ביותא 1 Flashcards
(220 cards)
1
Q
כמה חלבונים מכיל תא אנימלי ?
A
מכיל 10 מיליארד חלבונים מ 10000 סוגים
2
Q
היכן מסונתזים חלבונים בתא יוקריוטי ?
A
הסנתזה של כמעט כל החלבונים בתאים יוקריוטים מתחילה בציטוזול , ובהמשך כל חלבון מובל לאברון המתאים.
חלק קטן מהם מסונתז במיטוכונדריה / כלורופלסט.
3
Q
כיצד נקבעת הזהות הייחודית של כל אברון ?
A
על ידי הרכב החלבונים והלפידים על פני האברון (הרכב הממברנה) , כמו כן הרכב ייחודי זה חשוב כדי שסוג הוזיקולה הנכון יגיע לאברון הספיציפי.
4
Q
מהו נפח הציטוזול , ביחס לנפח הכללי של התא ?
A
ציטוזול מהווה מעט יותר מחצי מהנפח הכללי של התא
5
Q
האם כל אברון מבצע בדיוק את אותו סט של תהליכים בכל סוגי התאים ?
A
בגדול כן ,
אך בתאים שונים נמצא מספר שונה של אותו אברון , וייתכן שהאברון בתא מסויים מפתח תפקידים נוספים שמשתנים מתא לתא
(שקף 10)
למשל תא פלזמה שמפריש נוגדנים (כמשקלו) בכל יום , יכיל יותר ER מחוספס (בו הנוגדן מיוצר)
תא לב , מכיל המון ER חלק כדי שיוכל לאגור סידן.
6
Q
גופנו משתמש בלעדית בסוכרים בקונפורמציית D , בסוכרים כאלה:
A
קבוצת OH על הפחמן הכיראלי הרחוק ביותר מקבוצת הקרבוניל פונה ימינה
7
Q
מהי הנוסחה הכללית של סוכר ?
A
C(H2O)n
כאשר n גדול או שווה לשלש.
8
Q
איזה אנזים חותך את הקשר הגליקוזידי בסוכרוז ?
A
Invertase
(אינברטאז)
9
Q
איזה אנזים שובר את הדו סוכר לקטוז ?
A
בטא-גלקטוזידאז
B-gal
10
Q
תאר את המבנים השונים של חלבונים:
A
ראשוני: קשר פפטידי + קשרי SS
שניוני: אלפא, בטא, סיבובים (turns) ולופים (loops) - מדובר בעיקר על קשרי מימן
שלישוני: דומיינים של חלבון :
B barrel , B twisted sheet , B-a-B loop
רביעוני: קומפלקסים של הטרו/ הומו פולימרים
11
Q
מהי הנוסחה הכללית של חומצת שומן ?
A
R-COOH
או
CH3(CH2)nCOOH
12
Q
ממה בנוי גליציריד ?
A
שלד של גליצרול + חומצות שומן שקשורים בקשר אסטרי
13
Q
מהו מונוגליציריד ?
A
גליצרול שקשורה אליו חומצת שומן אחת
(בקשר אסטרי)
14
Q
בעת יצירת חומצת גרעין , היכן יתחבר הסוכר לטבעת החנקנית ?
A
בפורינים הסוכר יתחבר בעמדה 9
בפרימידינים הסוכר יתחבר בעמדה 1
(שקף 28)
15
Q
על מה מתבססת שיטת הריצוף של סינגר ?
A
על שימוש בנוקליאוטידים מסוג דידאוקסי
Dedeoxy
16
Q
כל אחד ממרכיבי הנוקליאוטיד יכול לעבור מודיפיקציות:
A
- שקף 30
17
Q
Melting temperature, Tm ?
A
1) הטמפרטורה שבה 50% ממולקולה נתונה עברה דנטורציה
2) אמצע טווח הטמפרטורות בהם מתרחשת דהנטורציה
18
Q
מה הסיבה האבולוציונית שבגינה נוצר התא היוקריוטי הראשון ?
A
גדילה בנפח של התא , עד כדי שהיחס שטח פנים-נפח לא היה מספיק כדי שהממברנה הציטופלסמטית תספק את כל צורכי התא
עד כה , הממברנה הציטופלסמטית סיפקה את כל צורכי התא , שאיבת יונים , סינתזת אטפ וכו
19
Q
הממברנה הגרעינית הפנימית רציפה עם ממברנות פנימיות אחרות:
A
ממברנת הגרעין הפנימית מקורה בממברנת פלזמה קדמונית שהקיפה את הגנום בתהליך של אינווגנציה , לכן היא רציפה עם ממברנות פנימיות אחרות שמקורן בממברנת הפלסמה , כולל הממברנה הגרעינית החיצונית
20
Q
איזה עדויות יש לכך שמיטוכונדריה ופלסטיד הם אנדוסמביוטים ?
