Técnicas laboratoriais em Imunologia Flashcards
(111 cards)
1
Q
Qual a finalidade dos testes sorológicos e dos imunoensaios?
A
Detectar e/ou quantificar antígenos ou anticorpos em amostras biológicas
2
Q
Porque todo teste sorológico é um imunoensaio, mas nem todo imunoensaio é um teste sorológico?
A
Pois imunoensaio é a técnica geral que detecta ou quantifica antígenos ou anticorpos em diversas amostras. Já o teste sorológico faz essa detecção apenas em soro sanguíneo
3
Q
Principais características do teste Imunocromatográfico?
A
Teste rapído, qualitativo, detecção de anticorpos e antígenos, a amostra pode ser soro, plasma ou amostra total
4
Q
No que se baseia o teste Imunocromatográfico?
A
Baseia-se na movimentação da amostra líquida por capilaridade através de uma tira de membrana de nitrocelulose.
Durante o percurso, a amostra encontra anticorpos ou antígenos marcados com substâncias visíveis (geralmente ouro coloidal ou nanopartículas coloridas).
Se o alvo (antígeno ou anticorpo) está presente na amostra, ele se liga aos reagentes da tira, formando um complexo imune visível na linha de teste.
5
Q
O que detecta os anticorpos da classe IgG
A
Infecção passada ou resposta tardia
6
Q
O que detecta os anticorpos da classe IgM
A
Infecção recente ou fase aguda
7
Q
O que é uma reação de precipitação?
A
Reações imunológicas onde um anticorpo solúvel, reage com um antígeno solúvel, para formar complexos imunes insolúveis. Esses complexos precipitam
8
Q
Na reação de precipitação, qual o ponto ideial para a formação dos complexos?
A
Quando há quantidades ótimas de ambos (nem antígeno em excesso nem anticorpo em excesso). Chamada de Zona de Equivalência
9
Q
Na reação de precipitação no que consiste a Pró-Zona?
A
Excesso de anticorpo
10
Q
Na reação de precipitação no que consiste a Zona de Equivalência?
A
Proporção ideal de antígeno e anticorpo
11
Q
Na reação de precipitação no que consiste a Pós-Zona?
A
Excesso de Antígeno
12
Q
No que consiste a técnica imunodifusão radial dupla?
A
Técnica de imunoprecipitação em gel onde tanto o antígeno quanto o anticorpo difundem simultaneamente a partir de poços separados e se encontram no meio do gel. Quando as concentrações de antígeno e anticorpo ficam equilibradas na zona de equivalência → formam uma linha visível de precipitação.
13
Q
Na imunodifusão radial dupla, o que é a reação de identidade?
A
As linhas se fundem formando um arco contínuo. Indica que os antígenos são iguais ou muito parecidos.
14
Q
Na imunodifusão radial dupla, o que é a reação de não identidade?
A
As linhas se cruzam sem se fundir. Indica que os antígenos são diferentes
15
Q
Na imunodifusão radial dupla, o que é a reação de identidade parcial?
A
Formação de uma linha contínua + uma linha de “espora” para fora. Indica que os antígenos compartilham alguns determinantes, mas não todos.
16
Q
Para que serve a técnica de imunodifusão radial simples?
A
Uma técnica quantitativa usada para medir a concentração de um antígeno
17
Q
Como é o processo da imunodifusão radial simples?
A
O anticorpo é incorporado uniformemente no gel de ágarose.
O antígeno (que queremos medir) é colocado em um pequeno poço (buraco no gel).
O antígeno difunde radialmente no gel.
Quando encontra o anticorpo correspondente, forma-se um anel de precipitação.
17
Q
Como análisar o resultado da técnica de imunodifusão radial simples?
A
O diâmetro do anel é proporcional à quantidade de antígeno: quanto mais antígeno → maior o diâmetro do anel.
18
Q
Geralmente a imunodifusão radial simples é utilizada para medir a concentração de que tipo de antígeno?
A
Proteínas, como: imunoglobulinas, fatores do complemento, proteínas de fase aguda e proteínas de transporte.
18
Q
Quais são as etapas da imunoeletroforese?
A
- Preparação da lâmina
Se coloca uma camada de ágar (um gel semi-sólido)
numa lâmina.
Fazem-se dois tipos de cavidades:
Um poço para o antígeno (ex: soro humano).
