Sistemas de Vetores Virais Flashcards
(52 cards)
Que tipo de vírus são usados em Terapia Génica?
Nota: não se refere às familias de vírus utilizadas.
- Vírus Recombinante, nun ca wild-type.
Ao utilizar vetores virais na Terapia, o que pretendemos manter e retirar?
- Tenta-se remover todos os elementos que causam patogenicidade ao ser humano;
- Temos de manter as características de infecciosidade, capacidade de infetar um grande número de células rapidamente
(características inatas de infeção); - Permitir que a expressão do nosso gene terapêutico seja direcionada.
Quais são as características ideais de um vetor viral?
- Perfil seguro
- Produção fácil
- Boa estabilidade nas células alvo
- Capacidade transgénica alta
Como é que se pode tornar os vetores virais mais seguros, sem comprometer a sua eficácia?
- Evitar a sua replicação
- Promover a sua inativação
- Atenuar a sua toxicidade natural
Que critérios são utilizados para classificar vírus?
i. Tipo de material genético (DNA/RNA)
ii. Simetria da cápsideo
iii. Presença de envelope
iv. O seu tamanho (capacidade de carga)
v. Sítio onde ocorre replicação (núcleo ou citoplasma).
Caracterize os lentivírus de acordo com os critérios de classificação de vírus que conhece.
➜ Material genético: RNA (retrovírus);
➜ Proteínas específicas (transcriptase reversa, integrase e protease);
➜ Ligando: glicoproteína gp120;
➜ Capsídeo Proteico;
➜ Replicação: capaz de se replicar em células não mitóticas ( ou indiferenciadas);
Quais as proteínas que fazem o capsídeo, o nucleosídeo e a matriz dos lentivírus ou do HIV-1?
➜ Capsídeo: p24;
➜ Nucleosídeo: p7;
➜ Matriz: p17.
Nos lentivírus, ou HIV-1, existem 2 moléculas de RNA. Porque é que têm 2 moléculas de RNA de cadeia simples iguais?
➜ Apenas 1 é utilizada!
➜ A ideia é que a outra é importante
em termos de estrutura funcionaL e de regulação para o processo de transcrição.
Qual a constituição/estrutura genómica de um lentivírus (HIV-1)?
➜ LTR (zonas reguladoras)de cada lado, que funcionam como promotores da transcrição e replicação;
➜ LTR apresentam 3 segmentos: : U3, R e U5;
➜ 3 sequências codificadoras principais:
✳ Gag (para estrutura);
✳ Pol (para replicação);
✳Env (glicoproteínas de reconhecimento para o envelope).
➜ Elementos reguladores essenciais:
✳ Regulatórios – tat e rev;
✳ Acessórios – nef, vif, vpr e vpu.
Os lentivírus são usados em TG por terem a capacidade de integrar o nosso transgene no genoma do hospedeiro. Porque é que os lentivírus são mais seguros para esse efeito do que os Retrovírus - Gama?
➜ Os lentivírus integram em regiões intrónicas ou intergénicas (próximos de intrões).
➜ Os retrovírus gamma integram sobretudo em regiões próximas do promotor ou zonas reguladoras.
➜ Em termos de integração, os lentivírus são mais seguros.
Descreva o ciclo replicativo do HIV-1 (um lentivírus).
- Liga-se à célula alvo através de recetores (CD4).
- O envelope funde-se com a membrana.
- Dentro do citoplasma liberta o que tem dentro (RT, IN e PR)– uncoating
a. Dá-se a transcrição reversa (RNA → DNA)
b. Forma um complexo, complexo pré-integração (PIC) - PIC é levado para o núcleo e entra através do poro nuclear
a. Ocorre a integração através da proteína integrase
b. Começa a transcrição em mRNA viral que vão para o citoplasma e dá-se a produção de proteínas virais. - A maturação final do vírus dá-se fora da célula através de modificações pós-transdução de algumas proteínas.
O que é que envolve a 3ª geração da produção de vetores lentivirais?
