module 4: clonage Flashcards
(44 cards)
quels sont les composantes nécessaire à une réaction PCR?
tampon dNTPs Amorces Matrice d'ADN à amplifier Polymérase thermophile
quelles sont les 3 étapes répétées dans un PCR
la dénaturation
La rénaturation
L’élongation
classer en ordre croissant les étapes du pcr par leur température?
renaturation–>élongation–>dénaturation
qu’est ce qu’un 2 step PCR
un pcr ou l’on saute l’étpe d’élongation
Quels sont les conditions qui permettent de faire un 2 step PCR
Pourquoi chque condition permet le PCR 2 step
-amorces avec un Tm élevé (permet de faire l’élongation longtemps pendant le réchauffement de la température de ranaturation à la Tdénaturation
Produits de PCR courts permet de faire l’élongation rapidement
Polymérase rapide Permet de faire l’élongation rapidement
Un PCR traditionnel fait une amplification exponentielle, comment pourrait on faire une amplification linéaire?
en utilisant une seule amorce
quand est ce qu’on va utiliser des amorces longues ou courtes pour un PCR?
on va utiliser des amorces courtes si elles sont riche en GC et longues si riches en AT
qu’est ce qui résulte de l’amplification fait avec des amorces formant des structures secondaires stables?
il n’y a pas/peu d’amplification
qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybdridation trop faible?
l’hybridation se fait de manière non-spécifique
qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybridation trop élevée
Diminution de l’efficacité du PCR
Générallement, quelle tmepérature utilise-t-on comme température de renaturation?
Tm - 5 degrés
quelles sont les caractéristiques optimales pour une polymérase de PCR?
haute thermostabilité
taux de polymérisation rapide
Haute fidélité
Haute processivité
qu’est ce que l’activité 5’-3’ exonucléase?
dégradation de nucléotides qui se trouvent déjà sur le brin
Qu’est ce que l’activité 3’-5’ exonucléase
Activité correctrice de l’ADN synthétisé
quel est l’avantage d’utiliser une polymérase qui a l’activité 3’-5’ exonucléase
ces polymérases font moins d’erreur
qu’est ce que l’activité terminal transférase
La capacité d’ajouter un nucléotide additionnel à chaque extrémité de fragments
qu’est ce qui arrive si une polymérase à faible processivité décroche?
une autre polymérase va venir s’accrocher sur le brin et finir le travail
récemment, on a amélioré la polymérase TAQ avec un domaine Sso7d, quelle est la fonction de cette modification?
elle augmente la processivité de la taq
pourquoi n’utilise-t-on pas toujours les polymérase avec les meilleurs caractéristiques?
elles sont générallement plus dispendieuses
comment peut on optimiser un PCR qui fonctionne mal?
chagement du tampon (pH, ions Mg, additifs)
Optimisation de la température de renaturation
Changer la polymérase
changer les amorces
Comment fonctionne un gradient de température dans un PCR
Les tubes dans l’appareil ne sont pas tous à la même température.
Comment réalise-t-on la méthode ‘‘hot start’’ dans un PCR?
par séquestration de composantes essentielle au PCR (Mg ou polymérase)
Par ajout de groupements chimiques thermolabiles sur les amorces
Par inactivation de la pol par des Ac /pol mutante sensibles au froid
à quoi sert le ‘‘hot start’’
à empêcher la polymérisation d’hybridation non spécifique pendant le réchauffement du tube de PCR
Comment fonctionne la stratégie ‘‘touch down’’
Utilise une température de renaturation très élevée puis la déscendre à chaque cycle