Uma “vala” (trough) para o anticorpo
(antissoro). - Adição do antígeno
No poço é colocado o antígeno (pode ser uma mistura de proteínas do soro). - Separação do antígeno por eletroforese
Liga-se a corrente elétrica: o antígeno migra no gel.
Durante a migração, as proteínas se separam conforme a carga elétrica e o tamanho delas. - Adição do antissoro
A vala é preenchida com antissoro (anticorpos que reconhecem as proteínas do soro). - Difusão
Tanto antígeno quanto anticorpo começam a difundir lateralmente no gel. - Formação de linhas de precipitação
Onde antígeno e anticorpo se encontram em proporções ideais, formam-se linhas brancas de precipitação.
Cada linha indica a presença de um complexo imune diferente (uma proteína reconhecida por seu anticorpo).
18
Q
O que é Imueletroforese?
A
É uma técnica que combina a eletroforese (separação de proteínas) com uma reação antígeno-anticorpo (precipitação). Ela permite identificar e analisar proteínas específicas numa mistura complexa (como o soro sanguíneo).
19
Q
Como é feita a interpretação da técnica de imunoeletroforese?
A
Se o antígeno ou o antissoro estiverem muito concentrados ➔ forma muitas linhas ou linhas fortes.
Se estiverem diluídos ➔ linhas mais fracas ou menos linhas.
Cada linha corresponde a uma proteína (antígeno) que foi reconhecida por um anticorpo.
20
Q
Quais são os 2 princípios de dispersão da luz?
A
Dispersão Rayleigh e Dispersão Mie
21
Q
No que consiste a dispersão de Mie
A
Acontece quando as partículas são de tamanho comparável ou maior que o comprimento de onda da luz. A dispersão Mie é mais complexa, pois depende tanto do tamanho quanto da composição da partícula
22
No que consiste a dispersão de Rayleigh
Ocorre quando as partículas dispersoras têm um tamanho muito menor que o comprimento de onda da luz incidente. Nesse caso, a dispersão é inversamente proporcional à quarta potência do comprimento de onda da luz.
23
No que consiste as técnicas utilizando dipersão da luz?
A dispersão da luz é um fenômeno físico importante que ocorre quando a luz interage com partículas ou estruturas de diferentes tamanhos, alterando sua direção e intensidade.
24
Qual o princípio da nefelometria?
É baseado no fenômeno da dispersão da luz, que ocorre quando um feixe de luz incide sobre partículas em suspensão em uma solução. As partículas dispersam a luz em diferentes direções, e a quantidade de luz dispersa é proporcional à concentração de partículas na amostra. O detector é posicionado em um ângulo específico para medir a luz dispersa, permitindo a quantificação da concentração de partículas.
25
Na nefelometria a dipersão de luz depende de quais fatores?
Tamanho e forma das partículas: Partículas maiores dispersam mais luz.
Concentração de partículas: Quanto maior a concentração, maior a quantidade de luz dispersa.
Índice de refração das partículas: Partículas com maior índice de refração dispersam mais luz.
26
Como é feita a análise do dados na nefelometria?
A análise dos dados geralmente é feita comparando a intensidade da luz dispersa com uma curva padrão de calibração, que foi construída a partir de amostras com concentrações conhecidas de partículas.
27
Quais as proteínas específicas que a nefelometria determina?
Alfa-1-antitripsina (inibidor de elastase neutrofílica)
Alfa-1-glicoproteína ácida (↑ em inflamações agudas e crônicas)
Alfa-2-antiplasmina (inibidor de atividade fibrinolítica) IgG, IgA, IgM C3, C4
Apolipoproteínas (metabolismo lipídico)
Beta-2-microglobulina (marcador tumoral)
Anti-estreptolisina O (infecção por Streptococcus spp.)
Proteína C reativa ultrassensível (avaliação de risco para infarto e AVC)
Fator reumatoide (diagnóstico de artrite reumatoide)
28
Como a lipemia pode interfirir no resultado da nefelometria?
Dispersão de luz aumentada: A lipemia pode aumentar a dispersão da luz devido à presença de partículas lipídicas grandes e opacas (como quilomícrons). Essas partículas podem dispersar luz de maneira excessiva, o que pode levar a leituras falsas ou exageradas na análise, como uma concentração mais alta do que a real.
