november 2015

Question 1

Ovenfor er vist et lysmikroskopisk billede af et væv.
1.
a. Angiv navn for A-D.
b. Redegør for dannelse af struktur A.

Answer 1

1.

a) A: Haversk system/Cortikalt osteon, B: Haversk kanal, C: Canaliculi, D: Lakune/osteocyt.
b) Det Haverske system er opstået ved aktivitet af osteoklaster, der har udhulet en tunnel med en diameter på typisk omkring 150 μm igennem allerede eksisterende knoglevæv. Efterfølgende har osteoblaster sat sig på tunnelens sider og har ved successive bølger af aktivitet deponeret osteoid, der efterfølgende mineraliseres. Dette giver ophav til en indadrettet knoglevækst med lagvis indfangning af osteoblaster i lakuner (som i D). Osteoblast aktivitet ophører og efterlader en Haversk kanal (som i B), der indeholder løst bindevæv, nerver og karforsyning.

Question 2

Answer 2

Question 3

Answer 3

Question 4

Answer 4

Question 5

Answer 5

Question 6

Answer 6

Question 7

Answer 7

Question 8

Answer 8

Question 9

Answer 9

Question 10

Answer 10

Question 11

Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.

Angiv hvor i den sekretoriske pathway nysyntetiserede opløselige proteiner med mannose-6-fosfat er lokaliseret.

Answer 11

De opløselige proteiner ville være lokaliseret i lumen af lysosomer.

Question 12

Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.

Angiv hvor i den sekretoriske pathway nysyntetiserede opløselige proteiner, som indeholder et ER retention signal (KDEL-signal i proteinets C-terminale ende), er lokaliseret.

Answer 12

De opløselige proteiner ville være lokaliseret i lumen af ER (evt. en lille mængde i cis siden af Golgi apparatet).

Question 13

Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.

Forklar hvorvidt det er muligt at lokalisere nysyntetiserede, opløselige proteiner, indeholdende en mutation der ødelægger ER retention signalet, i cellerne.

Answer 13

Hvis retention signalet er ødelagt, vil de opløselige proteiner efter 120 minutter være secerneret via den konstitutive exocytotiske pathway, og således vil de opløselige proteiner ikke kunne lokaliseres i cellen. Alternativt kan der svares, at de opløselige proteiner på grund af mutationen bliver nedbrudt, hvorfor de ikke kan lokaliseres i cellen.

Question 14

Proteiner, som translokeres til ER lumen, kan modificeres co- og posttranslationelt.
4. Beskriv funktionen af to proteinmodifikationer der typisk foregår i lumen af ER.

Answer 14

Proteiner kan N-glykosyleres i ER. Glykosylering kan beskytte proteiner mod nedbrydning, tilbageholde proteiner i ER indtil de er korrekt foldede, indgå i dannelsen af den beskyttende glycocalyx og fungere i cellegenkendelse.

Proteiner kan danne disulfid-bindinger i ER. Disulfid-bindinger hjælper med at stabilisere proteiners struktur (især når proteiner udsættes for f.eks. nedbrydende enzymer eller ændringer i pH uden for cellen).

Question 15

Answer 15

Question 16

Hvis proteiner ikke foldes korrekt i ER, vil de blive nedbrudt.
5. Beskriv hvorledes sådanne proteiner bliver nedbrudt i cellen

Answer 16

Proteiner som er misfoldede vil blive eksporteret til cytosolen via translokatøren. I cytosolen bliver disse proteiner påsat en kort kæde af ubiquitin som senere genkendes af proteasomet, der står for nedbrydningen af ubiquitinylerede proteiner.

Question 17

Proteiner transporteres via vesikeltransport fra et kompartment til et andet i den sekretoriske pathway.
6. Beskriv hvorledes en vesikel kan optage et specifikt opløseligt protein (”cargo”), som skal transporteres til et andet kompartment.

