Semaine 8 Flashcards
(30 cards)
Expliquez ce qu’est PCR (polymerase chain reaction)
La PCr permet de choisir un segment d’ADN particulier dans un génome et d’amplifier cette séquence cible de manière exponentielle afin d’en obtenir des millions de copies
Quel type de technique d’amplification est la PCR et mise au point par qui?
technique d’amplification ‘‘in vitro’’
mise au point par K. Mullis en 1985 (nobel prize in 1993)
Mr K. Mullis avait besoin d’un facteur clé lors de sa mise au point du PCR, expliquez
facteur clé de son succès est l’utilisation de l’ADN polymerase Taq.
NB : cette enzyme est resistante à la chaleur
Quel est l’attribut principal de l’ADN polymerase Taq?
enzyme résistante à la chaleur
La polymérase Taq permet de générer…….
des fragments d’ADN ne dépassant pas généralement 4kb
Que permet la complémentarité des bases? (propriétés importantes de l’ADN)
dénaturation/renaturation
hybridation/appariement
élongation de l’amorce (‘‘primer’’) par une ADN polymérase (5’ à 3’)
D’ouè provient l’ADN polymérase Taq?
isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus
Caractéristiques en lien avec la température de l’ADN polymérase Taq
T optimale = 72*C
résiste jusqu’à 95*C soit proche du point d’ébulition
Expliquez brièvement les étapes de PCR
À chque cycle, il y a augmentation de température afin de se rapprocher du 95*C, par contre après chaque cycle, l’activité enzymatique diminue donc après de nombreux cycles, l’activité est presque nulle/faible
Cycle 1-2 : les fragments sont amplifiés et ont des longueurs indéfinies
Cycle 3 : les longueurs des fragments sont définies
V ou F
Le nombre de copies de la séquence cible triple après chaque cycle
F
elle double, ne triple pas
V ou F
La séquence cible augmente de manière exponentielle
V
Comment prédire le nombre total de copies de la séquence cible (Y)
Y = x 2n
y = nombre final de copies
x = nombre initial de copies
n = en exposant nombre de cycles
À quelle température se passe l’élongation, la dénaturation et l’hybridation
élongation = environ 72*C
permet ls synthèse d’un brin complémentaire par la Taq polymérase
Hybridation = environ 40-65*C
Fixation d’un couple d’amorce
Dénaturation = environ 95*C
Séparation des 2 brins d’ADN
Quel outil est utilisé afin de produire les changements de température à chaque cycle
Thermocycleur
Expliquez les paramètres pour la dénaturation
95*C pendant 30 à 60s
expliquez les paramètres pour l,hybridation des ammorces
30 à 60s
40-65*C (variation en fonction de la longueur)
Température d’appariement : Tm - 5*C
Tm = température à laquelle 50% des molécules d,amorce sont associées à la matrice
La Tm d’une amorce dépend de sa longueur et de son % G+C
Comment calculer la valeur aproximative de la Tm d’une amorce?
Tm = (4 * X) + (2 * Y)
Tm en *C
X = nombre de G et C
Y = nombre de A et T
4 car 4*C pour chaque guanine et cytosine
2 car 2*C pour chaque adénine et thymine
Expliquez les paramètres pour l’élongation
72*C pendant 30 à 60S (en fonction de la longueur de séquence qu’on veut amplifier)
La durée dépend de la longueur de la séquence cible soit 1kb/min
Nombre total de cycles (PLUS PETIT OU ÉGAL À 30)
Au niveau de l’élongation, que ce passe t il au delà de 20 à 25 cycles
enzyme est de moins en moins efficace (passages successifs à 95*C) et la réaction atteint un PLATEAU
Au niveau de l’élongation, que ce passe t il au dernier cycle
Une étape d’élongation additionnelle est effectuée pour s’assurer que la synthèse de tous les brins est complète
V ou F
Les amorces déterminent la spécificité de la PCR
V
V ou F
L’amplification spécifique de la séquence comprise entre les extrémités 5’ des 2 amorces
V
La longueur des amorces est un facteur critique, pourquoi?
L’amorce doit etre spécifique pour éviter qu’il y aille présence de trop de site d’amorcage
la longueur de 15 à 35 nucléotides
Plus l’amorce est longue plus l’hybridation est spécifique
pour le génome humain,il faut utiliser des amorces d’AU MOINS 17 BASES
Comment calculer le nombre de séquences possibles pour un oligonucléotide?
4 à la n
n = combien de nucléotide de long (base)