Turbidez: A lipemia pode gerar uma turbidez significativa na amostra, afetando a medição da intensidade da luz dispersa ou transmitida. A turbidez pode interferir nas medições de concentrações de anticorpos ou antígenos, resultando em resultados imprecisos.
Obstrução da passagem de luz: Partículas lipídicas podem bloquear parcialmente a luz, afetando o caminho da luz no equipamento e prejudicando a precisão da análise.
29
Como a hemólise pode interfirir no resultado da nefelometria?
Alteração na cor da amostra: A hemoglobina liberada pode alterar a cor da amostra, resultando em uma solução avermelhada ou rosada. Isso pode interferir em técnicas que dependem da transmissão ou dispersão da luz, como nefelometria e espectrofotometria, pois a cor alterada pode absorver a luz na faixa de comprimento de onda utilizada para a análise.
Interferência na dispersão de luz: As células hemolizadas podem dispersar a luz de maneira diferente das partículas normais ou dos compostos presentes na amostra. As partículas intracelulares, como fragmentos de hemácias, também podem interferir no caminho da luz, resultando em medições imprecisas.
Mudança na composição da amostra: A hemólise pode alterar a composição do soro ou plasma, liberando componentes intracelulares, como potássio e enzimas, que podem interferir em exames bioquímicos, incluindo aqueles realizados com técnicas de dispersão de luz.
30
Qual o princípio da turbidimetria?
A turbidimetria baseia-se no fenômeno da dispersão e absorção da luz pelas partículas presentes em uma amostra líquida. Quando a luz incide sobre a amostra, parte dessa luz é absorvida pelas partículas, outra parte é dispersa, e o restante atravessa a amostra.
31
Como é feita a análise da técnica turbidimetria?
A intensidade da luz transmitida é inversamente proporcional à quantidade de partículas presentes na solução. Ou seja, quanto maior a concentração de partículas, menor a quantidade de luz que passa através da amostra.
A técnica geralmente é realizada utilizando um espectrofotômetro, onde a amostra é iluminada por uma fonte de luz, e o detector mede a intensidade da luz que passa pela amostra.
32
Qual a defirença da nefelometria e da turbidimetria?
NEFELOMETRIA - MEDE A LUZ DISPERSA
TURBIDIMETRIA - MEDE A LUZ TRANSMITIDA
33
Qual o príncipio das reações de aglutinação?
O princípio básico das reações de aglutinação envolve a interação entre anticorpos e antígenos
34
Qual o mecanismo da aglutinação?
Quando o anticorpo se liga ao antígeno, forma-se uma ligação cruzada entre as partículas, o que resulta em um aglomerado visível.
35
A reação de aglutinação depende de quais fatores?
A reação é dependente de fatores como a concentração do anticorpo, a natureza do antígeno, a temperatura e o pH da solução. Um excesso de anticorpo pode levar à projeção de aglutinação, onde não ocorre aglomeração porque as partículas estão sobrecarregadas de anticorpos.
35
Por qual motivo é utilizado partículas insolúveis nas reações de aglutinação?
Aglutinação visível: As partículas insolúveis (como células, esferas de látex ou outras partículas sólidas) fornecem uma estrutura sólida que facilita a visualização da aglutinação, formando um aglomerado que pode ser observado a olho nu. A partícula insolúvel é essencial porque, quando o anticorpo se liga ao antígeno, as partículas se agregam e isso gera a formação de grandes complexos visíveis.
Maior eficácia na ligação cruzada: A presença de partículas insolúveis (como esferas de látex ou células) oferece um grande número de sites de ligação para o anticorpo, facilitando o processo de ligação cruzada. Essas partículas podem ser recobertas com antígenos ou anticorpos e, quando entram em contato com seus respectivos alvos (anticorpos ou antígenos), causam a aglutinação, que é um fenômeno que se manifesta pela formação de aglomerados visíveis.
Antígeno multivalente: Um antígeno multivalente é aquele que possui múltiplos determinantes antigênicos (epítopos), que podem ser reconhecidos por vários anticorpos. Esse tipo de antígeno é necessário porque as reações de aglutinação dependem da capacidade de ligação cruzada entre anticorpos e antígenos. Um único anticorpo se liga a múltiplos antígenos, e esses complexos se unem, formando uma rede de partículas ligadas que se agregam e se tornam visíveis. Para isso, o antígeno deve estar disponível em grandes quantidades e de forma acessível na superfície da partícula.
