vize iki (son üç slayt) Flashcards
(38 cards)
PCR veriminin azalmasının sebepleri?
döngü sayısı arttıkça enzimin tanıması gereken nükleotitlerin
sayısının fazla olması,
* tekrarlanan ısı değişiklikleri ve
* artışların enzim aktivitesini olumsuz etkilemesi olarak ifade
edilebilir .
Verimli bir PCR için neler optimize ve standardize edilmelidir?
Denatürasyon,
¡ Primerlerin bağlanması,
¡ Primerlerin uzaması,
¡ Döngü sayısı,
¡ Thermal cycler’ın iniş-çıkış sürelerinin,
¡ optimizasyonu ve standardizasyonu yapılmalıdır.
PCR’ın verimi kaçtır?
%85
PCR’ın temel bileşenleri nelerdir?
Kalıp DNA
¡ dNTP’ler
¡ Tamponlar
¡ MgCl2
¡ Primerler
¡ PCR Enzimleri
Neden tamponlara ihtiyaç vardır PCRda?
+Enzimlerin, özellikle DNA polimerazın, maksimum aktivite gösterebilmesi için belirli bir pH aralığında çalışması gerekir. Tamponlar, bu pH’ı sabit tutar.
+Tamponlar genellikle Mg²⁺ iyonları içerir, çünkü DNA polimerazın aktif olması için bu iyonlara ihtiyaç vardır.
PCR reaksiyonlarında genel olarak tercih edilen enzime spesifik
tamponlar kullanılmaktadır. Bunlar nasıl temin edilmektedir?
Bunlar satın alınan enzimle birlikte 10X konsantrasyonda temin
edilebilmektedir.
Mg iyonlarına neden ihtiyaç vardır?
Mg+2 iyonları DNA polimeraz enziminin kofaktörü olarak
görev alırlar. Polimeraz enziminin katalitik bölgesine
bağlanarak reaksiyon verimini arttırırlar.
8İdealden düşük ve yüksek Mg konsantrasyonlarında nolur?
Düşük Mg+2 konsantrasyonu ürün oluşumunda azalmaya
neden olurken yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise spesifik
olmayan ürünlerin birikimine neden olur
İdeal primerin özellikleri nelerdir?
Yaklaşık 20 bp büyüklüğünde
¡ %50 G+C içeren
¡ Polipürin, polipirimidin ve tekrar bölgeleri olmayan
¡ Sadece bir bölgeye spesifik
¡ Erime ısısı (Tm, temperature melting) çok düşük olmayan,
yaklaşık 60ºC erime sıcaklığına sahip,
GC Kelepçesi” (GC Clamp)
Bu, primerlerin 3’ ucunun bir G veya C ile bitmesi anlamına gelir. G veya C, A ve T’ye göre daha sıkı bağlanır ve DNA polimerazın sentezi daha verimli başlatmasını sağlar.
Dejenere primlerler ne zaman tercih edilmeli?
- Amino asit sekanslarından primer sekanslarının tahmin edilmesinde,
- Bilinen bir gen ailesinin yeni üyelerinin araştırılmasında,
- Türler arasındaki homolog genlerin araştırılmasında, kullanılmaktadır.
- Düşük kodon dejenerasyonlu amino asitler tercih edilmeli,
Nested PCR ve Nested primerler nedir?
İlk PCR’de kullanılan primerler bazen hedef dışı DNA bölgelerine bağlanabilir ve istenmeyen ürünler oluşabilir.
Nested PCR, ikinci bir PCR turu ekler. Bu turda, hedef DNA’nın içinde bir bölgeyi tanıyan, ilk turdaki primerlerin içine yerleşik (nested) yeni bir primer çifti kullanılır.
(İlk turda dış primerler hedef DNA bölgesinin daha geniş bir kısmını amplifiye eder.)
Bu sayede, sadece hedef DNA’dan gelen doğru ürün daha fazla çoğaltılır, yanlış amplifikasyon ürünleri minimuma indirilir.
PCR tipleri?
Multipleks PCR
- Hot-Start PCR
- Nested ve Semi-Nested PCR
- Reverse transkriptaz PCR (RT-PCR)
- Touchdown PCR
- In-Situ PCR
- Real-Time PCR
- Broad-Range veya Consensus PCR
- Invers (Tersine dönmüş) PCR
- Asimetrik PCR
- Homopolimerli PCR
PCR teknolojisini ilk yıllarında DNA olarak ne kullanılmıştır?
