VL 4 - 6 Flashcards
(32 cards)
Rekombinante DNA
neues DNA molekül
- durch Kombination nicht homologer DNA Fragmente entstanden
Gentechnisch veränderter Organismus
Organismus enthält DNA Sequenz eines anderen Organismus, wurde nicht durch Kreuzung hergestellt
Markierung von DNA
- durch DNAse1 werde Teilstücke entfernt
- DNA-pl1 fügt markierte nucleotide ein
–>random priming - modifizierte Nukleotide können durch Antikörper erkannt werden, immunologisch nachgewiesen oder über Komplexbildung mit anderen Makromolekülen
Isolierung mRNA und cDNA Synthese
- Inaktivierung von RNAsen (da sehr labil)
- aufreinigen von mRNA durch poly-dT-Oligo (bindet an Poly-A-Schwanz)
- umschreiben zu cDNA mit reverser Transkriptase (DNA ohne Introns)
DNA Klonierung
Einführen eines DNA-Abschnitts in ein geeignetes Vehikel (Vektor)
- Restriktionsenzyme: schneiden an definierter Sequenz
- Vektoren : Vehikel, mit dessen Hilfe DNA in Wirtszelle gebracht wird
Restriktionsenzyme 1. Klasse
Erkennungssequenz 15bp
- nur ersten und letzten 3 wichtig
- spaltet unbezifisch ca. 1000 bp in 3’ Richtung
Restriktionsenzyme 2. Klasse
- Schneiden innerhalb palendromischer Sequent
- Schneiden oft zwischen gleichen Basen (sticky ends)
- oder ohne Überhänge (Blunt ends)
Restriktionsenzyme 3. Klasse
- schneiden in definierten Abstand zur Erkennungssequenz
Vektoren Eigenschaften
- aufnähme fremder DNA
- autonome Vermehrung in Wirtszelle
- oft mit Antibiotikum-Resistenzgen
- wird je nach DNA-Sample-Größe gewählt
Plasmide
Replikationsurprung
- hat Resistenzgene
- Multiple Cloning Site -> dort wird Wunsch-DNA einkloniert
gerichtete Klonierung
Vektor und Insert werden mit 2unterschiedlichen Restiktionsenzymen behandelt bzw. linearisiert
ungerichtete Klonierung
- beide mit einem RE behandelt
- beide Enten von Insert und Vektor sind kompatibel
- > Gen kann Falschrum eingelagert werden
Ziel genetischer Analyse
Function der Proteine: Welche Proteine sind an welche Prozessen beteiligt ?
Forwards Genetics
- WT nehmen und durch Zufallsmutagenese mutieren lassen
- gewollten Mutantenphänptyp herausfiltern
- schäumen welches Gen mutiert ist, und daraufhin Zurückschließen welches Protein für die Ausprägung des Wildtyps verantwortlich ist
Ziel von Forward Genetics
möglichst alle Gene innerhalb eines Prozesses zu identifizieren
Probleme Forwards Genetics
- unterschiedliche Genlänge
- > je länger desto eher mutation
- Mutation kann mehrere Phänotypen verursachen
Mutagenese
- gerichtete Mutation
a) genetische Selektion -> nut gewollte überleben/wachsen
b) genetisches Screning -> alle Mutanten wachsten, danach alle Individuen auf gewollten Phänotyp überprüfen
reverse Genetics
Aufreinigen des Vorgangs den einen interessiert mittels biochemischen Ansatz
- > bestens falls notch 1 Protein übrig
- > aus Aktivität des Proteins kann auf das Gen zurück schließen
Methoden reverse Genetics
- Gen-Knockout
- Zielgerichtete Mutagenese
- RNA-Interferenz
4 chemical Genetics/Genomics
Southern Blotting
DNA Dementierung mit einer DNA Sonde
- Restriktionsverdau DNA
- Auftragen Gel
- transfer DNA aus Gel auf Membran
- Hybridisierung mit markierter Sonde
- Autoradiogramm -> schwärzen eines Radiofilms an stellen mit Sonde
Northern Blotting
Ergänzung zu southern Blotting
- RNA Detektion mit DNA/RNA Sonden (äquivalent zu southern Blotting)
Western Blotting
Protein-Detektion mit Antikörper (ähnlich Southern Blotting)
Microarray (OMICS Technologie)
- Sonde ist aug unterlage befestigt
Ablauf
- Gesamt-RNA
- cDNA
- Markierung (mit Fluoreszenz Markern)
- Hybridisierung mit Chip
- > Fluoreszierung bei Hybridisierung -> Signalintesität korreliert mit cDNA menge
- es können mehrer Gene auf einmal getestet werden (veschiedene Marker)
Tilling Array (OMICS Technologie)
nucleotidpolymorphismus erkennen
–> man muss gene kennen dafür