Answer 17

Adaptiner bruges til at selektere specifikke proteiner, som skal transporteres fra et kompartment til et andet. Opløselige proteiner som f.eks. lysosomale enzymer bærer specifikke signaler (mannose-6-fosfat) som genkendes af cargo receptorer i TGN (mannose-6-fosfat receptorer). Adaptiner binder herefter til cargo receptorerne, som har bundet det specifikke protein, der skal transporteres til et andet kompartment. Da adaptin samtidigt kan binde til coat proteiner, som danner vesiklen, vil det specifikke protein derved blive placeret i lumen af den nydannede vesikel

Question 18

7. Beskriv hvorledes en vesikel kan genkende og fusionere med det korrekte kompartment.

Answer 18

Vesiklen bærer specifikke Rab proteiner i membranen, som genkendes af korresponderende tethering proteiner på target kompartment membranen. Denne binding mellem specifikke Rab proteiner på vesiklens overflade og tethering proteiner på target kompartment membranens overflade sikrer, at transportvesiklen kommer til det korrekte target kompartment. Yderligere genkendelse mellem transportvesiklen og det korrekte target kompartment sker via kontakt mellem specifikke v-SNAREs på vesikelmembranen og specifikke t-SNAREs på target kompartment membranen. Selve fusionen mellem vesiklen og target kompartment katalyseres også af v-SNAREs på vesiklen og t-SNAREs på target membranen, som vikler sig om hinanden og som et spil trækker vesikelmembranen og target kompartment membranen tættere og tættere på hinanden. Når de to membraner er 1.5 nm fra hinanden, vil deres lipider fusionere og vesikelmembranen er dermed fusioneret med og integreret i target kompartment membranen, og vesiklens luminale cargo vil blive afleveret til lumen af target kompartmentet

Question 19

Genekspression
Ekspressionen af Interleukin 2 genet reguleres (i eukaryote celler) af DNA sekvenselementet ARRE2, som genkendes af tre forskellige transskriptionsfaktorer, cFos, cJun og NFAT. Under studiet af reguleringen af Interleukin 2 genet udførtes et genekspressions- og et EMSA (”electrophoretic mobility shift assay”) eksperiment som vist i figur 1 og 2.

Figur 1 viser et cellekulturforsøg, hvor de anvendte celler udtrykker forskellige kombinationer af cFos, cJun og NFAT (1-4). Cellerne er yderligere transfekteret med en vektor indeholdende rapportørgenet β-Gal (som koder for enzymet β-galactosidase) og et sekvenselement, ARRE2, opstrøms for transskriptionsstart (angivet med pil). Efterfølgende er ekspressionen af β-galactosidase protein målt, som et udtryk for transskriptionsaktivitet. (Efter Petersen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996).

a. Redegør for resultatet af forsøget i figur 1 i relation til transskriptionsreguleringen af Interleukin 2 genet.
b. Angiv hvilket enzym som syntetiserer Interleukin 2 mRNA.
c. Redegør for hvorfor β-gal ofte anvendes i denne type forsøg i stedet for det oprindelige gen (her Interleukin 2).

Answer 19

1.

a. Ud fra figur 1 kan det observeres, at initiering af transskriptionen af β-gal genet kun kan foregå i nærvær af alle tre proteiner: NFAT, cFos og cJun, Det kan derfor konkluderes, at NFAT, cFos og cJun er genregulatoriske proteiner nødvendige for initiering af transskription af Interleukin 2 genet.
b. RNA polymerase II (idet der transskriberes mRNA).
c. β-galactosidase anvendes meget ofte som rapportørgen, idet enzymaktivitet let og kvantitativt kan måles (kolorimetrisk) i modsætningen til det oprindelige genprodukt.

Question 20

Figur 2 viser et EMSA eksperiment med DNA indeholdende ARRE2 sekvenselementet og proteinerne AP-1 (som er en heterodimer af cJun og cFos) og NFAT i forskellige koncentrationer. (Efter Petersen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996).
2.
a. Redegør kort for EMSA metoden.
b. Forklar resultatet af forsøget i figur 2.