36
"São reações mais sujeitas a falsos-positivos". A afirmação feita está correta?
Sim, por conta das aglutinações inespecíficas
36
Quais fatores podem afetar a ocorrência de aglutinação?
Concentração do anticorpo e antígeno: O excesso de anticorpo ou antígeno pode dificultar a reação de aglutinação, pois ocorre o fenômeno de "projeção" ou "inibição" da aglutinação.
Temperatura: A temperatura ótima para a reação de aglutinação depende da classe de anticorpo e da natureza do antígeno. Muitas reações de aglutinação ocorrem em temperaturas de 25 a 37°C.
pH da solução: O pH da solução pode afetar a afinidade entre anticorpos e antígenos. A maioria das reações de aglutinação ocorre em pH neutro (aproximadamente 7.0).
Força iônica: A presença de íons na solução pode afetar a eficácia das ligações entre anticorpos e antígenos.
37
No que consiste a aglutinação direta?
A aglutinação direta é o processo onde antígenos ou anticorpos (presente na partícula insolúvel) reagem diretamente com seus anticorpos ou antígenos correspondentes na amostra testada. Essa interação resulta em agregados visíveis ou aglomerados, o que facilita a detecção.
38
Como funciona a aglutinação direta?
Antígeno ou anticorpo em partículas insolúveis:
As partículas usadas podem ser células bacterianas, glóbulos vermelhos ou partículas de látex.
Essas partículas são revestidas com antígenos ou anticorpos, tornando-as prontas para reagir diretamente com o anticorpo ou antígeno presente na amostra do paciente.
Exposição da amostra à partícula:
A amostra do paciente, que pode conter anticorpos ou antígenos de interesse, é misturada com as partículas insolúveis.
Formação de agregados visíveis:
Se houver uma correspondência entre os anticorpos da amostra e os antígenos da partícula (ou vice-versa), ocorre a ligação cruzada, formando aglomerados visíveis a olho nu.
Esses agregados indicam uma reação positiva.
39
Exemplos de testes de reações de aglutinação direta?
Tipagem de grupos sanguíneos
Teste de Widal para salmoneloses
Teste de aglutinação para toxoplasmose
Teste de aglutinação para tripanossomíase
40
No que consite as reações de aglutinação passiva?
A reação de aglutinação indireta ou passiva é um tipo de teste imunológico em que antígenos solúveis ou anticorpos são adsorvidos (aderidos) a partículas inertes (não biológicas, como látex ou eritrócitos tratados), que funcionam como uma "plataforma" para visualizar a formação de aglomerados (aglutinação).
41
Qual a diferença da reação de aglutinação direta para a passiva?
Na aglutinação direta (o antígeno já é naturalmente particulado, como em bactérias), na passiva o antígeno não é particulado por natureza e precisa ser fixado em partículas.
42
Como funciona a aglutinação passiva?
As partículas inertes (como esferas de látex ou hemácias tratadas) recebem os antígenos ou anticorpos em sua superfície.
Quando misturadas com o anticorpo ou antígeno específico correspondente, ocorre ligação entre as partículas, formando aglomerados visíveis a olho nu ou ao microscópio.
43
Qual a diferença da reação de inibição de aglutinação para as reacões de aglutinação passiva e direta?
Em vez de observar a formação de aglomerados, o que indica positividade é a ausência de aglutinação.
43
No que consiste o teste de aglutinação do latex?
O teste de aglutinação do látex é uma técnica imunológica baseada na reação antígeno-anticorpo, onde partículas de látex (microesferas de poliestireno) são revestidas com anticorpos ou antígenos específicos.
Quando o antígeno ou anticorpo alvo está presente na amostra, ele liga-se às partículas de látex e causa aglutinação visível.
44
No que consiste as reações de inibição de aglutinação?
A reação de inibição da aglutinação é um tipo de teste imunológico onde a presença de antígeno ou anticorpo em uma amostra é detectada pelo bloqueio de uma reação normal de aglutinação.
44
Fundamento da reação de inibição de aglutinação
Normalmente, quando misturamos antígeno + anticorpo específicos, ocorre aglutinação.
Na inibição:
A amostra já contém o antígeno ou anticorpo que competirá com os reagentes do teste.