A
- גנום משלהם
- חלבונים הדומים לחלבונים בקטריאליים, כמו גם ריבוזומים שרגישים לאותם AB
- כמו פרוקריוטים הם עטופים בממברנה כפולה
- יצירת חלבונים בכלורופלסט מתחילה עם N
פורמיל מתיונין
והם נשארים מבודדים מהתנועה הוסיקולרית התאית שמחברת בין שאר האברונים וחוץ התא כלומר הטרנספורט אליהם הוא לא באמצעות וזיקולות.
21
Q
כיצד נוצרו האברונים בתאים יוקריוטים ?
A
לתא יש קבוצת ממברנות פנימיות שמקורן בממברנת הפלסמה של הפרוקריוט ממנו התפתח התא היוקריוטי הראשון
כך נוצר אברון שהלומן שלו זהה מבחינה טופולוגית לחוץ התא
אברונים אלה הם: ER , גולג׳י , ליזוזום , אנדוזום , פארוקסיזום
22
Q
איזה הוכחה יש לכך שהלומן של ה ER , גולג׳י , אנדוזום , ליזוזום , פארוקסיזום התפתח ממקור משותף אחד , שהוא חוץ התא ?
(כלומר שהאברונים הם שווים טופולוגיים)
A
העובדה שהאברונים הללו מתקשרים זה עם זה ועם הסביבה החוץ תאית באמצעות וזיקולות
23
Q
לכמה משפחות מרכזיות ניתן לחלק את המדורים התוך תאיים בתא יוקריוטי ?
A
לשלש משפחות , שהם בעצם שווים טופולוגיים:
- הגרעין והציטוזול: למרות שהם שונים תפקודית , התקשורת היא דרך NPCs
- מערכת ההפרשה והמערכת האנדוציטית: ER, גולג׳י, אנדוזום, ליזוזום, פארוקסיזום והוזיקולות שבינהן
- האורגנלות האנדוסימביוטיות: מיטוכונדריה ופלסטיד בצמחים
24
Q
מהו מקור התא היוקריוטי הראשון ?
A
ארכיאה שעשתה אנדוסימביוזה עם חיידק אירובי
25
ארכיאות הן ?
פרוקריוטים ,
אך אינם חיידקים
26
מה מקורם של חלבוני ה NPC ?
חלבונים שהחזיקו וייצבו את
ה protrusions and blebs של הארכיאה הקדומה שממנה התפתח התא היוקריוטי הראשון
27
Biomolecular condensate
קונדנסטים ביומולקולריים:
ארגונים דינמיים והפיכים של מאקרומולקולות שמשמשים לתא מקור לאחסון או לפעילות ביוכימית כלשהי , ולא עטופים בממברנה.
בנויים מחלבון וחומצת גרעין אחת או יותר שנקשרים ביחד באנטראקציות חלשות ודינמיות ומהווים את ה scaffolds
ה scaffold מושכים חלבונים וחומצות גרעין נוספות , clients, שנקשרות באופן ספיציפי לפיגום
ברגע שקליינט משתחרר , סביר להניח שלא יתפזר בתא , אלא יקשר למקום אחר על גבי הפיגום
כך ניתן , באמצעות מבנה הקונדנסט , לייצור אזור תוך תאי שבו ריכוז גבוה של מולקולות , מה שמעלה את הזמינות שלהן לכל מיני תהליכים תאיים
28
למה משמשים קונדנסטים ביומולקולריים ?
ניתן בעזרתם לרכז קבוצה מסויימת של חלבונים וחומצות גרעין למבנה תאי
29
מהו הקונדנסט הגדול ביותר ?
הגרעינון ,
- מורכב מיותר מ 400 חלבונים ו RNAs
- מורכב מ 3 אזורים נבדלים מורפולוגית ותפקודית
30
הגרעינון הוא הקונדנסט הגדול ביותר , כיצד הוא נוצר ?
1. מרכיב הפיגום המרכזי הוא pre-rRNA **בהתהוות**
2. בזמן שעתוקו הוא מגייס חלבוני פיגום נוספים + snoRNAs
3. שלשת המרכיבים הללו , מגייסים חלבוני פיגום נוספים + קליינטים הכוללים חלבונים ריבוזומליים, שפרונים ואנזימי מודיפיקציה
31
היכן נמצאים קונדנסטים ?