Answer 20

2.

a. I et EMSA forsøg analyseres ændringer i migrationen af et DNA fragment (som kan detekteres vha. radioaktiv (32P) - eller fluorescens-mærkning) ved gel-elektroforese, som adskiller DNA efter størrelse. Migrationen af et DNA fragment reduceres, såfremt dette binder protein(er).
b. I dette forsøg vises at både AP-1 og NFAT transskriptionsfaktorerne binder til ARRE2. Bånd 1 er frit DNA indeholdende ARRE2; bånd 2 er NFAT bundet til DNA indeholdende ARRE2 og bånd 3 er NFAT og AP-1 bundet til DNA indeholdende ARRE2 (eller evt. kun AP-1, idet det ikke ud fra dette forsøg kan konkluderes om NFAT og AP-1 binder samtidigt til hver sit bindingssted, eller binder til samme bindingssted. Se dog opgave 1 som viser, at både NFAT og cfos og cjun (AP-1) er nødvendige for aktivitet, og opgave 4, som viser at NFAT og AP-1 binder samtidigt).

Question 21

Hvis man undersøger forskellige ARRE2 sekvenselementer, finder man, at den del af ARRE2 sekvenselementet, som genkendes af AP-1 transskriptionsfaktoren, varierer.
3.
a. Angiv 7 base konsensussekvensen for AP-1 binding ud fra følgende tre ARRE2 sekvenselementer:
5’-CCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACA-3’
5’-AGCTGTGTCTGACTCATGCT-3’
5’-AAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGG-3’

Answer 21

a. Ved alignment af de 3 sekvenser:
5’-CCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACA-3’
5’-AGCTGTGTCTGACTCATGCT-3’
5’-AAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGG-3’
fås 7 base konsensussekvensen: TGANTCA. Det vil ligeledes blive betragtet som fyldestgørende svar at angive TGACTCA.

b. Man kunne foretage et EMSA eksperiment (alternativt et ”footprint”), hvor man selektivt ændrede en eller flere baser i konsensussekvensen og observerede at bindingen aftog.

Question 22

Figur 3 viser strukturen (bestemt ved røntgen-krystallografi) af protein-DNA komplekset mellem NFAT (gul/grøn), AP-1 (rød/lilla) og sekvenselementet ARRE2.

4. Beskriv ud fra figur 3 de strukturelle forskelle mellem de to proteiner NFAT og AP-1,
   herunder hvorledes AP-1 binder til og genkender ARRE2 DNA elementet.

Answer 22

NFAT er primært opbygget af β-strands/sheets og loops, hvorimod AP-1 er en heterodimer bestående af to strukturelt identiske subunits (cFos og cJun), som hver for sig er en sammenhængende α-helix. cFos og cJun binder til hinanden (via en ”leucin-zipper”), og begge binder til DNA helixen via en α-helix, som genkender DNA sekvensen (i major groove via hydrogenbindinger mm.). ECB, 4. udgave, kapitel 4 og 8.

Question 23

Transskription af cFos igangsættes som et ”early gene respons” efter aktivering af MAPKinasen ERK1/2.

5. Redegør, gerne ved hjælp af en skitse, for hvorledes aktivering af en receptor tyrosin kinase kan lede til øget transskription af cFos.

Answer 23

5. Efter autofosforylering af receptor tyrosin kinasen kan et adaptorprotein bindes. Adaptorproteinet binder derefter en Ras-GEF, som faciliterer dissociation af GDP fra Ras, hvorefter Ras binder GTP. Det GTP-bundne RAS vil aktivere MAPKKK, som fosforylerer MAPKK, der fosforylerer MAPK. MAPK translokeres til cellekernen og fosforylerer transskriptionsfaktorer nødvendige for transskription af early response gener såsom cFos.

Question 24

a) Angiv de vigtigste mRNA processeringstrin og deres funktion.
b) Angiv hvor i cellen og hvornår (relativt til mRNA syntesen) processeringen finder sted.

