Tecnologías de secuenciamiento genómico Flashcards
(28 cards)
Herramienta con la que se realizó el proyecto de Genoma Humano.
Secuenciación tipo Sanger
Son nucleótidos modificados químicamente que carecen de un grupo hidroxilo (-OH) en el carbono 3’ de la desoxirribosa que están asociados a un color cuando entrar en contacto con un láser.
Dideoxinucleótidos
Secuenciación en la cual se utilizan dideoxinucleótidos.
Sanger
Ventajas de la secuenciación de tipo Sanger.
Precisa para secuencias largas (>900 pb)
Son fragmentos de ADN que se obtienen mediante amplificación por técnicas como la PCR punto final.
Amplicones
Desventajas de la secuenciación de tipo Sanger
Es costosa, ineficiente para la secuenciación de genomas completos y metagenomas.
Son el conjunto de genomas presentes en una comunidad microbiana directamente extraída de una muestra ambiental o biológica.
Metagenomas
Ingredientes para llevar a cabo la secuenciación de tipo Sanger
- ADN molde (template)
- Dideoxinucleótidos (dNTPs)
- Polimerasa
- Primers
Orden para realizar una secuencia de tipo Sanger
- Unificación de ingredientes.
- Desnaturalización de las hebras de la cadena de ADN a temperaturas altas.
- A temperatura baja, la polimerasa comienza a agregar indistintamente los nucleótidos o dNTPs a su cadena complementaria (template).
- Una vez que se agrega un dNTPs, se detiene la cadena de extensión y se generan fragmentos de distinto tamaño de variables.
- Los fragmentos se añaden equimolarmente al gel de electroforesis y se organizan por tamaño desde el más pequeño al más grande.
- Pasan a través de un detector de fluorescencia (láser) a través de un tubo capilar, pasaran primero los más pequeños debido a su carga +.
- Se identifican los dNTPs debido a su modificación química asociada a un color a través de análisis en computadora.
¿Cuál es el principio de la secuenciación por síntesis?
Se detecta la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia durante la síntesis de ADN.
¿Cuál es la plataforma principal de la secuenciación por síntesis?
Illumina
¿Cuáles son las ventajas de la secuenciación por síntesis?
- Alto rendimiento
- Bajo costo po base
- Ideal para estudios de re-secuenciación
- Análisis de variantes
- Secuenciar una región en particular
¿Cuáles son las desventajas de la secuenciación por síntesis?
- Longitud de lectura limitada, se secuencian fragmentos más pequeños.
- Errores de homopolímeros.
- Sesgo en la amplificación.
El diagnóstico de enfermedades asociadas a variantes genéticas son codificadas por
exones.
Pasos para elaborar un workflow illumina
- Preparación de bibliotecas: Fragmentación del ADN para realizar un proceso paralelo y masivo.
- Se agregan adaptadores que funcionan como identificadores/indicadores de segmentos “código de barras”.
- Estos fragmentos se adhieren a una superficie sólida (como una placa de flujo) y se producen ciclos de amplificación mediante un proceso llamado amplificación por puente para generar clusters.
- Comienza la secuenciación en sí.
- En cada ciclo de secuenciación, se incorpora un nucleótido marcado con fluoróforo al ADN en crecimiento.
- Análisis informático
Pasos para elaborar un ion Torrent
- ADN se fragmenta.
- Se le añaden adaptadores a los fragmentos para la fijación a la superficie sólida de chips semiconductores.
- Dicho chip semiconductor contiene miles de pozos minúsculos, cada uno con un único fragmento de ADN.
- A medida que el ADN se replica y se incorpora un nucleótido en la cadena de ADN, se libera un ión de hidrógeno (H⁺), lo que provoca un descenso en el pH local.
- El “llamado de bases” ocurre cuando se detecta un cambio en el pH causado por la incorporación de un nucleótido específico.
Pasos para elaborar un Pac Bio
- ADN se fragmenta y se le añaden adaptadores.
- Los fragmentos se colocan en celdas de reacción o pozos en un chip SMRT (Single Molecule Real-Time).
- Inicia la secuenciación en tiempo real y durante esta, se utiliza una polimerasa para sintetizar la cadena de ADN a partir de la molécula molde.
- El proceso de lectura se realiza mediante el uso de nucleótidos fluorescentes que están marcados con un color diferente según el tipo de base.
Útil para secuenciar lecturas largas (2-50 Kb)
Pac Bio (Secuenciación en tiempo real de molécula única SMRT)
¿Cómo funciona la secuenciación por nanoporos?
Las moléculas de ADN se pasan a través de un pequeño poro hecho de una proteína o material sintético, y los cambios en la corriente eléctrica que se generan cuando las bases del ADN pasan por el poro se utilizan para identificar cada base en la secuencia.
Secuenciación ideal para el ensamblaje de genomas y estudios de variantes estructurales.
Secuenciación por nanoporos
Ventaja principal de la secuenciación por nanoporos
Lecturas largas (hasta Mb)
Desventajas de la secuenciación por nanoporos
- Menor precisión
- Mayor costo por base
- Tecnología aún en desarrollo
Primera generación
Precisión alta, lectura corta, costoso.
Ejemplos de tecnologías de primera generación
Sanger
