Módulo 2: Citometria de Imagem

Question 1

O que é citometria de imagem?

Answer 1

Obtenção de dados citométricos a partir de imagens de células

Question 2

Quais são os 4 componentes básicos de Citometria de Imagem?

Answer 2

1. Amostra celular
2. Marcadores celulares
3. Plataformas/equipamento
4. Software de análise

Question 3

Quais são as current trends em citometria de imagem?

Answer 3

• Imaging de alta velocidade
• imaging de alta resolução
• citometria cinética de imagem
• machine learning (AI)

Question 4

Exemplos de microscópios de fundo claro são:

Answer 4

• Microscópio vertical
• Microscópio invertido

Question 5

Que componentes estão envolvidos na formação de imagens?

Answer 5

Componentes óticos
* iluminador
* condensador
* amostra
* objetiva
* ocular
* detetor (olho do observador ou câmara)

Question 6

Para que serve o diafragma de campo?

Answer 6

Determina o tamanho do campo de luz que incidente.

Question 7

As objetivas do microscópio são responsáveis pela formação de imagem …

Answer 7

primária

Question 8

As objetivas são responsáveis para determinar a … e a …

Answer 8

• Ampliação
• resolução

Question 9

As objetivas de menor potência tem aberturas numéricas (NA) maiores/menores.

Answer 9

Menores

Question 10

As objetivas de menor potência são usadas com óleo?

Answer 10

Normalmente não

Question 11

Qual é o nº da maior abertura numérica, teoricamente possível apenas com ar?

Answer 11

1

É praticamente impossível que seja maior de 0.95 a seco

Question 12

A abertura numérica depende de:

Answer 12

• Indice refração entre a lente frontal da objetiva e a amostra
• abertura semicircular da objetiva

Question 13

O que é abertura numérica?

Answer 13

Capacidade que as objetivas têm de colher luz e resolver detalhes finos a uma distância fixa da objetiva

Question 14

Quanto menor for a abertura numérica maior/menor é o cone de luz.

Answer 14

Maior

Question 15

Quanto mais próxima a objetiva estiver da amostra, o ângulo do cone aumenta/diminui, logo NA aumenta/diminui

Answer 15

Ângulo aumenta
NA aumenta também

Question 16

Como se pode aumentar o número de abertura?

Answer 16

Com meio de imersão (óleo, água, glicerina)

Question 17

Que propriedade o líquido de imersão deve ter para evitar a degradação da imagem?

Answer 17

Deve ter um indice de refração idêntico ao da lamela de vidro.

Question 18

Define resolução:

Answer 18

Distância mínima entre dois pontos de modo a que ainda se podem distinguir

Question 19

Uma das características mais importantes do sistema ótico de um microscópio é a capacidade de:

Answer 19

Resolução

Question 20

A resolução de um microscópio depende da:

Em que se divide

Answer 20

Abertura numérica total
Abertura numérica objetiva + condensador sub-estágio + comprimento de onda da luz

Question 21

Quanto maior/menor for a abertura numérica total, maior será a resolução.

Answer 21

Maior NA

Question 22

Quanto maior/menor for o comprimento de onda da luz, maior é a resolução.

Answer 22

Comprimento de onda menor

A melhor seria UV light!

Question 23

Qual é o principal fator de perda de fluorescência?

Answer 23

Foto-oxidação

Question 24

Como se pode retardar a perda de sinal fluorescente?

Answer 24

Adicionando agentes redutores ou necrófagos de ROS:
* N-propil-galato
* Mercaptoetanol

Question 25

A luz pode constituir citotoxicidade?

Answer 25

Sim, fototoxicidade, devido à irradiação de luz e à presença de oxigénio.

Question 26

A transferência não radioativa de energia de um fluorocromo para um cromóforo dá-se o nome de:

Answer 26

Transferência de enrgia por ressonância

Question 27

A microscopia de fluorescência é menos distrutiva que a microscopia ...

Answer 27

eletrónica

Question 28

O que torna a microscopia de fluorescência tão abrangente?

Answer 28

* alta seletividade (marcação) * grande contraste (próprio microscópio)

Question 29

Uma **estimativa** das **concentrações** locais pode ser feita através de um microscópio ...

Answer 29

... de fluorescência de campo largo

Question 30

De todas as sondas que ligam ao DNA, quais são aquelas que se ligam de forma estequimétrica? ## Footnote O RNA deve sofrer algum processamento?

Answer 30

* DAPI * Hoechst * PI ## Footnote Sim, hidrolisado, visto que as sondas também se podem ligar a ele (PI tem alta afinidade para RNA) (PI também pode competir com proteínas)

Question 31

Quais são as limitações da microscopia de fluorescência?

Answer 31

* photobleaching * fototoxicidade * resolução espacial limitada

Question 32

Quais os 3 componentes básicos de microscopia?

Answer 32

* fonte de alimentação * lentes de aumento * dispositivo de aquisição de imagem

Question 33

Para uma boa resolução e qualidade de imagem, os microscópios fluorescentes devem separar ... da ...

Answer 33

eficientemente, separar a luz excitante da luz fluorescente

Question 34

Para que serve um filtro de excitação?

