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MMD 1042 - Module 3 > Technologies de l'ADN > Flashcards

Technologies de l'ADN Flashcards

1
Q

Nucléase

A

Enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides

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2
Q

Exonucléase

A

Enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’-> 3’ou dans le sens 3’-> 5’

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3
Q

Endonucléase

A

Enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments

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4
Q

Endonucléases de restriction

A

Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions

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5
Q

Importance des enzymes de restriction

A

Servent à la défense contre les virus des bactéries
(les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux

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6
Q

Enzymes de restriction

A

Enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques

La vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques

  • Bouts francs
  • Bouts collants
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7
Q

Séquence palindromique

A

Se lit de la même façon dans les deux directions

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8
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose

A

Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille
L’ADN est chargé négativement
Pour faire une analyse de restriction, après digestion, on peut séparer les fragments obtenus en appliquant un champs électrique

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9
Q

Ligation

A

Processus dans lequel deux fragments d’ADN peuvent être joints
Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN grâce à une ligase

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10
Q

Ligation d’extrémités franches

A

L’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants
car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions, tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments d’ADN dépendent de collisions aléatoires

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11
Q

ADN recombinant

A
  • Afin de perpétuer et produire l’ADN recombinant en quantité illimitées Paul Berg a eu l’idée d’insérer l’ADN dans un vecteur d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome
  • Cette ligation du fragment d’ADN dans un vecteur est couramment dite « Cloning »
  • Comme vecteur Pau Berg a utilisé un plasmide
  • Et cette idée a été la base du premier brevet en ADN recombinant
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12
Q

Plasmide

A

Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte

A une origine de réplication fonctionnel et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication dans l’organisme hôte

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13
Q

Vecteur

A

Plasmide qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN

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14
Q

Plasmide contenant des séquences d’ADN

A

Requises pour:
- Réplication dans la bactérie (origine de réplication)
- Gène(s) de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur (Ex pBR322, ampicilline et tétracycline)
- Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN(Exemple pBR322 en bleu)
- Dans des versions plus tardives il y a un site de multicolonage, avec plusieurs site de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)

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15
Q

Clonage d’un fragment d’ADN

A

Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur

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16
Q

Transformation et sélection avec antibiotique des bactéries transformées

A

Procédé d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure

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17
Q

Efficacité de la transformation des bactéries

A

N’est pas 100% - pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide
Au mieux l’efficacité de transformation est de 1/2000

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18
Q

Clonage d’un fragment d’ADN: sélection avec antibiotique des bactéries transformées

A

On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que de gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide

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19
Q

Utilisations possibles de l’ADN amplifié

A
  • Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
  • Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
  • Pour la production de protéines recombinantes (telles que l’insuline humaine, hormone de croissance humaine, facteurs de coagulation, immunogènes pour vaccins, la lactase…)
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20
Q

Protéines recombinantes

A

Production de protéines d’intérêt médical (insuline) ou biotechnologique (enzymes qui digèrent la lignine du bois) par des méthodes d’ADN recombinant

Recombinant d’ADN

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21
Q

Vecteur d’expression

A

Utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (EX: l’insuline humaine)
- Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
- Clonage du gène (restriction, ligation)
- Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
- Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantité (EX: insuline, hormones de croissance humaines)

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22
Q

GFP: Green Fluorescent Protein

A

Des fusions de gènes avec la GFP permettent d’étudier:
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire

23
Q

Protéines fluorescentes de différentes couleurs

A

Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire

24
Q

Protéines fluorescentes de différentes couleurs

A

Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire

25
Q

Propriétés des ADN polymérases

A
  • Polymérisation toujours dans la direction 5’ -> 3’
  • Ne peut pas initier la réplication à partir de rien: peut seulement ajouter des nouveaux nucléotides à un bout 3’ OH déjà existant
26
Q

ADN polymérase: besoin d’amorce

A
  • In vivo: brin d’ADN en polymérisation (brin conducteur), amorce ARN/fragment d’Okazaki (brin retardé, ou tardif)
  • In vitro: Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
27
Q

ADN polymérase: besoin de matrice simple brin

A
  • In vivo: région simple brin de l’hélice ouverte par l’hélicase
  • In vitro: ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
28
Q

Principe de l’hybridation

A

L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (re-hybrider) en ADN double-brin, lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)

Renaturation selon la règle G-C et A-T

29
Q

Méthode de Sanger

A

Méthode de terminaison de chaîne (appelée aussi du didéoxy)
Moyen pour détecter une mutation dans un gène

30
Q

Méthode de terminaison de chaine

A

1) Séparation des brins et ajout d’amorce
2) Ajout: des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), un des dNTPs est marqué pour détection
Ajout d’un des didéoxynucléotides (ddNTP) par tube et de l’ADN polymérase pour polymérisation de l’ADN
3) Séparation sur gel et détection des brins synthétisées par extension de l’amorce
4) Lecture de la séquence sur gel

31
Q

Amorce

A

~15 à 30 nucléotides
Oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice qui est radioactive ou fluorescente

