Regulation de l'expression des genes Flashcards
(32 cards)
etat condensation chromatine
- > Hétérochromatine : l’ADN est très compacté = conformation « fermée » => très faible niveau de transcription (répression)
- > Euchromatine : l’ADN est très peu compacté = conformation « ouverte » => permet l’activation de la transcription du gène qui devient accessible à la fixation des facteurs de transcription (éventuellement les facteurs activateurs et le complexe d’initiation de la transcription), et cette fixation protège du clivage de l’ADN par la DNase
Modifications post- traductionnelles des histones
post-traductionnelles réversibles, avec des spécificités d’histones et de sites d’actions sur ces histones (« Code Histones ») :
• Acétylation des Lysines
• Méthylation des Arginines et Lysines
• Phosphorylation des Serines
• Ubiquitination, sumoylation
Les modifications post-traductionnelles peuvent interagir et se réguler entre elles
Acétylation des Lysines
par les Histone Acétylases (HAT) fait perdre à la lysine sa charge positive, réduisant la force de l’interaction entre histone et ADN (chargé -). Cette décompaction favorise l’accès à d’autre protéines (ex : complexes de remodelage de la chromatine et facteurs de transcription) et donc l’expression des gènes. (Modification réversible : la désacétylation par les Histone Désacétylases (HDAC) induit l’effet inverse = une répression de l’expression des gènes)
Méthylation des Arginines et Lysines
sites de recrutement de protéines activatrices ou inhibitrices de la transcription.
Méthylation de l’ADN
Les résidus de cytosine des dinucléotides CpG peuvent être méthylés en 5-méthylcytosine
la méthylation de la cytosine d’un gène peut inactiver ce dernier dans le cadre d’un mécanisme plus général relevant de l’épigénétique
70 % à 80 % des résidus de cytosine des dinucléotides CpG sont méthylés
les dinucléotides CpG définissent des îlots CpG dans lesquels leur concentration est bien plus élevée et qui jouent un rôle dans la régulation de l’expression génétique.
méthylation et empreinte
Méthylation et empreinte :
- > Le niveau d’expression d’un gène dépend de son origine parentale
- > On connaît aujourd’hui près de 300 gènes soumis à l’empreinte (souvent dans une même région)
- > Les problèmes de méthylation sont associés à de nombreuses maladies génétiques et processus cancéreux.
Facteurs de transcription generalité transcription conditionné par quoi facteur trans (souvent quoi) = region cis (souvent quoi) = situé ou
transcription est conditionnée par la fixation d’un certain nombre de protéines appelées facteurs trans qui régulent la transcription en reconnaissant des séquences spécifiques de l’ADN (éléments cis), en amont des gènes dans le promoteur, et qui peuvent être très éloignées des gènes dont ils régulent l’expression. Ces séquences cis sont consensus, souvent palindromiques car les facteurs de transcription sont souvent dimériques.
Facteurs trans contrôlant l’initiation de la transcription
facteurs de transcription ubiquitaires reconnaissant des séquences d’ADN spécifiques « core promoter » localisées en amont du site de démarrage de la transcription, appelés « basal factors » ou facteurs de base : TATA box binding protein (TBP) et TBP associated factors (TAF).
Les facteurs de base permettent au complexe d’initiation de la transcription, dont l’ARN polymerase II, de se fixer au bon endroit, dans le promoteur. Par leur faible fixation, ils permettent une régulation du taux basal d’expression des gènes.
Facteurs de transcription régulateurs activateurs et répresseurs
se fixent sur le promoteur proximal (-50 à -500) sur les CAAT box ou les GC box.
Les facteurs de transcription activateurs ou répresseurs sont à l’origine de la spécificité tissulaire ou cellulaire de l’expression d’un gène, et reconnaissent des éléments cis « enhancers » (->activation de la transcription) ou « silencers » (blocage de la transcription) en amont ou en aval du site d’initiation de la transcription, et agissent seuls ou en association avec des co-activateurs ou co-répresseurs qui ne lient pas directement l’ADN.
Facteurs de transcription activateurs
sous forme quoi suite a quoi
Plusieurs domaines
sequence cible reconnue par quoi et peuvent etre comment
plupart sont actifs sous forme de dimères, suite à des modifications post-traductionnelles du domaine de dimérisation comme la phosphorylation.
possèdent un domaine de liaison à l’ADN et un domaine de transactivation permettant l’activation de la transcription, un domaine de dimérisation.
séquences cibles d’ADN reconnues par les monomères des FT peuvent être courtes et opposées, ou répétées, ou palindromiques
Facteurs de transcription répresseurs
diminuent l’activité transcriptionnelle par deux modes d’action :
- > compétition vis à vis de l’activateur sur le site de liaison à l’ADN, ce qui empêche sa fixation
- > « quenching » : liaison au facteur activateur de la transcription soit au niveau de son domaine de liaison à l’ADN, soit au niveau du domaine de transactivation du facteur activateur
Domaine d’interaction du facteur de transcription
fixation ADN par quel domaine
et comment est ce domaine
facteur de transcription aura par définition un domaine basique d’interaction avec l’ADN (acide désoxyribonucléique).
