Ultracentrifugation

Question 1

Qu’a-t-il été démontré avec l’ultracentrifugeuse?

Answer 1

1. Les protéines sont des macromolécules homogènes
2. Un grand nb de protéines ont des sous-unités

Question 1

Comportement des macromolécules en solution - sédimentation

Answer 1

• Le comportement des macromolécules en sln, qui sont soumises à la force g, ne démontrent aucune évidence de sédimentation.
• L’agitation thermique est suffisante pour les garder dispersées de façon homogène en sln
• C’est seulement qd les macromolécules sont assujetties à des accélérations énormes qu’elles commencent à se sédimenter

Question 2

Vitesse de l’ultracentrifugeuse

Answer 2

80 000rpm = forces qui dépassent 600 000 fois g

Question 3

La vitesse à laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de…

Answer 3

Sa masse

Question 4

Force de sédimentation

Answer 4

= Force centrifuge - Force de flottaison (due au déplacement de la sln par la particule)

mw^2r - Vp p w^2r

Question 5

Force de friction

Answer 5

Le déplacement d’une particule à travers une solution est opposé par une force qui représente la friction entre la particule et la solution.

Question 6

Quand atteint-on la phase stationnaire?

À quoi sert cette technique?

Answer 6

Sous l’influence d’une force centrifuge, une particule va accélérer jusqu’à ce que tt les forces soient contrebalancées.

mw^2r - Vp p w^2r = vf

À mesurer la masse de macromolécules

Question 7

Volume partiel spécifique
_
V

Answer 7

= changement en volume lorsque 1gsec de particules est dissous dans un soluté à volume infini

Question 8

Formule de la vitesse qd toutes les forces sont annulée:

Answer 8

_
v= Mw^2r (1-Vp) / Nf

Question 9

Coefficient de sédimentation

Answer 9

S= v/w^2r = M(1-Vp) / Nf

est analogue au coefficient de mobilité électrophorétique, sa valeur est exprimée en unités de 10^-13sec qui sont connues sous forme de Svefbergs (S)

Cette relation indique qu’il sera possible de déterminer la masse d’une particule, m=M/N, à partir de son coefficient de sédimentation S et de son coefficient de friction f

Question 10

Complexes de macromolécules

Answer 10

L’analyse des complexes de macromolécules utilise l’ultracentrifugation
(masse exprimée en S)

• ribosome bactérien
• ribosome eucaryote
• protéasome 26S

Question 11

Centrifugation préparative

Answer 11

• Centrifugeuses préparatives faites pour préparation d’échantillons avec grands volumes
• Sédimentation faire avec sln inerte (saccharose, chlorure de césium) dans lesquels la conc et donc la densité augmente du haut vers le bas dans le rotor

Question 12

Gradients de densité

Answer 12

Augmentent le pouvoir de résolution de la centrifugeuse

Ce type de gradient minimise l’agitation d’une sln par convection (qui peut nuire à la résolution)

Question 13

Les 2 applications des gradients de densité

Answer 13

1. Ultracentrifugation zonale
2. Ultracentrifugation en gradient de densité à l’équilibre

Question 14

Ultracentrifugation en zones

Answer 14

• sépare les particules selon leurs coefficients de sédimentation
• la sln de macromolécules est déposée sous forme de couche en haut d’un gradient de densité
• gradient = saccharose

Question 15

Ultracentrifugation en zones: Séparation + Processus

3 éléments

Answer 15

• Puisque la vitesse de sédimentation est + sensible à la forme d’une molécule que sa densité, l’ultracentrifugation en zones sépare les macromolécules de forme similaire selon leur masse.
• Pendant la centrifugation, chc molécule se déplace à travers un gradient à une vitesse déterminée par leur coefficient de sédimentation (donc migre comme une zone)
• À la fin, la récolte des fractions se fait avec aiguille + collecteur de fraction

Question 16

Ultracentrifugation par densité d’équilibre
(Centrifugation isopycnique)
- sert à quoi?

Answer 16

• Sépare les macromolécules selon leur densité
• Technique préférée pour séparer les macromolécules qui ont une gamme de densité (acides nucléiques, ribosomes, virus, etc.)

Question 17

Ultracentrifugation par densité d’équilibre
(Centrifugation isopycnique) - Processus

Answer 17

L’échantillon est dissout ds une sln concentrée d’une subst. dense qui diffuse vite comme CsCl/Cs2SO4 et qui est subie à des hautes vitesses de rotation.
- Le fort champ centrifure génère un gradient de sel ds lequel les composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de densités = à celle de la sln de sel. Donc aucune migration car v=0