Brainscape's Knowledge GenomeTM


Top Flashcards (Certified)
All Flashcards

МГМАК > PCR > Flashcards

PCR Flashcards

(75 cards)

Start Studying
1
Q

Какво представлява PCR методът?

A

In vitro техника. при която определена ДНК последователност се копира многократно, като броят на копията расте експоненциално и всяка новосинтезирана ДНК слуци като матрица за следващо копие. Основава се на откриването на специфична целева ДНК последователност, характерна за търсения организъм. Прилага се успешно в хранителната индустрия и научно-изследователската дейност.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Кои са предимствата на PCR методите?

A

Висока чувствителност - достатъчна една молекула НК;

Висока специфичност - разпознаване на точно определена последователност в едноверижната ДНК;

Висока ефективност - бърз, икономичен и прецизен; стабилност на ДНК;

Висока селективност - разграничаване на отделни организми и индивиди, анализ във всеки вид тъкани и органи (еднаква ДНК), приложим за всички биологични обекти;

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Видове PCR методи

A

Стандартен
Real-time (qPCR)
Компетитивен
Southern blot анализ
Пулсова гел електрофореза (PFGE)
RAPD - анализ на случайно амплифицирани полиморфни ДНК
rep-PCR - с повтарящи се елементи

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Структура на нуклеотиди

A

пентоза - азотна база към 1-С атом (с 1 или 9ти N-атом на АБ - N-гликозидна връзка) и фосфатен остатък към 5-С атом

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Какво представляван НК?

A

Линейни полимери от мононуклеотидни единици.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Какво представлява “нуклеозидът”?

A

Азотна база + пентоза

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Функции на нуклеотидите в клетките

A
  • АТФ - участие в клетъчни метаболизъм
  • УТФ - активира междинни метаболити
  • ЦТФ - в синтезата на ФЛ
  • НАД, НАДФ, ФМН, ФАД - компоненти на кофактори и редокс системи
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Как се нарича връзката между отделните нуклеотиди в ПНВ?

A

3’-5’ фосфодиестерна връзка

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Формула за изчисляване на максималния брой секвенции от една ПНВ

A

4^n
n=брой нуклеотиди

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Параметри на двойната спирала на ДНК

A

Един оборот на всеки 10 нуклеотида;
3,4 нм стъпка на спиралата;
0,34 нм разстояние между базите;
2 нм диаметър на спиралата;
не е напълно симетрична - голяма и малка бразда;
захарно-фосфатен скелет и стекирани азотни бази отвътре;

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Определение за “ген”

A

Участък от ДНК, който кодира синтеза на една ППВ. От 100 до няколко млн нд. Разпръснати върху генома.
E.coli - 4000 гена
Човек - 30 000 гена

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Компоненти на PCR реакцията

A
  1. НК матрица (малко количество с висока чистота);
  2. Термостабилна полимераза;
  3. Праймери (олигонуклеотиди 18-30bp) - прав и обратен;
  4. Нуклеотиди в еквимоларни количества;
  5. Буфер;
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Какво количество НК е необходимо за провеждане на PCR реакцията?

A

1 нг - 1 микрограм

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Какво е необходими, за да е активна ДНК полимеразата?

A

Mg2+
Свободен 3’-ОН край
Енергия (от dNTP)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Използвани в практирата ДНК полимерази

A

Taq - Thermus aquaticus
Pfu - Pyrococcus furiosus
Vent (Tli) - Thermococcus litoralis

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

При какви условия протича PCR реакцията?

A

Буферирана среда - рН 8,3-9;
Mg2+ = 1.5-3.0 mM
Tris-HCl, KCl, MgCl2
Компонентите на буфера варират в зависимост от изискванията на конкретната Taq полимераза

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Какво е оптималното количесто от всеки dNTP за протичане PCR реакцията?

A

50-200 микромола

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Етапи на PCR реакцията

A
  1. Денатуриране на dsDNA - 94-96оС;
  2. Свързване на праймерите - 55-70оС различно за всеки праймер;
  3. Амплификация - 72оС
    30-35 цикъла - достатъчно количество за последващ анализ
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

В каква посока се синтезира новата ДНК верига?

A

5’->3’

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

С каква цел се прилага агарозна гел елекрофорезата, последваща PCR-a?