Se o antígeno (ou anticorpo) da amostra se ligar primeiro ao anticorpo (ou antígeno) do teste, não sobra sítio para ligação nas partículas carregadas → não ocorre aglutinação.
45
Qual o fundamento da aglutinação do latex?
As microesferas de látex são quimicamente modificadas para carregar anticorpos (ou antígenos).
Quando o alvo (antígeno ou anticorpo) está na amostra, ele interage com as partículas e fazem elas se agruparem.
A aglutinação pode ser observada a olho nu ou sob microscópio.
46
No que consiste o teste de aglutinação de cristais de colesterol?
O teste de aglutinação de cristais de colesterol é uma técnica laboratorial utilizada principalmente para a identificação de células mesoteliais em derrames (pleurais, peritoneais, etc.).Qual o fudamenti Base: Quando células mesoteliais (ou seus fragmentos) entram em contato com cristais de colesterol em ambiente adequado, ocorre uma reação de aglutinação visível.
47
Qual o fundamento do teste de aglutinação por cristais de colesterol?
Em líquidos de derrame (pleural, peritoneal ou pericárdico), quando há lesão ou ativação de células mesoteliais, fragmentos dessas células podem ser encontrados.
Esses fragmentos contêm lipoproteínas de membrana que interagem com cristais de colesterol adicionados em teste.
Essa interação gera aglutinação visível → um sinal positivo para a presença de fragmentos mesoteliais.
48
Como o teste de aglutinação por cristais de colesterol é feito?
Prepara-se uma suspensão contendo cristais de colesterol.
Mistura-se essa suspensão com uma amostra do líquido de derrame.
Deixa-se a mistura incubar por alguns minutos.
49
Como é feita a análise de um teste de aglutinação por cristais de colesterol?
Aglutinação dos cristais: indica presença de fragmentos mesoteliais (teste positivo).
Cristais livres, isolados: ausência de fragmentos mesoteliais (teste negativo).
50
No teste de aglutinação por cristais de colesterol podem ser dados falso-positivos permanentes em quais casos?
em portadores de LES
na síndrome antifosfolipídica
na hepatite crônica
em usuários de drogas ilícitas injetáveis
na hanseníase
na malária
51
No teste de aglutinação por cristais de colesterol podem ser dados falso-positivos transitórios em quais casos?
em algumas infecções * após vacinações
no uso concomitante de medicamentos
após transfusões de hemoderivados
na gravidez
em idosos
52
No que consiste os ensaios líticos?
Ensaios líticos são testes imunológicos que avaliam a capacidade de anticorpos ou do sistema complemento de causar lise (ruptura e destruição) de células-alvo, como hemácias, bactérias ou células tumorais.
53
Como a lise ocorre nos ensaios líticos?
A lise ocorre quando a interação antígeno-anticorpo ativa o sistema complemento ou, em alguns casos, diretamente induz destruição celular.
54
No que consiste a reação de fixação do complemento?
A Reação de Fixação do Complemento é um ensaio imunológico indireto que detecta anticorpos ou antígenos em uma amostra através da capacidade de ativar e consumir o sistema complemento.
55
Qual a primeira etapa da reação de fixação do complemento
Formação do complexo Ag-Ac e fixação do complemento
Mistura-se:
Antígeno (conhecido) + Soro (desconhecido → pode conter ou não anticorpos) + Complemento fresco (normalmente de soro de cobaia).
Se o soro contém anticorpos específicos:
Formam-se complexos imunes.
O complemento é ativado e consumido (ou seja, é "fixado").
56
Qual a segunda etapa da reação de fixação do complemento
Sistema indicativo de hemólise
Depois adiciona-se:
Hemácias sensibilizadas (hemácias de carneiro recobertas com anticorpos anti-carneiro).
Observa-se:
Se o complemento foi consumido na primeira etapa, não sobra para lisar as hemácias → não há hemólise.
Se não havia anticorpo na amostra, o complemento fica livre e causa lise das hemácias sensibilizadas → hemólise visível.
57
O que significa hemólise no resultado da reação de fixação do complemento
Teste negativo (não havia anticorpo ou antígeno)
58
O que significa quando não há hemólise no resultado da reação de fixação do complemento
Teste positivo (anticorpos ou antígenos presentes)
59
No que consiste o ensaio de neutralização da hemólise?