Answer 24

a) Capping er afgørende for translationsinitiering, kerneeksport og beskyttelse mod nedbrydning. Splejsning fjerner introns (og giver mulighed for splicevarianter) og polyadenylering er afgørende for kerneeksport, mRNA levetidskontrol og er translationsinitieringssignal.
b) Capping: co-transskriptionelt i kernen.
Splejsning: co-transskriptionelt i kernen (evt. posttransskriptionelt).
Polyadenylering: posttransskriptionelt i kernen (co-transskriptionelt betragtes ligeledes som korrekt svar, idet processeringen er afhængig af RNA polymerase II).

Question 25

2. a. Redegør for hvorledes mitochondrielle proteiner ender i mitochondriets matrix. b. Beskriv hvorledes O2 indgår i energiproduktionen i mitochondriet (ATP syntese).

Answer 25

2. a) Langt hovedparten af mitochondrielle proteiner kodes af kernens DNA. mRNA translateres på frie ribosomer i cytosolen til et precursor protein,indeholdende en specifik peptid signalsekvens. Herefter føres precursorproteinet til mitochondriets ydermembran, hvor signal sekvensen genkendes af en import receptor, som er associeret til et translokator protein kompleks (TOM). Når dette kompleks kommer i kontakt med et translokatør protein kompleks i den indre membran (TIM) translokeres proteinet over de to membraner i ufoldet tilstand, ind i matrix, hvor en signalpeptidase kløver signalpeptidet fra precursorproteinet, og proteinet foldes vha. chaperoner. Et fåtal proteiner kodes af mitochondrielt DNA, og syntetiseres direkte i mitchondriets matrix via ribosomer og tRNAs, som også er kodet af mitochondriet selv. b) O2 spiller en essentiel rolle for energiproduktionen, idet det fungerer som elektron acceptor ved det sidste kompleks i elektrontransportkæden (cytochrom c oxidase kompleks/komplex IV) og reduceres og indgår i H2O produktion. Dette tillader en kontinuerlig trafik af elektroner gennem elektrontransportkæden. (Svaret bygger på, at der via citronsyrecyklus produceres energirige elektroner, der overføres fra mitochondriets matrix til proteinkomplekser i elektrontransportkæden via elektrontransportører (NADH og FADH2). Energien i elektronerne udnyttes i elektrontransportkæden i indermembranen til at translokere H+ fra matrix til det intermembranøse rum, således at der opbygges en elektrokemisk gradient. Energien i denne gradient udnyttes til at producere ATP via ATP-syntase proteinkomplekser, når H+ transporteres tilbage til matrix.)

Question 26

3. Redegør for hvorvidt nedenstående udsagn er sande eller falske. a. Alle epithelceller har altid kontakt til basallamina. b. Udformningen af cilier og mikrovilli har samme strukturelle grundlag. c. Et kollagenmolekyle er opbygget af to peptidkæder der danner en dobbelthelix. d. Brusk vokser udelukkende appositionelt. e. Den modne erythrocyt har et ensartet acidofilt/eosinofilt cytoplasma, hvorimod dens tidlige forstadie har et udtalt basofilt cytoplasma.

Answer 26

3. a) Alle epithelceller har altid kontakt til basallamina. Svar: Falsk. I flerlagede epitheler har cellerne i de øvre lag ikke kontakt til basallamina (desuden findes ependym, som ikke står på en basallamina). b) Udformningen af cilier og mikrovilli har samme strukturelle grundlag. Svar: Falsk. Cilier og mikrovilli understøttes strukturelt af forskellige dele af cytoskelettet, hhv. mikrotubuli og aktin, hvilket afspejler deres forskellige funktioner. c) Et kollagenmolekyle er opbygget af to peptidkæder snoet om hinanden i en dobbelthelix. Falsk. Et kollagenmolekyler er opbygget af tre peptidkæder, som snor sig i en trippelhelix. d) Brusk vokser udelukkende appositionelt. Falsk. Brusk kan vokse både appositionelt (udefra) og interstitielt (indefra).(Interstitiel vækst ses fortrinsvist i ung brusk). e) Hvor den modne erythrocyt har et ensartet acidofilt/eosinofilt cytoplasma vil dens tidlige forstadie have et udtalt basofilt cytoplasma. Sandt. Tidlige erythrocytforstadier er meget aktive mht. syntese af hæmoglobin, og indeholder derfor store mængder ribosomer, der gør cytoplasma basofilt. I den modne erythrocyt findes ikke længere ribosomer, men den indeholder store mængder hæmoglobin, der gør cytoplasma acidofilt/eosinofilt