קונדנסטים מולקולריים קיימים בכל סוגי התאים (גם פרוקריוטים)
גודלם נע מ 50 ננומטר (קצת יותר מריבוזום) למיקרומטר
ביוקריוטים , יש למעלה מתריסר סוגים שונים של קונדנסטים המפוזרים גם הגרעין וגם בציטופלסמה.
32
כיצד נבדל הקונדנסט משאר מרכיבים תאיים ?
הספיציפיות של לפחות תת קבוצה של **אינטראקציות מקרומולקולריות** בתוך הקונדנסט מבטיחה שהוא יישאר נבדל בהרכבו ובתפקודו.
33
איזה קונדנסטים קיימים בתא ?
- גרעינון
- p granules in c.elegans
- pericentriole material
- GFP (photobodies)
34
האינטראקציות של הקונדנסט יכולות להיות פחות דינמיות ככל שנוספות אינטראקציות עם הזמן
כך בעצם הקונדסט עובר סוג של התמחות מסויימת ,
תכונותיו משתנות ככל שמספר האינטראקציות עולה ומבנהו מתייצב , כך הוא עובר מנוזל , לג׳ל , למוצק
לפי כך , ניתן למצוא קונדנסטים בתוך קונדנסטים שתכונותיהם שונות
35
קונדנסטים ביומולקולריים מהווים מפעלים ביוכימיים:
האינטראקציות שבין המאקרומולקולות בתוך הקונדנסט מונעת ממאקרומולקולות חיצוניות מהסביבה להצטרף אליו
נוקליאוטידים , מטבוליטים , קו פקטורים ומולקולות קטנות נוספות יכולות לעבור בדיפוזיה מהירה אל
התוצרים שנוצרים מהתגובות האנזימתיות יכולים להגיב בתגובות אנזימתיות אחרות עם אנזימים שמצויים באותו קונדנסט לפני שהתוצר מתפזר החוצה
כך תגובות אנזימטיות מתרחשות במהירות וביעילות בתוך הקונדנסט
36
קונדנסטים ביומולקולריים נוצרים ומתפרקים בתא לפי הצורך;
ניתן ליצור ולפרק קונדנסט ע״י שינוי האנטראקציות בין המאקרומולקולות באמצעות **פוספורילציה** למשל
או שינויים פיזקליים בתא כמו טמפ׳ ואוסמולריות
הרברסיביליות של הקונדנסט מנוצלת ע״י התאים לבקרה , וזה מאפשר לתא גמישות ומהירות באדפטציה לצרכים משתנים.
(שקף 50)
37
מהן גרנולות סטרס ?
Stress granules
הן דוגמה לקונדנסטים ביומולקולריים הנוצרים ומתפרקים בהתאם לצורך התא
גרנולות סטרס עשירים ב מרנא לא פעילים , פקטורי תרגום , תתי יחידות ריבוזומליות וחלבונים קושרי רנא
הם נוצרים כשהתא חווה סטרס , כמו למשל חסימה להתחלת תרגום
38
מהי חלוקת התפקידים בין מרכיבי הממברנה השונים ?
מרכיבי הממברנה הם חלבונים ושומנים :
השומנים מספקים את המחסום הפיזי לרוב המולקולות הפולריות
החלבונים עושים את כל השאר , ההערכה היא שכ 30% מהחלבונים שמקודדים בגנום של בעלי חיים הם חלבוני ממברנה
39
מהו עוביה של הממברנה הדו שכבתית ?
5 ננומטר
בסביבה מיימית היא נוצרת באופן **ספונטני** , וניתן לראות אותה במיקרוסקופ אלקטרונים
(שקף 54)
40
בתאים אנימליים , רוב המסה של הממברנה היא:
בתאים אנימליים , מולקולות ליפידים מהוות כ 50% מהמסה של רוב הממברנות.
כמעט כל השאר הוא חלבון
בתא דם אדום:
יש כ 5 מליון ליפידים במיקרון מרובע
או 700 מליון ליפידים בכל הממברנה
41
מהם רכיבי הממברנה ?
50% ממסת הממברנה היא ליפידים ,
כאשר פוספוליפידים הם הליפידים הנפוצים ביותר
הזנבות של הלפידים בבעה״ח , צמחים וחיידקים הם חומצות שומן
בד״כ אורל הזנבות נע בין 14 ל 24 פחמנים
**לרוב זנב אחד של הפוספוליפיד יהיה רווי , והזנב השני לא רווי , בצורת ציס**
42
פוספוליפידים הם הליפידים הנפוצים ביותר בממברנה של בעלי חיים ,
איזה סוג פוספוליפיד הוא הכי נפוץ ?