PCR teknolojisinin ilk yıllarında E. coli DNA polimeraz I’in
Klenow fragmenti PCR enzimi olarak kullanılmıştır.
END POINT DETECTION eksiklikleri:Düşük hassasiyet
- Düşük çözünülürlük
- Otomasyon eksikliği
- Yalnızca boy belirlenebilmesi
- Sonuçların rakamsal olarak ifade edilmemesi
- EtBr ile boyamanın nicelik belirlemede etkin olmaması
- PCR sonrası işleme devam gereği (agaroz jel elektroforezi)
Real Time PCR naıl yapılır?
PCR karışımına floresan boya (ör. SYBR Green) veya problar (ör. TaqMan probları) eklenir.
Amplifikasyon sırasında DNA miktarındaki artış, termal döngü cihazındaki bir dedektör ile eş zamanlı olarak ölçülür.
Elde edilen veriler, amplifikasyonun verimliliğini ve DNA miktarını kantitatif (nicel) olarak değerlendirmeye olanak tanır.
PCR’da plataue effect nedir?
Plateau etkisi, PCR sırasında amplifikasyonun belirli bir döngüden sonra durma veya yavaşlama eğilimini ifade eder. Başlangıçta DNA miktarı her döngüde eksponansiyel olarak (2^n) artarken, belirli bir noktadan sonra bu artış azalır ve sonuçta sabit bir seviyeye ulaşır.
hibridizasyon probları?
donör
acceptor iki uç tasarlıyoruz.
baş ve Kuyruk olucak şekilde.
hidroliz probunda cleavege gerek!yordu
ışıma için . burda ise !k! prob b!rl!kte
olduğunda ışıma (donor + akseptör)a ışıma geçrekleşir.
özellikle hastanalerde falan, daha yüksek kesinlik için!
qPCR’da gen ifadesinin bağıl olarak ölçümünde tespit yöntemleri?
Tespit Yöntemleri (Detection method):
Fit point method: Verilerin bir eşik değere göre analiz edilmesi.
2. türev maksimum (2nd derivative maximum): Eğrinin ikinci türevinin kullanılması.
Arkaplan düzeltme (background correction): Arkaplan gürültüsünün ayıklanması.
Doğrusallık (Linearity of assay): PCR reaksiyonunun doğrusal çalışma aralığı.
qPCR’da gen ifadesinin bağıl olarak ölçümünde miktar belirleme stratejileri?
Mutlak Miktar Belirleme (Absolute Quantification):
Standart eğri kullanarak DNA miktarının kesin olarak belirlenmesi.
Normalization with HKG (Housekeeping Genes):
Referans genler (housekeeping genes) kullanarak normalize etme.
Bağıl Miktar Belirleme (Relative Quantification):
Hedef gen ifadesinin kontrol gruplarına göre karşılaştırmalı olarak ölçülmesi.
Kombinasyon (Combination of Absolute and Relative Quantification):
Hem mutlak hem bağıl miktar belirleme yöntemlerinin kullanılması.
qPCRda verilerin analizinde test yöntemleri?
İstatistik analiz yazılımları: SAS, SPSS, Excel, SigmaStat.
Verinin normalliğinin test edilmesi.
t-Test: İki grup arasındaki farkların anlamlılığını test eder.
ANOVA: Birden fazla grup arasındaki farkları test eder.
Permutation Test ve Randomization Test gibi istatistiksel yöntemler.
göreceli ekspresyon nedir?
göreceli (relative) gen ekspresyonu, bir genin ifade seviyesinin kontrol grubu veya referans bir örnek ile karşılaştırmalı olarak ölçülmesidir. Bu yöntem, mutlak değerler yerine hedef genin diğer örneklere göre ne kadar fazla veya az ifade edildiğini belirlemeye odaklanır.
CT değeri nedir?
Ct (cycle threshold) değeri, hedef genin PCR amplifikasyonunda floresan sinyalinin eşiği geçtiği döngü sayısını ifade eder.
gen kütüphanesi nedir?
¡ Bir organizmanın tüm genomunu ya da protein kodlayan genlerini
kapsayan klonların tümüne gen kütüphanesi adı verilir