O ensaio de neutralização de hemólise é um teste imunológico que mede a capacidade de anticorpos específicos de inibir a hemólise (a destruição de hemácias) causada por um agente hemolítico (geralmente uma toxina bacteriana).
60
Qual o fundamento do ensaio de neutralização da hemólise?
Algumas bactérias produzem toxinas hemolíticas (ex.: toxina da difteria, toxina estreptocócica, toxina tetânica).
Essas toxinas podem causar lise de hemácias se adicionadas a uma suspensão de eritrócitos.
Se você misturar essas toxinas com soro que contenha anticorpos neutralizantes:
- Os anticorpos se ligam às toxinas.
- Neutralizam sua ação.
- As hemácias não serão lisadas.
Assim, a ausência de hemólise indica que há anticorpos neutralizantes na amostra.
61
Qual o procedimento (em etapas) do ensaio de neutralização da hemólise?
Mistura:
➔ Toxina + Amostra de soro (a ser testada).
Incubação:
➔ Permitir que anticorpos (se presentes) se liguem à toxina.
Adição de hemácias sensíveis:
➔ Mistura-se com uma suspensão de hemácias.
Leitura do resultado:
➔ Avalia-se se houve lise (hemólise) ou não.
62
O que significa quando não há hemólise no resultado do ensaio de neutralização da hemólise?
Anticorpos neutralizantes presentes (teste positivo)
63
O que significa quando há hemólise no resultado do ensaio de neutralização da hemólise?
Anticorpos neutralizantes ausentes (teste negativo)
64
O que mede o Ensaio de Neutralização?
Anticorpos que bloqueiam toxinas ou vírus
65
O que mede a Fixação do Complemento?
Anticorpos que ativam o complemento
66
Qual o mecanismo do Ensaio de Neutralização?
Impede a ação do agente lítico
67
Qual o mecanismo da Fixação do Complemento?
Ativa consumo do complemento
68
O que são testes radioativos?
Ensaios imunológicos que utilizam isótopos radioativos para detectar ou quantificar antígenos ou anticorpos em uma amostra biológica.
69
O que é Radioimunoensaio?
O Radioimunoensaio (RIA) é uma técnica de altíssima sensibilidade que permite quantificar pequenas quantidades de antígenos ou anticorpos em uma amostra, utilizando um marcador radioativo.
Baseado na competição entre moléculas marcadas e não marcadas por locais de ligação de anticorpos.
70
Qual o fundamento do método do Radioimunoensaio?
Se você mistura:
Antígeno radioativo conhecido (Ag*).
Anticorpo específico (Ac).
Antígeno da amostra (não radioativo, Ag).
Eles competem para se ligar ao mesmo anticorpo.
Quanto mais antígeno da amostra (não marcado) existir, menos antígeno radioativo se ligará ao anticorpo.
Assim, a quantidade de radioatividade ligada inversamente indica a concentração de antígeno na amostra.
71
Quais são as etapas do precedimento de Radioimunoensaio?
Preparação dos reagentes:
Antígeno radioativamente marcado (geralmente com ¹²⁵I — iodo-125).
Anticorpo específico purificado.
Competição:
Mistura do antígeno marcado com anticorpo e com a amostra (contendo antígeno não marcado).
Eles competem pelos locais de ligação dos anticorpos.
Separação:
Separar o complexo Ag-Ac (ligado) do antígeno livre.
Medição da radioatividade:
Usar um contador gama para medir a quantidade de radiação no complexo.
Interpretação:
Comparar o sinal obtido com uma curva-padrão feita com concentrações conhecidas de antígeno.
72
Quais são as aplicações clínicas do RIA
-Dosagem de hormônios:
Insulina, cortisol, hormônio tireoidiano (TSH, T3, T4).
-Detecção de antígenos virais e bacterianos.
-Pesquisa de drogas no sangue (teste toxicológico).
-Avaliação de níveis de anticorpos pós-vacinação.
-Detecção de marcadores tumorais.
73
No que consiste o teste de ELISA?
O ELISA é um método imunológico que detecta ou quantifica antígenos ou anticorpos utilizando enzimas ligadas a anticorpos ou antígenos.
A detecção ocorre pela conversão de um substrato cromogênico (sem cor) em um produto colorido pela ação da enzima.
74
Qual o fundamento do teste de ELISA?
Antígeno ou anticorpo é imobilizado numa superfície sólida (geralmente uma placa de poliestireno de 96 poços).