פוספו גליצרו ליפידים
43
מהו המבנה של פוספו גליצרו ליפיד ?
- שלד גליצרול
- שקשור בשני קשרי אסטר לשתי חומצות שומן
- הפחמן השלישי קושר קבוצת פוספט
- שקושרת בעצמה קבוצת ראש כלשהי
44
מהם הפוספוליפידים הנפוצים ביותר בתאי יונקים ?
- פוספטידיל כולין (מטען ניטרלי)
- פוספטידיל סירין (מטען שלילי)
- פוספטידיל אתנול אמין (מטען ניטרלי)
- ספינגומיילין (מטען ניטרלי)
לשים לב שהאחרון הוא ספינגוליפיד , בעוד כל השאר הם גליצרוליפידים
לשים לב למבנה החומצות (שקף 58)
45
ספינגוזין הוא ?
אמינו אלכוהול
46
מהו המבנה הכללי הספינגוליפיד ?
- על C1:
יש קבוצת OH שקושרת קבוצת ראש כלשהי
- על C2:
יש קבוצת אמין שקושרת את ח. השומן בקשר אמידי
- על C3:
יש קבוצת OH + שייר פחמימני
שקף 60
47
מהו צראמיד ?
השלד של הספנגוזין + חומצת השומן שנקשרת אליו בקשר אמידי , ללא קבוצת הראש.
48
מה זה ספינגומיאלין ?
פוספו ספינגו ליפיד ,
שהקבוצה שנקשרת אליו , על פחמן 1 , זה בעצם פוספו-כולין
ספינגומיילין הוא הספינגוליפיד הנפוץ ביותר בממברנה
49
איזה אחוז מהווים שלשת הפוספו-גליצרו-ליפידים הבאים , ממסת הממברנה בתא יונק ?
פוספטידילסירין , פוספאטידיל-אתנול-אמין , פוספאטידילכולין וספינגו מיילין
ביחד , הם מהווים יותר ממחצית מסת השומנים ברוב ממברנות התאים היונקים
50
תאר את המבנה של סטרולים:
הם בעלי מבנה טבעתי קשיח המורכב מ:
- ארבע טבעות סטרואידיות
- קבוצת OH **אחת**
- זנב פחמימני
סטרולים שונים נבדלים זה מזה בזנב הפחמימני שקשור למבנה הטבעתי
51
היכן נמצאים סטרולים ?
בממברנות של תאים יוקריוטים:
פטריות , צמחים ותאים אנימליים
52
כולסטרול:
- ליפיד מבני בממברנה של תאים אנימליים
- כ 3 ננומטר
- הכי נפוץ , קיים ביחס של 1:1 עם פוספוליפידים
- מבנה אמפיפילי (אמפיפטי).
53
במה נבדלים גליקוליפידים של צמחים וחיידקים , מגליקוליפידים בתאים אנימליים ?
- בחיידקים וצמחים השלד הוא גליצרול
- בתאים אנימליים השלד הוא ספנגוזין
54
היכן נמצאים גליקוליפידים ?
על סוגיהם השונים
על צד הממברנה שאינו פונה לציטוזול:
1. מבחינת הממברנה הפלסמטית , גליקוליפידים נמצאים אך ורק בשכבה החיצונית של הממברנה , כלומר **בעלעל החיצוני** , וזאת משום שהסוכר שלהם מתווסף בלומן הגולג׳י (למון הגולג’י הוא אקוויולנט לחוץ התא).
2. כמו כן , ניתן למצוא אותם בעלעל הלומינלי של אברונים מסוימים.
גליקוליפידים נוטים להתאסף יחד דרך אנטראקציות בין מולקולריות , ולכן ימצאו לרוב ב lipid rafts בממברנה או רפסודות , כלומר הפיזור שלהם אינו אחיד.
- מרכיבים כ 5% **מהשכבה החיצונית** של הממברנה הפלסמטית
55
מהם גנגליוזידים ?
הם סוג של **גליקו ספנגו ליפידים** ,
כלומר שומן מבני בממברנה
גנגליוזיד תמיד יכיל לפחות קבוצה אחת של חומצה סיאלית (חומצה זו היא בגדול סוכר בעל מטען שלילי ולכן מוסיף לממברנה מטען
שלילי)
יש מספר סוגים של חומצה סיאלית , בבני אדם נפוץ סוג שנקרא NANA. מלבד נוכחותה בגנגליוזיד , חומצה סיאלית גם נמצאת על גליקופרוטאינים וכן פרוטאוגליקנים, היא מתווספת אליהם ב TGN
נמצאים במערכת העצבים
56
אז כיצד קובעים איזה סוג של שומן מבני יש בממברנה ?
