Moleküler Genetik Teknikleri

Question 1

İki tip klonlama vardır

Answer 1

Reprodüktif (üreme) klonlaması : bir bireyin kopyasını yapmak Dolly insanda illegal ve yapımı zor

Moleküler klonlama(gen veya DNA klonlama): bilimcilerin belli bir genin veya genlerin bir hücre içerisinde birbirinin aynısı olan kopyalarını yapmalarına ve belli genlerin ne yaptığını ve nasıl çalıştıklarını incelemelerine yardım etmek için kullanılan tekniktir
Kısacası bir genin ne yaptığını anlamak için kullanılır. Biyoloji lablarında rutin olarak uygulanır

Question 3

Genin çok sayıda kopyası nasıl yapılır

Answer 3

Bakteriler ve plasmidler kullanılır
Plasmidler bakteriyel kromozomdan ayrı olarak replike olabilen küçük halkasal DNA molekülleridir.
Esası: yabanci DNA bir plasmide yerleştirilir ve rekombinat plasmid bir bakteri hücresine yerleştirilir. Bakteri hücresinde üreme yabancı DNA içeren plasmidin klonlanmasıyla sonuçlanır

Klonlanmış genler spesifik bir genin kopyalarını yapmakta ve protein ürününü üretmekte faydalıdır.

Question 4

DNA teknolojisinin pratikteki uygulamaları

Answer 4

Farmasötikal ürünler (ilaç)
İnsan gen terapisi (özellikle tek gendeki bozuklukların tedavisi)
Medikal uygulamalar
Hastalıkların teşhisi
Forensik kanıtlar ve genetik profilleme
Çevresel temizlik
Tarımsal uygulamalar
Bitkilerde genetik mühendislik
Hayvan sürü üretimi

Question 5

Polimorfik gen nedir

Answer 5

Bir gen eğer spesifik nir lokusta birden fazla alelle sahiptşr
Gen polimorfizmi genomun herhangi bir yerinde oluşabilir ağırlıklı olarak sessizdirler azısı görünür

Question 6

DNA klonlamada restriksiyon enzimleri ve DNA ligaz elzem rol oynar

Answer 6

Bakteriyel restriksiyon enzimleri (endonükleazlar) DNA molekülünün restriksiyon bölgeleri denilen özel DNA dizilerinden keserler. Genellikle birden fazla kesik yapar böylece restriksiyon fragmantları (parçaları) yaratır.
DNA ligaz restriksiyon parçalarının arasındki boşluğu kapatan bir enzimdir.
Restriksiyon enzimleri palindromik dizilerden keserler. (Düz ve tersine aynı okunan) Bu bölgeye özel kesikler (yapışkan veya kör) tek zincir uçları birbirine komplementer olan restriksiyon parçalarının oluşumuyla sonuçlanır

Question 7

Yapışkan olmayan (blunt) uç ve yapışkan (sticky) uç

Answer 7

Her iki zincir bir baz çiftiyle sonlanır bundan dolayı DNA ligazla düşük verim

Sticky (yapışkan) uçlarda her iki zincir çeşitli sarkıtlarla sonlanır

Question 8

Klonlama vektörü nedir

Answer 8

Bir klonlama vektörü bir konakçı hücrede bağımsız bir şekilde kopyalama kapasitesine sahip olan küçük çift zincirli halkasal bir DNA parçasıdır. Bu plasmid , viral kromozom veya maya kromozomu olabilir.

Question 9

Klonlama vektörleri üçe ayrılır bunlar

Answer 9

1. Klonlama (plasmid) vektörleri : sıklıkla eklenmiş genin çok sayıda kopyasını yapmak amaciyle yabancı DNA parçasını konsk hücreye taşır

2.Ekspresyon vektörleri: hedef hücre içerisinde spesifik bir genin proteine ekspresyonunu sağlamak için özellikle gereken regülatör diziler içerirler

3. Mekik (shuttle) vektör: kendi konakçı organizması dışında veya bir prokaryotik ve ökaryotik olmak üzere iki farklı hücre tipinde replike olabilendir ( yapay maya kromozomlarının e.coliye eklenmesi)