A

Определяне размерът, концентрацията и качеството на продукта - визуализиране и документиране на резултатите. Големината на получените фрагменти се сравнява с молекулен маркер.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Същност на агарозната гел елекрофореза

A

Разделяне на ДНК фрагменти под въздействието на електрично поле, въз основа на различната им големина. Гелът служи като молекулно сито, през което отрицателно заредените ДНК молекули се движат към (+) анод, като по-големите молекули се движат по-бавно.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
22
Q

Как става визуализирането на ДНК фрагментите?

A

С етидиев бромид или друго багрило.
С uv-трансилуминатор.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
23
Q

Как се определя какво да бъде % съдържание на агароза в гела за ЕФ?

A

От големината на търсените фрагменти - 1-2%, обратно пропорционално на ММ на фрагментите.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
24
Q

Какви буфери се използват в гел ЕФ?

A

TAE - Tris-base, acetic acid, EDTA - за фрагменти над 4000 bp;
TBE - Tris-base, boric acid, EDTA - за фрагменти от 100-3000 bp;

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
25
Приложения на PCR техниките
Еволюция, археология и палеонтология; Криминалистика - ДНК профили, родствени връзки; Анализ на храни; Анализ на ГМО и автентичност на храни; Геномика; Клинична диагностика - мутации, наследствени болести, пренатална диагностика;
26
Същност на компетитвния PCR
Метод, базиращ се на едновременната амплификация на целева ДНК последователност и външен стандарт (конкурент с известна концентрация), който притежава същите места за свързване на праймерите и подобни секвенции и дължина. Полуколичествен метод - концентрацията на целевата ДНК е по-ниска или по-висока от тази на конкурента.
27
Приложение на компетитивния PCR
Количествено определяне на ДНК последователности в някои от най-често използваните трансгенни растения при производството на храни.
28
Недостатъци на компетитивния PCR
- голям брой подготвителни стъпки; - продължителен и икономически неефективен; - множество разреждания - вероятност за замърсяване на пробите; - намаляване на чувствителността на система заради конкуренцията.
29
Същност на real-time PCR (qPCR)
Проследяване на натрупването на продуктите на амплификацията и измерването им в процеса на реакцията. Основава се на емисията на флуоресцентен сигнал с интензитет, пропорционален на количеството PCR продукт.
30
Какво представлява амплификационния плот в real-time PCR-а?
Абсцисна ос - брой PCR цикли; Ординатна ос - интензитет на флуоресценцията (количество амплифициран продукт);
31
Фази в кривите на real-time PCR-а
Експоненциална фаза - количеството на продукта се удвоява при всеки цикъл; Фаза "плато" - изразходване на компонентите на реакцията;
32
Нива на флуоресценцията в real-time PCR-а
Базово ниво - нивото на флуоресценция в началото на р-цията; Критично ниво - ниво на отчитане, 3 пъти над базовото;
33
Какво представлява Ct-стойността в real-time PCR-а?
PCR цикълът, при който PCR кривата в експоненциалната фаза пресича критичното ниво. Определя се главно от началното количество целева ДНК в пробата: - голямо количество ДНК - ниска/ранна Ct-стойност; - малко количество ДНК - висока/късна Ct-стойност;
34
Начини за количествено определяне чрез real-time PCR
Абсолютно - чрез стандартна крива, получена чрез серийни разреждания на определен стандарт; Относително - чрез разликата в Ct-стойностите между еднакви количества от контролната и анализираната проба;
35
Основни показатели за оптимизирането на един qPCR
Линейна стандартна крива (R^2 > 0.98) - линеарността е мярка за вариабилността между повторенията и показва дали ефективността на р-цията е еднаква при различния първоначален брой копия целева ДНК; Висока ефективност на амплификация Е (90-100%) - определя се от наклона на стандартната крива = -3,6 до -3,1; Адекватна повторяемост на резултатите;
36
Видове qPCR в зависимост от използваното флуоресцентно съединение
SYBR Green - неспецифично свързващи се с dsDNA; FRET - специфични праймери и сонди;
37
Принцип на SYBR Green технологиите
Слаба флуоресценция на багрилото в несвързано състояние - при свързване с двДНК се увеличава до 1000 пъти.