Question 27

Aktionspotentialets amplitude I en forsøgsopstilling befinder der sig et stykke perifer nerve fra en frø. Nerven er omgivet af væske svarende til normal ekstracellulærvæske. To ekstracellulære stimuluselektroder er placeret i den ene ende af nerven, og to ekstracellulære registreringselektroder er placeret med nogen indbyrdes afstand i den anden ende af nerven. Nerven stimuleres, og der registreres et aktionspotential. 1. Tegn med angivelse af rimelige værdier for tid (x-akse) og amplitude (y-akse) det ekstracellulært afledede aktionspotential. 2. Tegn en graf, der viser sammenhængen mellem stimulusstyrke (x-akse) og amplitude (y-akse) af aktionspotentialet med angivelse af rimelige værdier på akserne. 3. Redegør kort for grafens form. 4. Redegør for hvilken effekt et fald i den ekstracellulære natriumkoncentration vil have på aktionspotentialets amplitude.

Answer 27

Aktionspotentialets amplitude 1. Kurven skal være difasisk, varighed 1,5 - 3 ms, amplitude mellem ±0,01 og ±10 mV. 2. Kurven skal være s-formet og vokse fra 0 mV op mod et maksimum på ikke over 10 mV (eller evt. -10 mV) med stimulusstyrker mellem 0 og 10 volt. 3. Den perifere nerve er sammensat af fibre med forskellig tærskel. Når stimulus øges, aktiveres først de tykkeste fibre og derefter de tyndere. Derfor vokser amplituden med stimulusstyrken. 4. Aktionspotentialets amplitude bliver mindre, da ligevægtpotentialet for natrium bliver mindre positivt.

Question 28

Synaptisk Transmission Nervecelle A innerverer nervecelle B. En nerveimpuls i A efterfølges af et hurtigt IPSP i B. Dette IPSP når maximum efter 10 ms og varer 50 ms. 1. Angiv to sandsynlige transmittere for A. 2. Angiv ionmekanismen og det omtrentlige vendepotential for det hurtige IPSP i B. 12 A stimuleres således, at der udløses 10 aktionspotentialer i løbet af 40 ms. Stimulationen efterfølges af et forøget hurtigt IPSP, der varer 50 ms og et langsomt IPSP, der når maximum efter 500 ms og varer 5 s. 3. Angiv receptorerne for det hurtige og det langsomme IPSP. 4. Angiv ionmekanismen og et omtrentligt vendepotential for det langsomme IPSP i B.

Answer 28

Synaptisk Transmission 1. Glycin og GABA. 2. Cl- bærer den hyperpolariserende strøm og vendepotentialet er derfor ECl- = -75mV. 3. Transmitteren er GABA. Det hurtige IPSP skyldes aktivering af ionotrope GABAA receptorer, mens det langsomme IPSP skyldes aktivering af metabotrope (GPCR) GABAB receptorer. 4. K+ bærer den hyperpolariserende støm for det langsomme IPSP og vendepotentialet er derfor EK+ = -90mV.