Le domaine de liaison à l’ADN du facteur de transcription comporte des motifs particuliers : la taille d’un grand sillon d’ADN correspond au diamètre d’une hélice alpha => élément constitutif privilégié de ces motifs.
4 types FT
- > Hélice/coude = tour/hélice
- > Doigt de zinc
- > Dimère en Hélice/boucle/hélice (bHLH)
- > Dimère en Leucine zipper (hélice alpha) (bZiP)
Northern Blot inconvenient
avantage
Peu sensible (nécessite beaucoup de matériel donc adapté uniquement aux gènes connaissant une forte expression).
SEULE méthode permettant de déterminer la taille d’un transcrit. Permet la détection des épissages alternatifs.
RT PCR standard
avantage
inconv
Rapide
Ultrasensible
Quantitative = en temps réel : permet de déterminer le nombre de copies
Difficile de déterminer la taille d’un transcrit
Difficile de mettre en évidence un épissage alternatif (possible mais très long)
RNA Sequencing
def
Protocole
: analyse globale des transcrits
1) Extraction de l’ADN
2) Conversion de l’ADN en ARN complémentaire
3) Fragmentation
4) Séquençage des différents fragments
RNA Sequencing
resultat
- Info qualitative : si le séquençage a lieu, le gène s’exprime
- Info quantitative : le nombre de séquences obtenu est proportionnel au nombre de copies initial = niveau d’expression
Cette méthode a l’avantage d’être très sensible, et de pouvoir se réaliser sur tous les gènes d’un tissu en même temps. Toutefois, elle reste longue.
Mise en évidence des sites d’hypersensibilité à la DNASE I
principe
DNase I est une enzyme clivant de manière aléatoire l’ADN + facilement si si l’ADN est accessible, c’est à dire sous forme d’euchromatine.
test d’hypersensibilité à la DNase I se base sur la propriété de clivage de la DNase I. Si on incube, durant des périodes croissantes, une séquence d’ADN, prédigérée par des enzymes de restriction, avec une très faible quantité de DNase I, celle-ci va cliver l’ADN à des endroits spécifiques appelés site d’hypersensibilité à la DNase I.
Mise en évidence des sites d’hypersensibilité à la DNASE I
Résultat
hypersensibilité à la DNase I permet de mettre en évidence :
- Si la DNase I arrive à cliver, l’ADN est ouvert sous forme d’euchromatine et donc on peut supposer que la région contient
des séquences fixant des régulateurs de la transcription.
- Si la DNase I n’arrive pas à cliver, l’ADN est fermé sous forme d’hétérochromatine et donc on peut supposer que la région ne contient pas de séquences fixant des régulateurs de la transcription.
FOOTPRINTING
but
Étude des interactions ADN/protéines avec localisation du site de fixation de la protéine sur la séquence d’ADN étudiée (élément cis). Cette méthode est utilisée pour localiser le(s) site(s) de fixation d’un facteur de transcription sur un promoteur.
FOOTPRINTING
principe
L’ADNg est marqué à l’aide d’un isotope radioactif.
On utilise de la DNAse I sur de l’ADN nu et de l’ADN avec des facteurs protéiques dont on soupçonne qu’ils peuvent se lier à l’ADN. La DNAse I va couper les brins d’ADN de manière non spécifique.
Les sites où une protéine est fixée vont être protégés et être inaccessibles pour la DNAse I
FOOTPRINTING
protocole
On marque une séquence d’intérêt à une extrémité (5’ par exemple) et on réalise notre footprinting:
-> Dans un premier tube, on incube notre séquence marquée directement avec la DNAse I, elle coupe de manière non spécifique,
et statistiquement une fois par fragment.
-> Dans un second tube, notre séquence est préalablement incubée avec des extraits nucléaires contenant des protéines. Ensuite
seulement on incube ce mélange avec la DNAse I
FOOTPRINTING
resultat
Une partie de la séquence n’a pas été clivée par rapport à l’électrophorèse de l’ADN nu. C’est ce morceau-là de la séquence qui est protégé de la DNAse I par une protéine, et le lieu de la fixation de cette protéine peut être déterminé par lecture sur l’électrophorèse
GENES RAPPORTEURS
but
Étude du rôle et des régions fixant les facteurs de transcription du promoteur sur la régulation de l’expression d’un gène.
Utiliser pour visualiser ou mesurer l’expression d’un gène d’intérêt