38
Какво представлява "кривата на топене" при SYBR Green технологиите?
Генерира се след завършване на PCR анализа чрез повишаване на Т на малки интервали и проследяване на флуоресцентния сигнал на всяка стъпка. Използва се, за да се проверят различните неспецифични реакционни продукти. Пикът в кривата съответства Тт, при която 50% от нуклеотидните двойки на двДНК се разделят. Неспецифичните продукти се топят при различни Т.
39
Предимства на SYBR Green технологиите
Лесен експериментален дизайн (2 праймера, без сонда); Възможност за анализ на множество гени; По-ниска себестойност;
40
Недостатъци на SYBR Green технологиите
Неспецифично свързване на багрилото; Необходимост от анализ на кривата на топене; Невъзможност за провеждане на мултиплексни реакции и за количествен анализ;
41
Принцип на FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Излъчване на специфична флуоресценция само в присъствието на амплифицирания продукт. Използва се сонда (праймер), маркирана с флуорофлор (отчитаща молекула) и молекула "гасител", която потиска флуоресценцията в отсъствие на целевата ДНК.
42
Действие на TaqMan сондата при FRET технологиите
Сондата е свързана с отчитаща молекула откъм 5' края си и с "гасител" откъм 3' края си. Когато сондата е цяла не флуоресцира. В хода на PCR реакцията 5'-3' екзонуклеазната активност на Taq полимеразата отцепва отчитащата молекула, тя се отделя от молекулата "гасител" и започва да флуоресцира - сигналът е пропорционален на количеството амплифициран продукт в пробата.
43
Предимства на FRET технологиите
- по-висока специфичност и чувствителност; - възможност за провеждане на мултиплексни реакции и количествен анализ;
44
Недостатъци на FRET технологиите
Висока себестойност на сондите; По-сложен дизайн на анализа;
45
Предимства на real-time PCR-a
- количествено определяне; - не е необходима ГЕФ или други допълнителни анализи- намаляване продължителността и увеличаване производителността; - провеждане в затворена система - минимална вероятност за контаминации; - автоматизиран процес; - широка област на приложение;
46
Кои фактори могат да попречат на успешната екстракция на ДНК?
Процеси на обработка на храните (накъсване на ДНК) - механични, термичним химични, ензимни въздействеия, ферментационни процеси; Наличие на PCR инхибитори, като ПЗ, полифеноли и протеини в храните (сложни хетерогенни матрици);
47
Кои са 3-те групи методи за екстракция на ДНК?
1. Утаяване с разтворители; 2. Свързване със смоли; 3. Свързване към магнитни частици;
48
Принцип на методите за екстракция на ДНК, основаващи се на утаяване на ДНК с различни разтворители
1. Термичен лизис в присъствие на СТАВ екстракционен буфер; 2. Премахване на замърсителите (липофилни молекули и протеини) чрез екстракция с хлороформ; 3. Утаяване на ДНК с изопропанол; 4. Разтваряне на получената утайка в дейонизирана вода или ТЕ буфер.
49
Какъв екстракционен буфер се използва най-често при екстракция на ДНК?
СТАВ - цетилтриметиламониев бромид
50
Кога се използва екстрация на ДНК с чрез утаяване?
При екстракция на ДНК от храни с растителен произход - разделяне на ПЗ от ДНК.
51
Принцип на методите за екстракция на ДНК, основаващи се на свързването й към различни смоли
ДНК има голям (-) заряд и може да се свързва към (+) заредени частици на анионнообменна хроматографска смола. Смолата се добавя директно към клетъчния лизат, центрофугира се, при което ДНК остава свързана към смолата, а примесите се отстраняват с надутаечната течност.
52
Етапи в екстракция на ДНК с използване на хроматографски колонки
1. Зареждане на смолата в колонката и добавяне на клетъчния лизат; 2. ДНК се прикрепя към мембраната, а замърсителите преминават през нея; 3. Промиване за отстраняване на замърсителите; 4. Елуиране на пречистената ДНК с буфер с висока солева концентрация (неутрализиране на електростатичните взаимодействия).
53
Предимства на методите за екстракция на ДНК, основаващи се на свързването й към различни смоли
- лесна и бърза екстракция от разнообразни матрици; - не се използват органични разтворители;
54
Предимства на методите за екстракция на ДНК, основаващи се на свързването й към магнитни частици
