Tema 7. Etiquetas para purificar y localizar proteínas Flashcards
¿Cómo podemos producir proteínas de fusión?
Hay otras secuencias que podemos fusionar a nuestra proteína de interés que no solamente le dan la estabilidad, sino que también permiten su purificación de una forma sencilla. Por ejemplo, si corto con BamH1 y EcoR1 y clono el gen de manera que esté en fase, obtendría una proteína fusionada a una etiqueta que le da estabilidad
¿Cómo purificamos rápidamente de proteínas de fusión a GST?
Una estrategia es hacer una proteína de fusión con GST y mi proteína de interés. Después con las herramientas para purificar GST, obtengo la proteína de interés purificada también. Este sistema contiene varios elementos: una secuencia promotora regulada, un gen que codifica para la glutatión transferasa (GST), aguas abajo de la secuencia de GST tenemos una secuencia específica que da lugar a un tramo de aa que son el sitio de reconocimiento de una proteasa, el factor Xa. Esto va a servir para quitarle esa secuencia GST a la proteína una vez la tengamos, y un sitio de clonación múltiple (BSE) donde introducimos nuestra secuencia
El extracto con la proteína de fusión lo paso por una columna con glutatión pegado que se une específicamente a GST. El resto de proteína se irán a lavar. Ahora trato con la proteasa Xa que rompe en esos aa y liberaría mi proteína purificada, quedándose la de glutatión pegada. Otra opción sería eluir con glutatión libre que compita con el glutatión de la columna para así despegar el complejo. Después ese extracto lo trato con Xa dejando la proteína de interés y el GST separados, y ya lo paso por una columna de glutatión donde se quedarán pegadas las GST y obtengo mi proteína purificada
¿Cómo produzco proteínas etiquetadas con His?
Una de las etiquetas más usadas es la cola de His, consiste en añadir una cola de 6 His, que tiene mucha afinidad por el zinc. El plásmido ahora va a presentar: la secuencia con las His, el sitio reconocido por la proteasa Xa, y un sitio de clonación múltiple donde poner nuestra secuencia en la fase de lectura correcta
Clonamos en fase con el sitio de corte de la proteasa y aguas arriba ponemos la cola de His. Como son pocos aa, hay veces que no altera la función de la proteína., En este caso, expresamos una proteína de fusión y lo pasamos por una columna de níquel que tiene también mucha afinidad por las His
2 opciones: introducimos el factor Xa directamente o ponemos imidazol que separa el complejo, una vez liberada tratarla con el factor Xa para obtener nuestra proteína de interés purificada-. Después ponemos una columna de níquel y ya se queda allí pegada la etiqueta
¿Qué es la inteína?
Es una etiqueta que “se quita sola”.
Una alternativa con mayor eficacia para separar la proteína de interés es usar una etiqueta en fase llamada inteína, que es un fragmento de proteína que tiene actividad proteasa sobre sí misma en determinadas condiciones. Además, para purificarla tiene también un dominio de unión a quitina (CBD) para así pasarlo por una columna de quitina para que se una la proteína de fusión. Una vez que las tengo pegadas se añade ditioeritritiol que, al cambiar el estado de oxidación de la inteína, la activa y se proteoliza, separándose de la proteína de interés que sale de la columna
¿Cómo purificamos proteínas mediante el sistema strep-tag?
El strep-tag tiene afinidad a la estreptavidina, si lo pasamos a una columna de estreptavidina se queda pegada. Para despegarlo después de los lavados se introduce biotina, que compite con la estreptavidina y separa la proteína de fusión de la columna
¿Cómo nos ayuda la GFP como etiqueta para localizar proteínas?
No todas las etiquetas tienen la labor de estabilizar o purificar la proteína, otras tienen el interés de poder visualizar la posición de la proteína intracelularmente en organismos, por ejemplo
La más usada para esto es la proteína verde fluorescente (GFP), se aisló a partir de una medusa y tiene una estructura de barril beta en cuyo interior se encuentra una cadena alfa con el grupo cromóforo (aa que cuando reciben luz cambian de conformación y emiten fluorescencia)
Se han ido obteniendo versiones distintas de esta proteína con mutaciones en residuos concretos que hace que cambie su espectro de absorción y de emisión. Algunas mutaciones, además, no afectan al espectro, sino que aumentan la estabilidad o expresión de la proteína
Esta versatilidad hace que tengamos un rango muy amplio de proteínas fluorescentes y nos permite observar distintas proteínas con localización similar que puedan estar interaccionando
¿Cómo podemos localizar intracelularmente proteínas mediante fusión a GFP?