1. **שלד:** האם מדובר בגליצרול או ספינגוזין
2. **ראש פולרי :** האם מדובר בפוספט או סוכר
**על סוכר אין קבוצת X כמו שיש על פוספט**
**קבוצת X נקשרת לשלד בפוספוליפידים , בקשר פוספודיאסטרי**
57
כיצד נוצרת ממברנה ?
היווצרות הממברנה הינו תהליך ספונטני ,
תחילה נוצר מבנה שטוח של bilayer, מבנה זה אינו מועדף אנרגטית, ולכן הוא נסגר על עצמו, באופן ספונטני, ליצירת ממברנה.
הכוחות המניעים יצירת מבנה ממברנלי, גם כן יגרמו לתיקון קרעים בממבררנה
58
מהו ליפוזום ?
- מבנה שנוצר ע״י התארגנות של ליפידים במים
- זהו מבנה מלאכותי שמיוצר במעבדה
מכיל היקף הידרופילי , תווך הדירופובי , וליבה הידרופילית
59
מדוע ליפוזום וממברנות פנימיות לא מתאחות זו עם זו ?
הם לא נוטים להתאחות זה לזה באופן ספונטני בתוך מים כי הראשים הפולריים של הפוספוליפידים שמרכיבים אותם קושרים מולקולות מים ויונים (מהסביבה) , ושצריך להסיר אותם כדי ששני ליפוזומים יוכלו להתקרב זה לזה ולהתאחות
בתוך תאים , ממברנות טבעיות מוקפות בשכבת מים עוד יותר גדולה מליפוזומים (שבנויים רק מפוספוליפידים) הודות לנוכחות חלבונים בממברנה , וזה מונע מהממברנות בתא להתאחות באופן לא מבוקר
60
האם ממברנות בתוך התא יכולות להתאחות זו עם זו ?
כן ,
זהו **תהליך אנזימטי** , שכדי שיקרה דורש חלבוני tethering proteins שמקרבים את הממברנות זו לזו , וחלבוני איחוי fusion proteins שמאחים אותם.
61
מהם סוגי התנועה בכי נפוצים אותם מקיימים השומנים בתוך הממברנה ?
**תנועה לטרלית**: דיפוזיה **חופשית** של פוספוליפידים במישור הממברנה , תדירות של 7^10 תנועות בשניה
**תנועת flip flop**: מעבר בין שכבה לשניה , פעולה אנזימטית שדורשת אנרגיה , אינה מועדפת אנרגטית ועל כן מאד איטית, פעם אחת בכמה שעות
**רוטציה rotation:**כאשר הפוספוליפיד מסתובב סביב עצמו במקום.
**כולסטרול עושה תנועת פליפ פלופ מהירה** !!
62
Phase transition:
מתאר את תהליך הקיפאון או טמפרטורת הקיפאון של הממברנה
כלומר הטמפרטורה בה חל שינוי במצב הצבירה של הממברנה , ממצב נוזלי למצב יותר מוצק (ג׳ל) בהתאם לשינויי טמפרטורה (הורדה של הטמפרטורה).
בממברנה יש מיקס של לפידים שונים ששומרים על המבנה שלה נוזלי , גם בטמפרטורות קרובות ל phase transition , אולם מתחת לסף מסוים הממברנה מתמצקת.
ככל שהשומנים שבונים את הממברנה יהיו פחות רוויים ויותר קצרים (כלומר הממברנה יותר נוזלית) , כך הטמפרטוה שבה יתרחש phase transition תהיה נמוכה יותר , כלומר צריך לקרר יותר את הסביבה כדי שזה יתרחש.
63
ממברנות שמורכבות בלעדית מחומצות שומן רוויות יהיו יותר עבות ממברנות שמורכבות בלעדית מחומצות שומן בלתי רוויות
נכון / לא נכון ?
נכון.
(שקף 72)
64
רפסודות ממברנליות:
נקראים גם lipid rafts או lipid domains.
אלה הם למעשה דומיינים מתמחים בממברנה, בגדלים שונים , שמכילים כל מיני חלבונים ומרכיבים ממברנליים אחרים כגון כולסטרול ורצפטורים טרנס ממברנליים , מה שמקנה לאזור הזה התמחות פונקציונלית.