La polymérase permet d’ajouter des dNTP et à polymériser l’ADN en 3’ de l’amorce

Plus les amorces sont longues, plus elles sont spécifiques (moins de chance de reconnaître plus d’un endroit dans le génome)

32
Q

Principe du PCR (polymerase-chain reaction)

A

1) Séparation des brins (95˚C)
2) Hybridation des amorces (55˚C)
3) Synthèse par la Taq polymérase (72˚C)

Amplifications faites par 20-30 cycles d’environ 5 min chacun

33
Q

Taql ADN polymerase

A

Thermus aquaticus qui vit à 70˚C

34
Q

STR

A

Short Tandem Repeats (2-6 nucléotides) qui peuvent être répétées de 5 à 200 fois, une après l’autre (en tandem) dans un même locus

Le génome humain a 50 000 à 100 000 di-nucléotides répétés et un
moindre nombre de tri, tétra et penta-nucléotides répétés

35
Q

Locus

A

Emplacement physique précis et invariable sur un chromosome
Peut être un endroit du chromosome où se situe un gène, ou pas

36
Q

DNA fingerprinting

A

Nombre de STR varie dans un même locus pour chaque individu

37
Q

VNTR

A

Variable Number of Tandem Repeats (10-100 nucléotides)
Peuvent être répétées 10 -1,500 de fois dans un même locus

38
Q

STR et VNTR: détermination de la paternité

A

Dans ces études de profil, les deux copies (copie du père et de la mère) sont analysées. Si les deux copies du VNTR et/ou STR n’ont pas le même nombre de séquences, répétées on voit deux bandes

Plus le STR ou VNTR testé est polymorphique (nombre de séquences répétées très variable selon les individus), plus il est utile dans ce test de profil génétique

39
Q

Comparaison entre la séquence d’ADN de deux personnes choisies au hasard

A
  • Identique à 99.9%
  • 0.1% restant = variations qui caractérisent chaque individu génétiquement
  • Variations peuvent fortement affecter le risque de maladie d’un individu
40
Q

SNP

A

Polymorphismes de nucléotides simples: sites dans la séquence d’ADN où les individus diffèrent selon une seule base d’ADN qui est maintenu par l’hérédité

41
Q

SNP chez les individus

A
  • Chaque individu a de nombreux SNPs: 1/300 nucléotides (environ 10 millions de SNP/génome humain de 3 milliards de nucléotides)
  • Ensemble, les SNPs créent un motif d’ADN unique pour chaque individu
  • Les SNPs aideront à améliorer notre capacité à comprendre et à traiter les maladies humaines
42
Q

SNP vs. mutation

A
  • SNP: variation de base d’ADN simple trouvée > 1% de la population
  • Mutations: variation de base d<ADN simple trouvée < 1% de la population
43
Q

Traits génétiques associés aux SNPs

A
  • Couleur des yeux et de cheveux
  • Performance musculaire
  • Comportement social
  • Hérédité et susceptibilité à des maladies
  • Réponse individuelle aux médicaments
44
Q

SNPs associées à différents traits génétiques

A
  • SNPs liés
  • SNPs causatifs: SNPs des régions codantes, SNPs des régions non-codantes
45
Q

SNPs liés

A
  • À proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement
  • Ne causent pas de traits mais servent de marqueurs
46
Q

SNPs causatifs

A

Causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement

47
Q

SNPs des régions codantes

A

Peuvent affecter la séquence et la fonction des protéines

48
Q

SNPs des régions non-codantes

A

Peuvent affecter l’épissage de pré-ARNm, la régulation d’un gène, niveau d’expression

49
Q

Projet HapMap: but

A

Réduire le nombre de SNPs requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype (maladie, sensibilité, réponse au traitement, etc)
(réduire de 10 millions de SNPs dans le génomes à environ 500 000 SNPs étiquettes)

Permettra des études du génome beaucoup plus efficaces et complètes pour trouver des régions avec des gènes qui affectent les maladies - plus d’effort gaspillé à typer les SNPs et toutes les régions du génome peuvent être incluses

50
Q

HapMap: identification des susceptibilités génétiques à des maladies

A
  • Identifier des différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
  • Développer des tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulaire
  • Offrir un traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie
51
Q

Médecine traditionnelle

A
  • “Educated guess” sur quel est le meilleur traitement à
    prescrire
  • Chaque année, plus de 106,000 personnes meurent aux USA de réactions adverses à des médicaments prescrits correctement
  • D’autres 2.2 millions souffrent de graves des effets secondaires mais pas mortels
52
Q

Médecine personnalisée

A
  • Résultats des études génomiques seront utilisés
  • Utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte du profile génétique et environnemental du patient
53
Q

Médecine traditionnelle

A
  • “Educated guess” sur quel est le meilleur traitement à
    prescrire
  • Chaque année, plus de 106,000 personnes meurent aux USA de réactions adverses à des médicaments prescrits correctement
  • D’autres 2.2 millions souffrent de graves des effets secondaires mais pas mortels

MMD 1042 - Module 3 (10 decks)

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