Картиране на генома Flashcards
(47 cards)
Какво представлява shotgun подходът за секвениране и картиране на генома?
Накъсване на ДНК на по-къси сегменти, определяне на секвенцията на всеки сегмент и търсене на застъпващи се участъци с компютърни програми за възстановяване на цялата секвенция. Широко използван за малки геноми.
По каква формула се изчисляват възможния брой застъпвания за n фрагменти?
2n^2-2n
Кои са проблематичните фактори при подреждането на застъпващи се фрагменти в цялостен геном?
Повтарящите се секвенции в генома;
Възможност за погрешно възстановяване на цялата секвенция с липсващи участъци или такива, които не са на мястото си.
Какво представлява генетичната карта?
Информация за местата на гените или на отделни дискретни участъци от генома.
Кои са подходите за секвениране на генома при наличие на генетична карта?
- Shotgun
- Clone contig
Определение за “контиг”
Набор от припокриващи се ДНК фрагменти, които заедно представляват консесусна област на ДНК.
Същност на clone sequencing
Метод за секвениране на генома, при който първо се картиране на всяка хромозома, след което ДНК се накъсва на фрагменти от по 150 килобази, които се клонират в бактериален плазмиден вектор. Бактериите се делят, намножавайки и ДНК фрагментите. Клонираната ДНК след това се накъсва на застъпващи се фрагменти от по 500 бази. Следва секвениране чрез вкарването на тези фрагменти във вектор с позната последователност и секвенирането започва от тази позната последователност към непознатата.
Определение за “геномно картиране”
Процес на определяне разположението на гени върху хромозомите.
Каква е основната разлика между clone sequencing and shotgun sequencing?
Clone sequencing налага картиране на генова преди секвенирането, съответно е по-времеемък, но по-точен метод.
Кои са 2те основни техники за картиране на генома?
- Генетично картиране - генетични техники;
- Физично картиране - молекуларно-биологични техники, акцентиране върху физичните параметри на гените;
Определение за “пълно геномно картиране” (WGM)
Високоефективна технология за щамово типизиране, сравнителна геномика и сглобяване на последователностите от пълното геномно секвениране. Лесно разграничаване между свързани и несвързани (родствени и неродствени) щамове.
Определение за секвениране на ДНК
Определяне на последователността на 4те основни никлеотидни бази в първичната структура на ДНК. В един експеримент могат да се секвенират само по няколкостотин нуклеотида.
Защо е необходимо комбиниране на техниките за секвениране с техники за картиране на генома?
За да се установи разположението на секвенирания ген в рамките на целия геном.
Какво представлява методът на Сенджър (метод на прекъснатия синтез)?
Метод за секвениране на ДНК, с използване на модифицирани ддНТФ, чието свързване към нарастващата ПНВ прекъсва нейния синтез на случайно място. Синтезира се поредица от вериги с нарастваща дължина. Провежда се в 4 отделни епруветки - една за всеки тип ддНТФ.
Какво трябва да е съотношението между нормалните дНТФ и модифицираните ддНТФ?
100 пъти по-малко ддНТФ
На какъв принцип се осъществява методът на Сенджър за секвениране (метод на прекъснатия синтез)?
PCR - евДНК, праймери, дНТФ (ддНТФ)
Как става разделянето на фрагментите ДНК, получени чрез методът на Сенджър (метод на прекъснатия синтез)?
Чрез полиакриламидна гелелектрофореза (PAGE) - 4 ивици, всяка от които отговаря на един от нуклеотидите.
Какви са начините за получаване на евДНК за анализ на секвенцията?
- Клониране на ДНК в плазмиден вектор (най-широко използвано).
- Клониране на ДНК във вектор М13 (фаг).
- Клониране на ДНК във фагмиди.
- Получаване на евДНК чрез PCR.
Как протича клонирането на ДНК в плазмиден вектор за анализ на секвенцията?
Срязване на плазмида с ендонуклеази - съшиване на ДНК фрагмента към плазмида - превръщане в едноверижна форма чрез алкално третиране или чрез нагряване.
Как протича клонирането на ДНК във вектор М13 за анализ на секвенцията?
Фаг М13 има евДНК като геном.
E. coli се инфектира с фага, където става превръщането на ДНК в дв репликативна форма. Тя се копира до получаване на 100 такива рекомбинантни молекули и около 1000 фагови частици се освобождават от бактерията. (само 3кб)
Определение за “фагмид”
Клониращ плазмиден вектор, който съдържа участъци от плазмид и участъци от фаг М13 или друг фаг с едноверижен геном. (над 10кб)
Как се модифицират праймерите при PCR за получаване на пречистена евДНК?
Един от праймерите се свързва с фини метални частици. Пречистването става с магнитно поле.
Какво е приложението на thermal cycle sequencing?
Използване на двДНК за секвениране - премахване на необходимостта от клониране и получаване на евДНК. Стандартна PCR реакция, при която се използва един праймер - копира се само едната верига, т.е. има линейно нарастване. Във всяка реакционна смес се поставя само един ддНТФ. Получените фрагменти се анализират с PAGE.
Кои са методите за разчитане на ДНК секвенцията?
- Авторадиография
- Автоматично секвениране