Answer 34

Para filtrar o comprimento de onda desejado da gama de comprimentos de onda da luz excitante.

Question 35

Para que serve o espelho dicróico?

Answer 35

Refletir o comprimento de onda excitante e permitir a passagem do comprimento de onda fluorescente

Question 36

Quais são as lâmpadas mais comuns em microscopia?

Answer 36

* mercúrio * Xénon * lasers

Question 37

Quais as vantagens de se usar lasers em relação às lâmpadas?

Answer 37

* luz quase monocromática * estabilidade dos feixes de luz * capacidade de focalizar feixes de luz

Question 38

Quais eram as desvantagens de se utilizar lasers?

Answer 38

* custo * gama reduzida de linhas de emissão (comprimentos de onda)

Question 39

Que lampadas existem num microscópio de fluorescencia?

Answer 39

* halogéneo: visualização inicial * mercúrio/xénon: excitante para fluorescencia

Question 40

Num microscópio de varrimento laser confocal, são necessários filtros de excitação? Porquê?

Answer 40

Não, pois a fonte de luz são lasers que por fornecerem luz monocromática, não necessitam de um **filtro de excitação** para selecionar o comprimento de onda desejável.

Question 41

Num microscópio confocal, é necessário **filtro de emissão**?

Answer 41

Sim, para impedir que a luz excitadora atinja o detetor.

Question 42

Num confocal, o detetor é substituido por ...

Answer 42

... fotomultiplicador

Question 43

Um microscópio confocal melhora a ... e ...

Answer 43

resolução axial e lateral

Question 44

De que forma é que um confocal constroi a imagem a ser analisada?

Answer 44

Pixel a pixel pela recolha de fotões emitidos

Question 45

O confocal tem a capacidade de obter imagens bem focalizadas de várias profundidades dentro da amostra. Como se chama esse processo?

Answer 45

Seccionamento ótico

Question 46

Como é que se atinge o seccionamento ótico?

Answer 46

Através de um **pequeno orifício antes do detetor** que impede a emissão de luz** fora do plano de foco**

Question 47

Quais as vantagens do confocal em relação ao MO?

Answer 47

* Eliminação do ofuscamento fora de foco * capacidade de recolher secções óticas em série a partir de amostras espessas * Reconstrução 3D das amostras analisadas

Question 48

Quais as desvantagens do confocal?

Answer 48

* apesar de recolher só no plano de foco, gera-se fototoxicidade em toda a amostra * a profundidade de penetração é limitada pela absorção de energia em camadas mais profundas

Question 49

Para imagem em 3D, a ... é melhor que o confocal

Answer 49

microscopia de fluorescencia multifotónica

Question 50

Qual a diferença da microscopia de fluorescência multifotônica para o confocal?

Answer 50

* Não necessita de orifício no detetor (o laser excita só no ponto de foco) ## Footnote A emissão fora do foco é insignificante

Question 51

A microscopia de fluorescencia multifotónica apresenta a vantagem de ... em relação ao confocal.

Answer 51

redução de fotobleaching e fototoxicidade

Question 52

O facto de se bombardear a amostra com dois fotões faz com que o fenómeno de Stokes...

Answer 52

Seja revertido (anti-stokes): a luz fluorescente tem menor comprimento de onda que a excitante

Question 53

Como a microscopia de fluorescência multifotónica é mais precisa, podem-se usar comprimentos de onda na gama do ... . Isto leva a que a penetração seja mais/menos profunda.

Answer 53

vermelho/infravermelho profunda

Question 54

A resolução de um microscópio de fluorescência multifotónica é maior que a de um confocal? Porquê?

Answer 54

Não! A utilização de luz com comprimento de onda maior (infrared/red) resulta num spot de resolução maior. O que não der para resolver no confocal, não dá para resolver no multifotónico

Question 55

Em que consiste o Forster Resonance Energy Transfer (FRET)?

Answer 55

Transferência de energia de um fluorocromo excitado para outra moléc dadora.

Question 56

Em FRET, a que distância as duas moléculas devem estar para que aconteça este fenómeno?

Answer 56

10 nm

Question 57

Para que pode ser utilizado o FRET?

Answer 57

* Determinar interações moleculares * determinar distâncias moleculares

Question 58

Em FRET, a transferência de energia é radioativa?

Answer 58

Não!

Question 59

Para além da distância, o FRET depende de:

Answer 59

* sobreposição espetral do espetro de emissão e excitação do dador e aceitador * orientação relativa do momento dipolo do dador e aceitador

Question 60

Quais as desvantagens do FRET?

Answer 60

* Limitação ao estudo de complexos proteicos/ proteínas muito grandes

Question 61

Que aplicações tem o FRET na biologia celular?

Answer 61

* estrutura e conformação de proteínas * distribuição espacial de proteínas * qPCR (annealing) * interação prota-prota * etc

Question 62

A combinação de FRET + ... permitiu limites de resolução de luz de cerca de ....

Answer 62

microscopia ótica 200 nm

Question 63

Um nanoescópio utiliza quandos lasers? Para que serve/m?

Answer 63

2 * 1 excitador * 1 cancelador da fluorescência exceto a de um volume de 1 nm