Um anticorpo (ou antígeno) ligado a uma enzima é adicionado.
Ao adicionar o substrato específico da enzima:
A enzima catalisa uma reação → gera cor.
A intensidade da cor é proporcional à quantidade de alvo (antígeno ou anticorpo) presente na amostra.
75
Descrição do ELISA direto?
Antígeno é imobilizado; anticorpo marcado detecta diretamente
Rápido, menos sensível.
76
Descrição do ELISA indireto?
Antígeno imobilizado → anticorpo primário → anticorpo secundário marcado.
Mais sensível; usado para detecção de anticorpos.
77
Descrição do ELISA captura?
Anticorpo imobilizado → captura antígeno → segundo anticorpo marcado detecta.
Detectar antígenos (ex.: citocinas).
78
Descrição do ELISA competitivo?
Antígeno da amostra compete com antígeno marcado.
Útil para moléculas pequenas (ex.: hormônios, drogas).
79
O que é ELISPOT?
O ELISPOT é um método imunológico que detecta células individuais que secretam uma molécula específica (como uma citocina, anticorpo, ou outro fator).
Diferente do ELISA (que mede moléculas solúveis em um líquido), o ELISPOT mede quantas células estão produzindo aquela molécula.
80
Qual o fundamento do ELISPOT?
As células são colocadas em uma placa (geralmente 96 poços) cujo fundo está revestido com anticorpos capturadores.
Quando uma célula secreta a molécula-alvo, ela é imediatamente capturada localmente pelo anticorpo no fundo da placa.
Depois:
Um anticorpo de detecção (ligado a uma enzima) é adicionado.
Um substrato enzimático é usado → aparece um ponto visível no local onde uma célula secretora esteve.
Cada mancha (spot) corresponde a uma célula funcional ativa!
Assim, é possível contar quantas células específicas estão secretando a molécula desejada.
81
No que consiste a quimiluminescência?
A quimiluminescência é a emissão de luz gerada por uma reação química.
Em imunologia, técnicas baseadas em quimiluminescência são usadas para detectar antígenos ou anticorpos, substituindo enzimas cromogênicas (como no ELISA) por reações que liberam fótons detectáveis por aparelhos.
*Onde antes se media cor, agora se mede luz!*
82
Qual o fundamento da quimiluminescência?
Um anticorpo (ou antígeno) é ligado a uma enzima que catalisa uma reação quimiluminescente.
Quando o substrato é adicionado, ocorre uma reação química que gera a emissão de luz (fótons).
A intensidade da luz gerada é proporcional à quantidade de antígeno ou anticorpo presente.
A luz é medida por um luminômetro (um fotodetector extremamente sensível).
83
Quais são as etapas do método do processo de quimiluminescência?
Imobilização do alvo (antígeno ou anticorpo) em fase sólida.
Adição de um conjugado (anticorpo ou antígeno marcado com uma enzima quimiluminescente).
Lavagem para remover excessos.
Adição do substrato quimiluminescente.
Leitura da luz emitida.
84
No que consiste a técnica de Western Blot?
O Western blot é uma técnica que detecta proteínas específicas em uma amostra biológica, combinando a separação por tamanho (eletroforese) e a identificação por anticorpos específicos.
85
Qual é o fundamento da técnica de Western Blot?
Separação de proteínas por peso molecular usando eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Transferência das proteínas separadas para uma membrana (nitrocelulose ou PVDF).
Bloqueio da membrana para evitar ligação inespecífica de anticorpos.
Incubação com anticorpo primário específico contra a proteína de interesse.
Incubação com anticorpo secundário conjugado a uma enzima ou molécula de detecção.
Detecção do sinal gerado (por quimiluminescência, cor ou fluorescência).
86
O que é a etapa de eletroforese em gel na técnica de Western Blot?
Amostras são tratadas com SDS (dodecil sulfato de sódio) que:
- Desnaturam as proteínas
- Conferem carga negativa proporcional ao tamanho.
- Proteínas são separadas conforme seu peso molecular em um gel de poliacrilamida.
87
O que é a etapa de transferência na técnica de Western Blot?
As proteínas separadas no gel são transferidas para uma membrana usando:
- Corrente elétrica (eletrotransferência).
- A membrana retém as proteínas na posição que estavam no gel.
88
O que é a etapa de bloqueio na técnica de Western Blot?