- лесна и бърза екстракция от разнообразни матрици; - не се използват органични разтворители; - няма продължителна инкубация на пробите по време на клетъчния лизис; - няма многократни етапи на центрофугиране; - магнитните частици имат функцията на мобилна фаза;
55
Етапи в екстракция на ДНК с използване на магнитни частици
1. Sample loading 2. Lysis 3. Binding 4. Washing
56
Фактори, определящи степента на разрушаване (фрагментация) на ДНК
Вид на изследвания продукт Степен на преработка Естество на използвания метод за екстракция
57
Как се отчита степента на фрагментация на ДНК чрез ГЕФ?
Наблюдава се петно или ивица с по-малка молекулна маса (намаляващ интензитет).
58
ДНК фракции в зависимост от молекулните им маси
1. Високомолекулни >20000 bp 2. Средно големи 500-20 000 bp 3. Нискомолекулни 100-500 bp 4. С много ниска молелулна маса <100 bp
59
Защо е необходим качествен анализ на ДНК за успешното провеждане на PCR анализа?
- да няма ясно изразени ивици с високомолекулна ДНК; - търсената ДНК съдържа ли се в пробата -> избягване на фалшиво отрицателни резултати;
60
Как се предотвратява влиянието на химични замърсители в пробите за PCR анализ?
Чрез разреждане на ДНК екстракта - намалява се концентрацията на инхибиторите и се повишава чувствителността на реакцията.
61
Какви методи се използват за определяне на концентрацията и чистотата на екстрахираната ДНК?
UV-спектрофотометрия (А260/А280 = 1,6-2,0) - по-широко прилаган; Флуоресцентна спектрофотометрия
62
Какво е оптималното количество на ДНК в пробата за PCR анализ?
20 pg - 200 ng
63
Недостатъци на UV-спектрофотометричното определяне на чистотата на екстрахираната ДНК
- по-голямо количество ДНК; - невъзможно разграничаване на ДНК от РНК; - липсва информация относно степента на фрагментация; - необходимо е много добро хомогенизиране за постигане на точен резултат;
64
Същност на Флуоресцентната спектрофотометрия за определяне на концентрацията и чистотата на екстрахираната ДНК
Количествено определяне на ДНК, въз основа на взаимодействието на ДНК с някои флуоресцентни багрила.
65
Предимства на флуоресцентната спектрофотометрия за определяне на концентрацията и чистотата на екстрахираната ДНК
Специфично свързване на багрилото с двДНК; Определяне на 0,2-200 нг ДНК;
66
Недостатъци на флуоресцентната спектрофотометрия за определяне на концентрацията и чистотата на екстрахираната ДНК
Влияние от пространственото разпределение на ДНК в р-ра; Необходимост от използване на стандарт с определен размер; Предпочита се, ако продуктът е с ниска степен на преработка;
67
Колко контроли се залагат при PCR анализа?
2: (+) в която знаем, че се съдържа търсеният ген - тя трябва задърлжително да даде (+) резултат, ако анализът е проведен правилно; (-)
68
Каква може да е причината за фалшиво отрицателен резулат при PCR анализа?
Унищожаване на ДНК по време на пробоподготовката.
69
Кои са механичните процеси, които могат да нарушат целостта на ДНК?
Различните етапи в процесите на екстракция и пречистване - разбъркване, центрофугиране, филтриране, изливане, пресоване, пипетиране, пулверизиране, смилане, хомогенизиране, смесване - заедно с продължителното й престояване.
70
Какъв е механизмът, по който се разрушава ДНК при термично въздействие?
Дезаминиране или откъсване на пуринови бази. Над 100оС - необратима загуба на вторична структура.
71
Основни термични процеси, оказващи влияние върху целостта на ДНК
Печене Варене Сушене Пържене Автоклавиране (висока Т = 121оС + високо налягане)
72
Основни химични въздействия, оказващи влияние върху целостта на ДНК
Ниско рН - откъсване на пуринови бази и разкъсване на двДНК; Високо рН - по-щадящо, кипенето в силно алкална среда (рН 11) е силно деструктивно;
73
Ензимно разрушаване на ДНК
Ендонуклеази - силажиране (консервиране с млечна киселина), млечно-кисела ферментация, втасване, и при ферментационни процеси (микробни дезоксирибонуклеази);
74
Как влияе йонизиращото излъчване върху ДНК?
При ниски дози не се наблюдава съществено фрагментиране, докато при по-високи има пълно деструктиране.
75
Как влияе облъчването с ултразвук върху ДНК?
Увеличава степента на фрагментация, но въпреки всичко се запазва способността за аплификация на ДНК молекулата.

МГМАК (4 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2025 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions