Quiz 2 : transcriptomique Flashcards
Quelles techniques servent à quantifier l’expression des gènes?
le buvardage northern
PCR +RT-qPCR
Puces à ADN
Séquencage d’ARN
Selon quel principe fonctionne le buvardage northern?
On peut séparer les molécules d’ARN sur gel selon leur taille par électrophorèse puis hybrider ceux-ci sur une membrane
Pourquoi est il essentiel d’utiliser un milieu dénaturant lors d’un northern Blot
Les ARN sont un brin unique qui risque de se replier dans une conformation 3D stable sur gel. Le milieu dénaturant empêche l’ARN de se replier
Quelles sont les trois bandes qui devraient être plus intense dans un extrait d’ARN total après l’électrophorèse?
Les ARN ribosomaux
Pourquoi utilise-t-on du papier absorbant pour transférer l’ARN du gel vers une membrane après l’électrophorèse?
Pour créer un effet capillaire qui emporte l’ARN vers le papier, seulement pour être attrapé par la membrane
Comment peut on quantifier un échantillon d’ARN par buvardage northern
La sonde utilisée pour révéler le gène révele aussi un controle pour une bande pour un gène dont l’expression est connu et constante est connu
pourquoi la quantification de l’ARN se fait par unité d’expression plutot que de concentration
L’expression d’un gène est directement proportionnel à la quantité de son ARN.
Comment mesure-t-on la taille d’un transcrit sur la membrane du northern blot?
en utilisant des marqueurs de taille moléculaire qui seront révélés en même temps que les ARN sur la membrane
Quels sont les points les plus importants lors de la réalisation d’un northern blot
Il faut éviter la dégradation des ARN par des RNases
il faut choisir judicieusement la température d’hybridation des sondes
Quelle est générallement la température d’hybridation des sondes lors d’un Northern blot
25 degrés sous le tm de ces sondes
Les sondes sont elles plus spécifiques à haute température ou à faible température?
à haute température.
quel type d’ADN est analysé lors d’un RT-qPCR et comment est il préparé
ADNcomplémentaire.
on utilise un reverse transcriptase pour faire de l’ADN complémentaire au brin d’ARN présent initialement dans l’échantillon
quels types d’amorces peuvent être utilisés pour faire la reverse transcriptase? quel type d’ARN est rétro-transcrit par ces amorces?
des amorces spécifiques à un gène d’interêt : seulement le gêne d’interêt
Des amorces aléatoires: tous les ARN de l’échantillon
Des amorces poly-dT: tout les ARN qui possèdent une séquence poly-A, donc les ARNm
qu’est ce que le point CT dans un qPCR.
Comment ce CT est il correlé avec la quantité d’ARN initialement analysé?
c’est le point ou la fluorescence de l’échantillon d’ARN traverse un threshold spécifique.
Plus le CT est faible, plus il y avait d’ARN dans l’échantillon initial
plus le CT est élevé, moins il y avait d’ARN dans l’échantillon initital
comment fonctionne l’agent fluorescent SYBR green
Le fluorescent n’émet de la lumière que lorsqu’il est lié dans l’ADN double brin.
il émet donc de plus en plus au fur et à mesure que les cycles de PCR passent
Comment fonctionne les sondes Taqman
Elles dépendent de l’activité 5’-3’ exonucléases de la Taq polymérase (activité charrue) pour retirer la sonde de l’ADN, ce qui libère sa portion fluorescente d’une portion quencher
quelle sonde entre SYBR green et Taqman est spécifique à un gène précis?
La sonde Taqman
peut on détecter plusieurs gènes différents avec la sonde Taqman ou SYBR green lors du qPCR.
Comment?
oui, on peut mettre des fluorophores de couleurs différentes pour des gènes spécifiques avec la sonde Taqman
expliquer la méthode relative pour la quantification de l’ADN dans un qPCR
on compare l’abondance d’un ADN avec d’autres échantillons qui proviennent de gène ‘‘housekeeping’’ qui ne varient que très peu.
expliquer la méthode absolue de quantification d’ADN par qPCR
on compare l’abondance d’un ADN avec un standards interne pour lequel on connait la concentration exact en ADN (préparation de plasmides avec courbes standard)
quels sont les controles critiques du RT-qPCR
Controle 1: s’assurer du bon état des ARN que l’on analyse. Des ARN dégradés ne donneront pas des résultats fiables
Controle 2: faire une réaction de RT sans transcriptase inverse pour vérifier s’il y a de l’ADN génomique dans l’échantillon d’ARN initial
Controle 3: Utilisation de standards internes dans les qPCR avec des gènes dont l’expression ne varie pas pour minimiser l’impact des manipulations sur les résultats
à quoi sert la courbe de dissociation dans un RT-qPCR?
à détecter la présence de contaminants dans l’échantillon
Comment interprete-t-on les résultats d’une courbe de dissociation pour un RT-qPCR
Chaque pic correspond à un produit amplifié.
La présence de 2 ou plus pics démontre donc qu’il y a un contaminant
qu’est ce qu’on retrouve sur une puce à ADN?
Tout les gènes qu’on souhaite analyser dans les échantillons