תפקידים בהם לוקחות הרפסודות חלק הם: טרנספורט וזיקולרי, הכוונת חלבונים לאזור מסוים בממברנה ו- העברת סיגנל **חוץ תאי** אל תוך התא
הרכבם: ** כולסטרול, ספינגוליפידים (לרבות ספינגומיילין) , גליקוליפידים, חלבונים טרנס ממברנליים ו-
,**GPI anchored proteins
האזור בממברנה בו יש רפסודה , הוא **יותר עבה** מאזורים אחרים , ומתאפיין בתנועתיות ירודה יחסית של חומצות השומן.
היווצרות הדומיין הינה זמנית , הרי הדומיין מוחזק באינטרטקציות בין מולקולריות ולא קוולנטיות
רפסודות שומניות מיוצרות ב TGN ומובאות בוזיקולה לממברנה בעזרת חלבוני caveolins
רפסודות נמצאות בצד החיצוני של ממברנת התא ולא בעלעל הציטופלסמטי
65
Tight junctions:
מייצרים סגרגציה בתוך הממברנה
מונעות מחלבונים ושומנים בעלעל החיצוני של הממברנה לעבור בין הדומיינים השונים ,
אולם ליפידים בשכבה הפנימית (הציטוזולית) של הממברנה כן מסוגלים לעבור בין הדומיינים
66
מהי הדרך בא רוב התאים היוקריוטים אוגרים שומן ?
Fat droplets
טיפות שומן
רוב התאים מכילים כמות יחסית מועטה של טיפות כאלה , תאים אדיפוציטים מכילים טיפות גדולות שתופסות את כל נפח הציטופלסמה
67
למה משמשים fat droplets בתאים ?
לייצור אבני בניין, לסנתזת ממברנה, או כמקור אנרגיה
68
מה אוגרות טיפות שומן ?
Fat droplets
אפשר להגיד שה droplet אוגר שומנים **ניטרליים** , בעיקר טריאציל גליצרול (טריגליצרידים) וכולסטרול אסתר.
ה droplet מוקף בחד שכבה של פוספוליפידים , שמכילה גם חלבונים כמו למשל חלבוני מטבוליזם של שומנים.
ה droplet יוצרת מבנה 3 מימדי ולא דו שכבה כמו הממברנה.
69
איזה חלבונים מעורבים ביצירת fat droplets
ב ER ?
- סייפין (seipin) שהוא חלבון טרנסממברנלי
- חלבון assembly factor
70
כיצד מיוצרות טיפות שומן , lipid droplets , ב ER ?
הטיפות עצמן מיוצרות בין שתי שכבות הממברנה של ה ER
עותקים רבים של החלבון סייפין seipin מייצרים מבנה טבעתי עם חלבון אחר , נקרא assembly factor סביב הטיפה בממברנה של ה ER
הטיפה גדלה כשעוד ועוד TGs וכולסטרול אסתר מיוצרים ומצטרפים אליה
בנוכחות TG סייפין מתנתק , ה assembly factor נע לעלעל הציטוזולי ומנתק את הוזיקולה שמכילה את השומן
הוזיקולה מתנתקת עם העלעל החיצוני של ממברנת ה ER אל תוך הציטוזול!
71
מה עולה בגורלן של וזיקולות המכילות טיפות שומן בתאים אדיפוציטיים ?
מתאחות ביחד ליצירת מבנה ענק , שממלא כמעט את כל הציטופלסמה
72
כיצד נשמרת האסימטריה בממברנה של תא דם אדום ?
- על ידי אנזימים , נקראים **טרנסלוקטורים של פוספוליפידים**
- אנזימים אלה דורשים אטפ , ולכן נחשבים כטרנספר אקטיבי
- **פליפאז**: מעביר , PEA/PS, מהבחוץ פנימה בעזרת אטפ
- **פלופאז**: מעביר , SM/PC מבפנים החוצה באמצעות אטפ
73
מה עושה האנזים סקרמבלאז ?
האנזים הוא ממשפחת **הטרנסלוקטורים של פוספוליפידים**
האנזים פועל בצורה **לא סלקטיבית** , אינו דורש אטפ , ויוצר סימטריה בין שני עלעלי הממברנה.
1- **ה ER** מייצר ליפידים עבור עצמו , אולם אלו מיוצרים אך ורק בעלעל הציטופלסמטי (חיצוני) של הממברנה , הסקרמבלאז גורם לערבוב של הפוספוליפידים בין שני עלעלי הממברנה , **ויוצר בינהם סמטריה**
2- **בממברנת התא:** סקרמבלאז רוב הזמן לא פעיל , ופעילותו מבוקרת מאד ומוגבלת בגדול למצבים שצריך לאותת על אפופטוזיס , ואז הוא משנה את הרכב הממברנה בזה שהוא מעביר ליפידים מסוימים , כגון פוספטידיל סרין PC מהעלעל הפנימי לחיצוני, ובכך מאותת על נזק תאי.