➜ Aumentou-se o grau de segurança:
o Percebeu-se que seria ideal retirar um dos elementos regulatórios para um 4º plasmídeo.
o Criação de vetores SIN
Em que consiste o pseudotyping ou pseudotipagem?
➜ Envolve alterar o targetting celular;
➜ Alterações das glicoproteínas do
envelope para determinar o seu tropismo.
Em que consiste o uso de Adaptadores na modificação dos vetores lentivirais?
➜ Envolve a combinação com polímeros/ lipossomas.
➜ O objetivo é prevenir interações e possível resposta do sistema imunitário.
Em que consistem as modificações dos sistemas genéticos dos vetores lentivirais?
➜ Envolve alterar o genoma lentiviral para que ele produza outra proteína.
Os Vetores SIN (ou Auto-inativação) foram uma das maneiras de reduzir o risco de recombinação e aumentar a segurança da terapia. Em que consiste?
➜ As zonas LTR3’ e LTR5’são zonas reguladoras importantes;
➜ É colocada uma mutação/ deleção na zona U3 (serve de molde) e não há replicação.
➜ Ao infetar uma célula com um número determinado de vírus, não há formação de mais e mantém-se a expressão do transgene.
Em que consistem os vetores não integrativos?
➜ O transgene não é integrado no genoma do hospedeiro;
➜ Devido a: Mutações pontuais em cada uma das zonas reguladoras e a Mutação na própria integrase.
Caracterize os Retrovírus Gama de acordo com os critérios usados na classificação de vírus.
➜ Infetam apenas células em divisão (mitóticas);
➜ Tendência em integrar zonas exónicas (exões) ou nos promotores, levando à mutagénese dessas células.
➜ Altamente infeciosos.
➜ Capacidade de carga: 8-9 kb.
Nota: Usados no ensaio ADA-SCID (meninos que desenvolveram leucemia).
Quais são algumas vantagens do uso de Retrovírus Gamma?
➜ Simplicidade genética;
➜ Tropismo vasto;
➜ Baixa imunogenicidade;
➜ Baixa imunidade;
➜ Produção Fácil;
➜ Expressão duradoura;
➜ Integração no genoma.
Quais são algumas desvantagens do uso de Retrovírus Gamma?
➜ Transdução de células mitóticas;
➜ Baixa especificidade celular;
➜ Alto risco de mutagénese;
➜ Baixa estabilidade.
Caracterize os Adenovírus de acordo com os critérios de classificação de vírus.
➜ Simetria icosaédrica (cápsideo
composto por 240 proteínas – hexons);
➜ Não têm envelope;
➜ Material genético: DNA de cadeia dupla
linear;
➜ Fibras e Domínios Knob: importantes em termos de adesão e entrada nas células.
➜ Base do pentão – proteína que está na base das fibras;
➜ Tamanho: 35 kb.
Qual a constituição/estrutura genómica de um Adenovírus?
➜ Flanqueado por 2 zonas ITRs (inverted terminal repeats) (zona reguladoras da transcrição e integração);
➜ 2 grandes unidades de transcrição:
❋Early transcription units (E1, E2, E3 e E4) - produção de proteínas reguladoras;
❋ Late transcription units (MLTU) – produção das proteínas estruturais.
Descreva o ciclo replicativo do Adenovírus.
- Adsorção - ligação do vírus à membrana celular da célula mediada pelas fibras e knobs.
- Entrada pela claterina (endocitose)
- Direcionada para o endossoma e há um desempacotamento parcial – vírus perde fibras e knobs.
- Cápsideo vai para o núcleo e liberta material genético.
- Dentro do núcleo, o DNA do vírus começa a ser expresso: o mRNA viral é transcrito e as proteínas virais começam a ser sintetizadas.
- Maturação dos vírus e a sua libertação – feita com a destruição da membrana celular (lise celular)
Em que consiste a 3ª geração da produção de vetores adenovirais?
➜ Retira-se tudo com a exceção das ITRs e o sinal de empacotamento
➜ Aumenta bastante o espaço para clonagem (35 kb) e a segurança.
