RNA-Interferenz in Eukaryoten

Question 1

Was versteht man allgemein unter RNA-Interferenz (RNAi) oder Post-transkriptionalem gene silencing (PTGS) ?

Answer 1

-> Kleine dsRNAs assoziieren mit Proteinkomplexen

-> Spaltung der Target-mRNA durch siRNAs

-> Oder Inhibition der Translation durch miRNAs

-> In beiden Fällen wird die Genexpression durch den RNA-Protein-Komplex unterdrückt

Question 2

Was versteht man allgemein unter transkriptionalem gene silencing (TGS) ?

Answer 2

Inhibition der Transkription durch epigenetische Modifikationen des Chromatins

Question 3

Welche Eigenschaften der RNAi wurden in C. elegans entdeckt ?

Answer 3

Alle Experimente wurden an transgenen GFP-Würmern durchgeführt.

1. Systemische RNAi:
   -> Injektion von GFP-dsRNA in wenigen Zellen
   -> Silencing-Effekt der Fluoreszenz dehnt sich von diesen Zellen auf den gesamten Organismus aus
2. Vererbbarer RNAi-Phänotyp:
   -> Silencer-Phänotyp wird an die Nachkommen weiter gegeben

Question 4

Welche Schlussfolgerungen konnten aus den RNAi-Experimenten an C. elegans gezogen werden ?

Answer 4

-> Effizientes gene silencing kann nur durch dsRNA erreicht werden

-> RNAi führt zur Degradation der mRNA

-> dsRNA muss gegen reife mRNA gerichtet sein, nicht gegen Promotor-Regionen oder Introns

-> Schon wenige dsRNA-Moleküle reichen für ein vollständiges gene silencing

-> Der Silencing-Effekt kann sich im Gewebe ausbreiten und vererbt werden

Question 5

In welchen Organismen kommt RNAi vor ?

Answer 5

In nahezu allen Eukaryoten, unter anderem in
-> Pilzen
-> Pflanzen
-> Tieren

Question 6

Welche Auswirkungen hat RNAi in Säugerzellen ?

Answer 6

-> lange dsRNA lösen unspezifische Immunantworten aus

-> kurze dsRNAs werden toleriert, führen aber zur Suppression

Question 7

Was versteht man im Kontext der RNAi unter Dicer-Prozessierung ?

Answer 7

-> Der Dicer ist eine multidomäne Endoribonuklease

-> Dicer spaltet lange dsRNA in kurze (20-25nt) siRNA (small interfering RNA)

Question 8

Wie wird der RISC (RNA-induced silencing complex) gebildet ?

Answer 8

-> siRNA wird vom Dicer an das Argonauten-Protein (AGO) übergeben

-> RISC besteht aus AGO und guide-RNA

Question 9

Um was für ein Enzym handelt es sich beim Dicer ?

Answer 9

-> Multidomänenprotein

-> Endoribonuklease der RNase III - Familie

Question 10

Welche Bedeutung hat der Passenger- oder Sense-Strang im Kontext der RNA-Interferenz ?

Answer 10

-> Strang ist identisch zur Target-mRNA

-> Strang wird durch AGO gespalten

-> Strang wird nach der Spaltung aus dem RISC entfernt und durch Ribonukleasen degradiert

Question 11

Welche Bedeutung hat der Guide - oder Antisense - Strang im Kontext der RNA-Interferenz ?

Answer 11

-> Strang ist komplementär zur Target-mRNA

-> Strang definiert im Passenger-Strang und in der Target-mRNA die Spaltstelle

Question 12

Welche strukturellen Eigenschaften haben die Enden von siRNAs ?

Answer 12

-> Monophosphatgruppe an beiden 5´-Enden

-> Hydroxylgruppe an beiden 3´-Enden

-> Zwei Nukleotide Überhang an beiden 3´-Enden

Question 13

Wie viele Argonauten-Proteine und Dicer sind in C. elegans zu finden ?

Answer 13

-> 27 Argonauten-Proteine

-> 1 Dicer

Question 14

Wie viele Argonauten-Proteine und Dicer sind in A. thaliana zu finden ?

Answer 14

-> 10 Argonauten-Proteine

-> 4 Dicer

Question 15

Wie viele Argonauten-Proteine und Dicer sind in Menschen zu finden ?

Answer 15

-> 4 Argonauten-Proteine

-> 1 Dicer

Question 16

Nenne zwei natürliche Funktionen von RNAi.

Answer 16

1. RNAi schützt Pflanzen, Würmer und Insekten vor Pathogenen wie Viren, Bakterien und Pilzen
2. RNAi erhält die Stabilität des Genoms durch silencing mobiler Elemente aufrecht

Question 17

Nenne drei Anwendungsmöglichkeiten von RNAi.

Answer 17

1. Experimentelles Tool zur gezielten Untersuchung spezifischer Gene
2. RNAi als Therapieansatz
3. RNAi zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen

Question 18

Um Kartoffelpflanzen durch RNAi vor Kartoffelkäfern zu schützen, wurde das entsprechende Transgen einmal ins nukleäre Genom und einmal ins Chloroplasten-Genom eingebaut. Welche Vorgehensweise war effektiver ? Begründe deine Antwort.

Answer 18

1. Insertion ins nukleäre Genom:
   -> Im Cytoplasma der Pflanzen wurden durch Dicer kleine siRNAs gebildet
   -> siRNAs wurden durch Darmzellen der Käfer nur ineffizient aufgenommen
2. Insertion ins Chloroplasten-Genom:
   -> In Chloroplasen gibt es keine Dicer
   -> Pflanzenzellen produzieren lange dsRNAs
   -> dsRNA wurde effizient durch Darmzellen der Käfer aufgenommen

=> Einbau in das Chloroplasten-Genom war effektiver

Question 19

Durch welches Protein wird die antivirale RNAi vermittelt ?

Answer 19

RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP)

Question 20

In welchen Organismen kommen RNA-abhängige RNA-Polymerasen vor ?

Answer 20

-> Pflanzen
-> Pilze
-> C. elegans

Question 21

Beschreibe kurz den Mechanismus antiviraler RNAi.

Answer 21

-> Virale ssRNA wird von RNA-abhängiger RNA-Polymerase zu viraler dsRNA erweitert

-> Virale dsRNA wird durch Dicer zu siRNAs

-> RISC sorgt für die Degradation weiterer viraler ssRNA

Question 22

Nenne die drei RNAi-Mechanismen, über die Pflanzen verfügen.

Answer 22

1. Gene silencing durch exogene RNA-Trigger
   -> Virusabwehr
2. Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs
   -> Inhibition der Translation oder RNA-Degradation
3. Transkriptionales gene silencing (TGS)
   -> DNA-Methylierungen und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung

Question 23

Was ist der DAF-2/DAF-16 Signalweg in C. elegans ?

Answer 23

-> Reguliert die Bildung einer Dauerform

-> Entspricht dem IGF-1/Insulin Signalweg in Säugern

Question 24

Was sind DAF-2 und DAF-16 ?

Answer 24

-> DAF-2 ist ein Tyrosin-Kinase-Rezeptor

-> DAF-16 ist ein Transkriptionsfaktor

Question 25

Was versteht man im CRISPR-Cas-System unter guide RNA ?

Answer 25

-> dsRNA-Strang

-> Ein Strang crRNA

-> Ein Strang tracrRNA