74
כיצד מתבצע פיזור פוספוליפידים בממברנת ה ER ?
פוספוליפידים חדשים שנוצרים ב ER מיוצרים אך ורק בעלעל החיצוני של הממברנה שלו.
הסקרמבלאז לאחר מכן מפזר אותם בצורה סימטרית בין שני העלעלים
האנזים מייצר סביבה הידרופילית עבור הראש הפולרי שמאפשר לו לחצות את התווך ההידרופובי
75
בממברנת ה ER פיזור הפוספוליפידים הינו סימטרי
נכון / לא נכון ?
נכון ,
הודות לפעילות סקרמבלאז
(וזה בניגוד לממברנת התא, הגולג’י ווזיקולות שאינן סימטריות).
76
הממברנות של הגולג׳י , וזיקולות , וממברנת התא אינן סימטריות , מדוע ?
הודות לפעילות של טרנסלוקטורים של פוספוליפידים , פליפאז ופלופאז שמעבירים פוספוליפידים בין שני העלעלים באופן לא סמטרי
77
מהו הסובסטרט של האנזים פליפאז ?
קבוצת הראש הפולארית של הפוספוליפיד
78
כיצד האסימטריה של הממברנה מסייעת באפפטוזיס ?
כאשר תא מיועד לעבור אפפטוזיס , פוספטידיל סרין , PS , עובר אל העלעל החיצוני ומסמן את התא לפגוציטוזה
79
כיצב מיוצר פוספוליפיד ב ER ?
כמעט כל הליפידים של התא מיוצרים בממברנה של ה ER, כולל פוספוליפידים וכולסטרול
1. ח.שומן מגיעה מהציטוזול , ע״י חלבון ציטוזולי שנקרא fatty acid binding protein ונכנסת **לעלעל החיצוני** ב ER
2. אל חומצת השומן נקשרת מולקולת CoA ע״י האנזים acyl coA ligade
2. שתי חומצות כאלה שעל כל אחת יש מולק CoA נקשרות יחדיו דרך שלד של גליצרול 3 פוספט ע״י האנזים acyl transferase ליצירת **חומצה פוספטידית** , בתהליך נפלטות שתי מולקולות CoA
3. חומצה פוספטידית היא הפריקורסור ליצירת פוספוליפידים שונים
שקף 85
80
בממברנה של ה ER , כיצד נוצרת חומצה פוספטידית ?
דרך קשירת שתי חומצות שומן לגליצרול 3 פוספט ע״י האנזים אציל טרנספרז
(Acyl transferase)
81
מהו היחס בין חלבונים לשומנים בממברנה טיפוסית ?
בממברנה טיפוסית , לחלבונים ושומנים אותו יחס מבחינת **מסה** , 50% ממסת הממברנה היא חלבונים ו- 50% אחוז שומנים… אבל !!!
**בגלל ששומנים יותר קטנים מחלבונים , מספרית יש יותר שומנים , בפועל כ 50 ליפידים על כל חלבון**
82
האם מבנה הממברנה שווה בין כל האברונים ?
לא !!
הממברנה עוברת התמחות לפי סוג האברון
- מיילין שאינו פעיל מטבולית רק 25% ממסת הממברנה הם חלבונים
- מיטוכונדריה שפעילה מטבולית , 75% ממסת הממברנה הם חלבונים
83
כיצד חלבונים אינטגרליים / טרנס ממברנליים מעוגנים בממברנה ?
1. דרך אינטראקציות בין החלקים ההידרופוביים שבחלבון , אלא שחוצים את הממברנה , לבין הזנבות של הפוספוליפידים
2. **בצד הציטוזולי !!! ורק בצד הציטוזולי** , חלבונים יכולים להיות מעוגנים לממברנה דרך חיבור לליפידים ממברנליים
שקף 90
84
החלבון גליקוזיל טרנספראז בגולג׳י וחלבוני SNARE הם?
דוגמה לחלבונים טרנס ממברנליים , שהמסה העיקרית שלהם נמצאת מחוץ לממברנה
(שקף 91)
85
חלבונים שממוקמים במלואם בציטוזול:
שני סוגים:
החלבון קשור לממברנה דרך **סליל אלפא אמפיפילי** (בניגוד לחלבונים טרנסממברנליים שהאלפא הוא הידרופובי)
עיגון דרך עוגן לפידי ( חומצת שומן או prenyl) , שקשור קוולנטית לחלבון !!