Question 10

Klonlama (plasmid) vektörleri üç fonksiyonal kısmı içerir

Answer 10

1. Palindromlar (radarlar)
2. Replikasyın orjini
3. Antibiyotik resistansı

Kaynak plasmid pBR 322

Question 11

Ekspresyon vektörleri şunları içermelidir

Answer 11

Experesyon sinyalleri
Promoter
Transkripsiyon terminasyon sekansı
Shine dalgrano sekansı

Question 12

DNA klonlama yöntemleri

Answer 12

Genomik DNA : restriksiyon enzimleri DNA’yı parçalara ayırır. Nükleer DNA’nın tamamı klonlanır. Genler intronlarını içerir

cDNA ( komplementer DNA): hücredeki mRNA’ların reverse transkripsiyonu
Exprese olan genler klonlanır
Genlerin intronları içermez

Question 13

PCR nedir

Answer 13

DNA’yı tesbit ve çoğaltmak

Question 14

DNA klonlama teknolojisi bize ne sağlar

Answer 14

Bireyler arasında gen ve alellerin karşılaştırılması, bir bedendeki gen ekspresyonunun yerini saptamak (lokalizasyon), bir genin bir organizmadaki rolünü saptamak ve genlerin analizini sağlamak

Question 15

DNA karakterizasyonu için gereken teknikler

Answer 15

Restriksiyon enzimleri
Restriksiyon haritaları
Jel elektroforezi
Gen klonlama teknikleri
Sanger dizi analiz tekniği

Question 16

Jel elektoforozi

Answer 16

Genomu hızlıca analiz etme ve karşılaştırmada indirek bir metod
Bu teknik nükleik asidleri ve proteinleri büyüklüklerine göre ayırmak ve saflaştırmak için jeli moleküler elek gibi kullanır
Bir akım uygulanması yüklü molekülerin jel içerisinde hareketini sağlar
Moleküler büyüklüklerine göre bandlar şeklimde ayrılırlar

Question 17

Sanger metodu

Answer 17

Klonlanmış DNA’ların dizi analizi (sekans) floresan işaretli ddNTPs kullanıldığ (radyoaktif veya floresan şekilde işaretleme) dideoksi zincir sonlanması metodu yani sangerle hizlıca yapılır
Amaç sekansı yapılacak olan DNA parçasından kesik yavru diziler sentezlemektir. Bu diziler uçlarından işaretlenmiş olup birbirinden uzunluk dahil farklıdır

Jel elektroforezi kullanılarak orjinal dizi bulunabilir

Question 18

Hibridizasyon (blotlama yani lekeleme) teknikleri

Answer 18

Southern blotlama : kompleks karışım içinde bulunan spesifik bir DNA fragmentinin saptanmasıdır (jel elektroforezi destekli)

Northern blotlama: southern ile benzerdir farkı RNA’yı ve miktarını saptaması önemli teknik problem RNA yıkımı olmasıdır mRNA

Western blotlama: bir karışım içinde bulunan spesifik bşr proteini antibodi kullanarak saptar

Question 19

İnsan hastalık genlerinin yerlerinin saptanması ve tanımlanmalarında southern blotlama tekniklerinin kullanımı

Answer 19

1. Yok olma mutasyonu için bir uygulama : sistik fibrosis teşhisi
2. RFLPler ve genetik test (VNTRler için bir uygulama): orak hücre anemisinteşhii

Question 20

Restriksiyon enzimleriyle DNA parmak izi beya profilini çıkarma

Answer 20

Bireyleri genetik olarak tanımlama
Genetik tespitlerde sadece fenotipim karakteristiklere bakmak yerine DNA fragmantları ve uzunlukları farklılık markerları olarak parmak izleri kullanabilir
Forensik ve kriminal kullanım ayrıca haritalama hastalık tespiti ve bitki seerek yetiştirme gibi alanarda da kullanılır

Question 21

Genetik (DNA) varyasyonları farklılıkları beş ana sınıfa ayrılır

Answer 21

1. RFLPler : kişiler arasındaki restriksiyon enzimleriyle kesilen fragmentlerin uzunluklarının farklı olması
2. VNTRler (minisatellites): değişken sayıda tandem tekrarlı dizilerdir bazı RLFPlere katkı sağlar