La proteína GFP se puede fusionar a otra proteína de la que queremos estudiar su localización intracelular y así podemos conocer la localización subcelular de esa proteína de interés
¿Cómo podemos averiguar la localización tisular de una proteína mediante fusión a GFP?
También se pueden generar animales transgénicos modificando los embriones para poder observar una proteína de interés en las distintas fases de su desarrollo. A estos embriones les introducimos un vector con mi proteína unida a GFP
Marcamos proteínas distintas con diferentes fluorescencias. En el microscopio se ve en blanco y negro pero después se edita y se ve de otro color. Si le pongo otro filtro para fluorescencia amarilla aparece otra fluorescencia. Hago varias fotos con distintos filtros y luego solapo
mNeonGreen es la proteína monomérica más brillante y no es una variante de la GFP. Fue aislada de un cefalocordado
¿Qué etiquetas pueden ser reconocidas por anticuerpos de uso universal?
Entre estas etiquetas destacamos:
His6 (6 aa)
FLAG8 (8 aa)
HA o hemaglutinina (9 aa)
GST o glutatión S-transferasa (218 aa)
GFP o proteína verde fluorescente (238 aa)
Se trata de fusionar una proteína de interés a una etiqueta convencional. Existen anticuerpos comerciales que reconocen estas etiquetas. Se pueden realizar experimentos usando dichos Ac (por ejemplo, Western blot, cooinmunoprecipitación, ChIP…)
En la coinmunoprecipitación el anticuerpo reconoce la etiqueta y otra proteína Y se une a la proteína de interés
¿Cómo puedo llevar a cabo la expresión de proteínas en la superficie de bacterias?
Existen vectores que nos permiten crear proteínas de fusión para poder identificar en una genoteca una proteína con una propiedad concreta; es decir, el vector nos permite identificar dentro de una colección muy grande de proteínas distintas a una proteína con una propiedad específica
Puedo fusionar un gen concreto con mi proteína de la membrana externa bacteriana para que la bacteria exponga en el exterior mi proteína y esté más accesible
Tengo una colección de fragmentos de DNA y quiero saber que proteínas se unen a un cierto anticuerpo, para ello genero una genoteca con muchos vectores que tienen distintos insertos y se expresarán proteínas híbridas con la proteína diana y la transmembrana, colocándose en la membrana de la bacteria
Ahora puedo pasar estas bacterias por una columna con un Ac específico y se unirán las que hayan expresado la proteína de interés. Rescato estas bacterias, extraigo el plásmido y lo secuencio para saber qué gen es el que su proteína se une a mi Ac
¿Cómo puedo llevar a cabo la expresión de proteínas en la superficie de fagos (phage display)?
Vamos a fusionar una proteína de interés a la proteína pIII del fago M13, que se expresa en su cubierta e infecta a E. coli. Para ello, se va a usar un plásmido (un fagémido) que, además de lo común en el resto de plásmidos, tiene el gen de la cubierta del fago M13 y el origen de replicación del fago, el cual puede replicar este DNA pero en formato de una cadena que es lo que reconoce el fago M13 para encapsularlo
Posteriormente, generamos esta genoteca con distintos fagémidos e infectamos con un fago M13 mutado que replica su DNA también pero que en presencia del fagémido con el origen de replicación, encapsula a este antes que a su DNA propio, debido a que tiene más afinidad por ese origen de replicación
La célula también ha expresado las proteínas de fusión de la cubierta junto con mi proteína de interés procedentes del fagémido. Cuando se formen los nuevos fagos, tendrán la cubierta con proteínas normales y proteínas de fusión que tengan mi proteína también, además de haber encapsulado el fagémido. Posteriormente, pasamos los fagos por una columna con el anticuerpo que se unirá a una proteína de la genoteca. Después extraigo el DNA y veo qué gen es el que genera la proteína de interés
¿Cómo puedo seleccionar ZFNs con nuevas especificidades mediante phage display?
Otro ejemplo donde se puede usar el phage display es con ZFN, estas presentan el dominio de corte de FokI y unos ZFN que se unan a una secuencia específica del DNA. En este caso, se hace una colección de ZFN y se generan muchos fagos que exponen en la membrana estos dedos de cinc. Ahora veo cuál de estos fagos se une mejor a mi secuencia diana, para ello al DNA in vitro le pongo una bola magnética y toda mi colección de fagos la incubo con el DNA, uniéndose algunos y otros no. Después con un imán aíslo lo que se pega, extraigo el DNA de cada virus y veo qué combinación de ZFN funciona mejor
