?
Hematoxylin
- Färg: Blå-lila
- Vad den färgar: Sura (basofila) strukturer
- Binder till: DNA, RNA
- pH: Basiskt
- Strukturer som färgas: ex. Cellkärnor, ribosomer
Eosin
- Färg: Rosa-röd
- Vad den färgar: Basiska (acidofila) strukturer
- Binder till: Proteiner i cytoplasma/ECM
- pH: Surt
- Strukturer som färgas: Cytoplasma, kollagen, muskelceller, ECM
Hur förändras upplösningen med våglängderna vid Ljusmikroskopering?
Ju kortare våglängd desto högre upplösning
Vilka olika typer av Ljusmikroskopi används kliniskt och i forskning?
- Bredfältsmikroskopi
- Fluorescensmikroskopi (vidvinkel) med kvicksilverlampa eller LED
- Konfokalmikroskopi
- Super-resolutionsmikroskopi med laser
Beskriv några egenskaper i Bredfältsmikroskopi.
- Ljuset går igenom preparatet
- Ger upplösning på ca 200-300nm
- Faskontrastmikroskopi
- DIC (differential interference contrast))
- Färgade preparat
- Snabb metod där hela provet kan avbildas samtidigt
Beskriv några egenskaper i Fluorescensmikroskopi.
- Brett spektrum av våglängder i lampa
- Ljuset reflekteras tillbaka i preparatet
- Hög specificitet —> målstyrd märkning av proteiner
- Möjlighet att studera levande celler i realtid
- Upplösning: ca 200-300nm
Beskriv några egenskaper i Konfokalmikroskopi.
- Endast en våglängd per laser
- Ljuset reflekteras tillbaka
- Optisk snittning
- Pinhole
- Hög upplösning
- Kan avbilda 3D-strukturer
Beskriv några egenskaper i Super-resolutionsmikroskopi med laser.
- Matematiska beräkningar återger upplösningen
- Bryter ljusmikroskopins diffraktionsgräns, alltså >200nm
- Kan visualisera cytoskelett, organeller etc
Hur mikroskoperar man levande organismer? Vad innebär det?
Faskontrastmikroskopering
- Kan ej färgas in —> belyses istället genom diffraktion
- Gör bakgrunden ljus och objektet mörkt
- Ger en mer tvådimensionell effekt än DIC
Vilken typ av mikroskopering har använts vid objekt b- respektive c?
b = Faskontrastmikroskopering
c = DIC (ger mer 3-dimensionellt utseende)
Varför utförs ofta Histologiska infärgningar med paraffinsnitt? Beskriv kort stegen i processen vid infärgning.
Användningsområden: att visualisera och analysera celler och vävnadsstrukturer. Måste färgas då biologisk vävnad ofta är transparent
- Fixering —> Avstannar livsprocesser
- Dehydrering —> Ta bort vatten
- Paraffin-inbäddning —> Ökar viskositeten för att Möjliggöra snitt, gör provet hårt
- Snittning —> ca 4mikrometer, ljuset måste gå igenom
- Färgning
Vilka typer av fixering används vid histologisk infärgning?
- Korsbindande fixering (formalin etc..)
- Icke-korsbindande fixering (etanol etc.)
Hur utförs Dehydreringsprocessen?
- Etanol
- Klaras i Xylen —> sänks sedan ner i paraffin
Varför gör man H&E infärgning?
- Ger tydliga kontraster mellan cellkärna och cytoplasma
- Identifiering: se olika celltyper, kärnform
- Analys: organ, tumörer, inflammation
Varför gör man Histokemisk infärgning?
- Upptäcka patologiska processer
- Identifiera specifika vävnadstyper och celltyper
- Göra biologiska strukturer synliga
Varför gör man Immunhistokemiska färgningar?
Detektion av specifika antigen (proteiner) med antikropp riktat mot en eller flera epitop
Vilken typ av infärgning är detta? (Om du kan, gissa vilken typ av vävnad)
H&E infärgning
Vävnad: Näthinna
Vilket material används Immunhistokemi (IHC)? Varför?
- Använder antikropp (Polyklonal eller monoklonal)
- Fluorescerande ämne för att upptäcka antikropp
- Riktas mot specifikt protein, kan färga in oönskade strukturer också
Hur används Polyklonala antikroppar
- Kommer från flera B-Cellkloner
- Injektion av peptid som genomgått olika post-translationella modifieringar (glykosylering, fosforylering etc.)
- IgG-antikropp vanligast
- Sprutas in i djur
- Kan bli ospecifik bindning då den kan binda till flera epitop
- Separerar ut antikroppar specifika mot antigenet
Hur används monoklonala antikroppar?
- Kommer från en enda B-cellklon
- Identifierar antispecifik plasmacell
- Binder till en enda epitop
- Mindre signal men mer exakt
- Används när hög specificitet krävs: diagnostik av olika proteiner
Beskriv kortfattat principen bakom IHC.
- Deparaffinering —> annars binder ej antikropp
- Rehydrering
- Blockering —> för att få ut protein, serum används från djuret där antikropp är gjord
- Primär antikropp
- Sekundär antikropp
- Motfärgning av ex Hematoxylin för att se cellkärna
(Säkerställa att antikropp binder: icke-joniskt detergens)
Vad är skillnad mellan direkt- respektive indirekt IHC?
- Direkt IHC = Enzymet sitter direkt på primärantikroppen
- Indirekt IHC = Primären osynlig och enzymet sitter på sekundärantikroppen
Beskriv Fluorescensmikropets egenskaper.
- Bredfält
- Reflekterat ljus
- Ljuset ger alla våglängder
- Filter används för att skilja ut våglängd där Fluoroforrn exciteras/emitterar ljus
- Ljuset detekteras med kamera
Varför använder man Fluorescensmikroskopi?
- Studera levande vävnad
- Cell/djur uttrycker fluorescenta proteiner som kan ge information