3.STRler veya SSRler: sıkça 2 ila 4 nükleotid dizileri tekrarlarıdır ve dizi tekrarındaki varyasyonu gösterir

4. SNPler: genomda tek bir nükleotiddeki farklar (orak hücre anemisinde olduğu gibi)
5. CNVler : bireyler arasında bir genomun kısımlarının tekrarının sayısı değişir

Question 23

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) nedir

Answer 23

DNA’yı tespit ve çoğaltma
Kullanıldığı alanlar: genetik testler, adli tıp, babalık testleri, patojenlerin saptanmasında ( bakteriyal ve viral enfeksiyonlerın teşhisi), antibadilerin bilgi vermediği durumlarda (HIV testi)
Kullanım için çoğaltılacak DNA bölgesinin iki ucundaki sınırdaş bölgeleri bilinmeldir
Üç basamaklı döngü ısıtma soğutma replikasyon

Question 24

PCR şuna gerek duyar

Answer 24

1. Kalıp : çoğaltılacak DNA’yı içeren bölge
2. Primerler
3. DNA ( genellikle Taq)
   4.Deoksinükleotidler
4. Örneği ısıtma soğutma sistemleri
5. Amplifikasyon: kopya yapılması

Question 25

RT PCR nedir

Answer 25

Standart PCR’ın spesifik mRNA çoğaltılmasını içeren versiyonudur PCR ve RT PCR kombinasyonu kuantitatif RT PCR veya qRT PCR olarak bilinir RT PCR Northern blotlamadan daha hızlı ve hassastır.

Question 26

cDNA yapmak için ne lazım

Answer 26

mRNA’ya revers transkriptaz eklenirbu ilgilenilen genin PCR ile amplifikasyonu için kalıp görevi yapar. Ürün bir jelde yürütülür ve ilgilenilen mRNA saptanır

Question 27

İki tür mikroskop vardır bunlar

Answer 27

Işık mikroskopu Elektron mikroskobu

Question 28

Işık mikroskopu görüntü kalitesi şunlara bağlıdır

Answer 28

Magnifikasyon Resolüsyon netlik ölçüsü Kontrast görünür farklılıklar

Question 29

Elektron mikroskobu iki ana tipi vardır

Answer 29

SEM ve TEM

Question 30

In situ hibridizasyonu

Answer 30

İntak (bütünü korunmuş) organizmada spesumRNA’ların asıl yerindeki (in situ) lokasyonunun tesbitinde problara tutturulmuş floresan boyalar kullanır

Question 31

FISH nedir

Answer 31

Kişinin genomunda spesifik bir genin veya DNA dizisinin nerede bulunduğunu gösteren bir tekniktir

Question 32

Karyotip analizleri

Answer 32

Bütün bir kromozomun veya bir kısmının kaybı veya eklenmesi ya da translokasyonları gibi büyük kromozom anomilerini tesbit edebilir Açık ve koyu bantlar veren bazı boyalarla boyanır. Bu bantlar A ve T’nin G ve C’ye karşı olan oranındaki bölgesel değişiklikleri yansıtır. Her kromozomun bantlama modeli spesifiktir

Question 33

DNA mikroarrsy analizi

Answer 33

Farklı dokularda farklı zamanlarda veya farklı koşullarda gen ekspresyonu modellerinin karşılaştırılmasını sağlar. Teknik : toyal mRNA izole edilir ardından revers transkriptazla cDNA yapılır. cDNA karışımı her spotta farklı bir gen içeren mikroarraye uygulanır. Ardından komplementer DNA ile hibridize olur. cDNA fazlası yıkanarak uzaklaştırılır ardından floresanlı bölge için tarama yapılır

Question 34

Gen fonksiyonunun tesbit etmenin bir yolu geni çalışmaz yapmak ve sonuçları gözlemlemektir. Bunun için iki metod vardır

Answer 34

Dominant negatif mutasyonlarve RNA interferens (RNAi)