A membrana é incubada com uma solução bloqueadora (ex.: leite desnatado, albumina).
Evita que os anticorpos se liguem de forma não específica.
89
O que é a etapa de incubação do anticorpo primário na técnica de Western Blot?
Anticorpo específico para a proteína alvo.
90
O que é a etapa de incubação do anticorpo secundário na técnica de Western Blot?
Anticorpo contra a espécie do primário.
Conjugado com:
- Enzimas (ex.: HRP - peroxidase de rábano).
- Marcadores fluorescentes.
91
O que é a etapa de detecção na técnica de Western Blot?
Enzima + substrato gera:
- Luz (quimiluminescência) — detectada por filme ou câmera digital.
- Cor (precipitação visível no local da proteína).
- Fluorescência (equipamento especial para captar).
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Aplicações da técnica de Western Blot?
Pesquisa de antígenos ou anticorpos
Teste confirmatório na investigação de doenças infecciosas e autoimunes
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No que consiste as técnicas de Ensaios com marcadores fluorescentes?
Ensaios com marcadores fluorescentes utilizam moléculas que emitem luz fluorescente quando excitadas por uma fonte de energia (geralmente luz ultravioleta ou laser).
Esses marcadores são conjugados a anticorpos, antígenos ou outras moléculas para detectar ou quantificar alvos específicos.
A fluorescência permite rastrear, visualizar e quantificar biomoléculas com altíssima sensibilidade e especificidade.
94
Como funciona a Imunofluorescência?
A amostra é exposta a luz de excitação (como UV ou laser), o fluoróforo emite uma luz visível que permite a localização espacial e/ou quantificação dos antígenos.
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Qual o processo da Imunofluorescência direta?
Antígeno na célula → Anticorpo fluorescente → Fluorescência
(Técnica mais rápida, menos etapas)
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Qual o processo da Imunofluorescência indireta?
Antígeno na célula → Anticorpo primário → Anticorpo secundário fluorescente → Fluorescência
(Sinal amplificado (mais fluoróforos por antígeno), mais flexível (diversos secundários).)
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Quais as aplicações da Imunofluorescência?
Identificação de inúmeras subpopulações de linfócitos (ex.: T CD4+ e CD8+ )
Identificação de espécies bacterianas
Detecção de complexos Ag-Ac nas doenças autoimunes
Detecção de componentes do complemento nos tecidos
Localização de hormônios e outros produtos celulares corados in situ
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No que consiste a técnica de citometria de fluxo?
É uma técnica usada para analisar células ou partículas (como micróbios) enquanto passam em fluxo rápido por um feixe de laser.
Cada célula é analisada individualmente.
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Quais características a citometria de fluxo consegue medir?
Tamanho (dispersão frontal da luz – forward scatter),
Granularidade ou complexidade interna (dispersão lateral da luz – side scatter),
Expressão de proteínas específicas (detectada por anticorpos marcados com fluorocromos).
100
Qual o processo em etapas da citometria de fluxo?
As células são marcadas com anticorpos fluorescentes.
Passam uma a uma no feixe de laser.
A luz espalhada e a fluorescência são captadas por sensores.
O aparelho gera gráficos e relatórios que mostram as características celulares.
101
Quais aplicações da citometria de fluxo?
Determinação de tipo e nº de leucócitos
Isolamento de uma subpopulação de leucócitos (ex.: linfócitos T)
Obtenção de medida de distribuição da densidade antigênica em uma população de células
Determinação do tamanho celular
Detecção e classificação de leucemias
Medida das subpopulações de linfócitos T (prognóstico da AIDS)
102
No que consiste a técnica de imunohistoquímica?
Técnica usada para detectar proteínas específicas dentro de tecidos usando anticorpos marcados.
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Qual o processo em etapas da imunohistoquímica?
Prepara-se uma lâmina com o tecido.
Incuba-se o tecido com um anticorpo específico contra a proteína de interesse.
O anticorpo está ligado a uma enzima (como peroxidase) ou a um marcador fluorescente.
Um substrato é adicionado e gera uma cor visível onde a proteína está.
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Quais a aplicação da imunohistoquímica?
Diagnóstico de câncer (para determinar o tipo e a agressividade).
Pesquisa biomédica (estudo de doenças autoimunes, infecções, etc.).
Identificação de patógenos em tecidos.