Question 29

Sensorisk signalering En forsker undersøger en ukendt sansereceptor ved at måle frekvensen af aktionspotentialer i axonet. Han stimulerer sansereceptoren med en konstant stimulus, og får resultatet nedenfor (forsøg 1), hvor frekvensen af aktionspotentialer er angivet som funktion af tiden: Forskeren fjerner nu Ca2+ fra ekstracellulærvæsken, og gentager forsøget (forsøg 2). Han opdager, at receptoren ikke længere adapterer. 1. Angiv hvordan stimulusamplituden kodes i receptorens modtagerdel og aftagerdel. 2. Redegør kort for funktionen af KA-kanaler i kodningen af stimulusintensiteten. 13 3. Redegør for en mekanisme, der kan være ansvarlig for den adaptation, der ses i forsøg 1. 4. Redegør for, hvorfor sansereceptoren ophører med at fyre aktionspotentialer efter at stimulus fjernes i forsøg 1, og angiv herunder, hvorvidt det kan forventes at denne pause optræder i forsøget uden Ca2+ i ekstracellulærvæsken (forsøg 2).

Answer 29

Sensorisk signalering. 1. Stimulusamplituden kodes i receptorens modtagerdel i generatorpotentialets amplitude og i afsenderdelen i frekvensen af aktionspotentialer. 2. KA-kanalerne nedsætter fyringsfrekvensen og gør frekvensen afhængig af generatorpotentials amplitude og dermed af stimulusstyrken. KA-kanalerne er derfor vigtige for kodning af stimulusstyrken i receptorens afsenderdel. 24 3. Da adaptation er fraværende, når Ca2+ fjernes ekstracellulært, er det formentlig Ca2+-influx i receptorens afsenderdel, der er involveret. Spændingsafhængige Ca2+-kanaler åbner under aktionspotentialet, hvilket medfører Ca2+-influx og stadig kraftigere aktivering af KC-kanaler hen igennem impulstoget, hvilket medfører en længere hyperpolariseringsfase mellem aktionspotentialerne, og derfor nedsætter frekvensen. 4. Når stimulus og dermed generatorpotentialet fjernes, hyperpolariseres receptoren pga. den akkumulerede Ca2+, som aktiverer Kc-kanalerne. Først når Ca2+ er pumpet ud, kan receptoren genoptage fyringen af aktionspotentialer. Da pausen afhænger af Ca2+-influx, forventer man ikke at se nogen pause i forsøget uden ekstracellulær Ca2+. (Hvis studenten ikke har identificeret mekanismen korrekt i spørgsmål 3, så kan et svar, hvor der henvises til den nedsatte følsomhed af receptoren pga adaptationen stadig anses for delvist korrekt).

Question 30

Muskelkontraktion Kontraktionen i alle muskulaturer drives af tværbroer. 1. Nævn det protein der udgør tværbroen. 2. Redegør for tværbroens cyklus. Glat muskulatur har cirka samme kraftudvikling per tværsnitsareal som tværstribet muskulatur, men indeholder meget færre tværbroer. 3. Redegør for den egenskab, som gør tværbroen i glat muskulatur mere effektiv. 4. Redegør for hvordan denne egenskab kan forstærkes.

Answer 30

Muskelkontraktion: 1. Myosin hovedet. 2. Myosin hovedet er som udgangspunkt ladet med mekanisk energi og har ADP og Pi bundet. Binding af myosin til aktin frigiver Pi, hvilket øger bindingen mellem aktin og myosin, og udløser powerstroke, der trækker aktin mod midten af sarkomeret. Herefter frigives ADP. Efterfølgende binding af ATP svækker bindingen af myosin til aktin, hvorved bindingen brydes. ATP hydrolyse lader myosinhovedet med mekanisk energi og ADP og Pi forbliver bundet. 3. Tværbroer bidrager kun til kraftudviklingen mens de er bundet til aktin. Den fraktionelle tid myosin er bundet, også kaldet duty cycle, er højere for myosin i glat muskulatur sammenlignet med tværstribede muskulaturer. Derfor vil en større fraktion bidrage til kraften under aktivering og kompensere for det lavere absolutte antal tværbroer. 4. Hvis den lette regulatoriske kæde defosforyleres mens myosin er bundet til aktin, vil tiden bundet til aktin forlænges (latch state). Herved stiger duty cycle, fraktionen af bundne tværbroer, hvilket øger den relative kraftudvikling.