שקף 92
86
כמה סוגי חלבונים ממברנליים אנחנו מכירים ?
4
1. חלבונים אינטגרליים או טרנסממברנליים
2. חלבונים שממוקמים במלואם בציטוזול
3. חלבונים שחשופים לחלוטין על פני שטח התא
4. חלבונים פרפריאליים
87
כיצד חלבונים שחשופים לחלוטין על פני שטח התא קשורים לממברנה ?
דרך קישור קוולנטי לאוליגוסכריד ספיציפי שהוא מחובר לעוגן לפידי בממברנה !
חלבונים אלו נוצרים ב ER כחלבונים טרנסממברנליים , לאחר מכן החלק הטרנסממברנלי נחתך , ובמקומו מתווסף GPI, ואז מועבר בוזיקולה לממברנת היעד.
חלבון - אוליגוסכריד - ליפיד
שקף 92
88
איזה סוגי עוגנים ליפידיים קיימים , שמעגנים חלבונים שחשופים לחלוטין על פני שטח התא לממברנת התא ?
- myristoyl
- palmitoyl
- farensyl
- prenyl
**לשים לב לסיומת yl**
מיריסיטול ,פלמיטול , פרנסיל , פריניל
89
בחלבונים טרנסממברנליים / אינטגרליים , החלק שחוצה את הממברנה , יהיה לרוב בצורת סליל אלפא
בעצם שיירי הצד של ח״א שמרכיבות את האזור החוצה יהיו הידרופוביות , ויקיימו אינטראקציות עם הזנבות , אולם הקשר הפפטידי בעצמו הוא פולרי , אז מה עושים ?
אז הקשרים הפפטידיים (חמצן קרבונילי עם מימין אמיני) מייצרים קשרי מימן עם עצמם וכך הם מיוצבים בתוך הסביביה ההידרופובית ,
דרך סלילי אלפא הם מצליחים לייצר 100% מפוטנציאל קשרי המימן שלהם , וכך הם יכולים לשהות בתוך תווך הידרופובי , ולכן סליל אלפא יותר יציב !
דרך נוספת למקסם את קשרי המימן בשלד הפפטידי היא בעזרת בטא sheets וזוהי בעצם הצורה היחידה שגדילי בטא יכולים להימצא בממברנה , ולכן סלילי אלפה יותר נפוצים כי יש להם יותר אפשריות מבניות לשהות בתוך הממברנה.
90
מה מתארת עקומת הידרופתיות ?
- כמה פעמים חלבון חוצה את הממברנה
- פיקים על ציר ה y מלמדים שהאזור הזה הוא הידרופובי , ועל כן חוצה את הממברנה ,
כמו כן , החלק החיובי משמעו שנדרשה השקעת אנרגיית חופשית כדי שהחלבון יעבור לסביבה מימית (מה שמלמד על ההדרופוביות שלו) .
- האזורים השליליים הם הידרופיליים , ונפלטת אנרגיה חופשית כשהם חוצים את הממברנה
- כמספר הפיקים , מספר הפעמים שהחלבון חוצה את הממברנה
91
האם ניתן לזהות חביות בטא בעקומת הידרופתיות ?
לא !!
רק סלילי אלפא !
92
מה ניתן ללמוד מעקומת הידרופתיות ?
- מספר הפעמים שחלבון חוצה את הממברנה
- לפי העקומות אנו למדים כי הסגמנטים ההידרופוביים של סליל אלפא מכילים בין 20-30 ח״א
- לפי העקומות , ההערכה היא שכ 30% מכלל החלבונים של האורגניזם הם חלבונים טרנסממברנליים
93
מדוע סלילי אלפא יותר נפוצים בממברנה מאשר חביות בטא ?
סלילי אלפא מצליחים לייצב אחד את השני בתוך הממברנה (שקף 98)
הם יכולים להתארגן בממברנה במספר צורות, וזה נותן להם טווח תפקידים רחב כגון תעלות ואתרי קישור, חביות בטא יכולים להתארגן אך ורק בצורת צילינדר
**הסתייגות**: חביות בטא נפוצות בממברנות החיצוניות של חייקדים , מיטוכונדריה , וכלורופלסט.
94
חלבוני בטא בבמברנה ?
יכולים להתארגן בצורת צילינדר בלבד, כי זוהי הצורה היחידה בה יש מקסום של קשרי המימן
שכיחים מאד בממברנה החיצונית של חיידקים , מיטוכונדריה וכלורופלסט
חלקם יוצרים פורות , ערוצים מלאי מים למעבר סלקטיבי של מולקולות קטנות והידרופיליות
95
מה הם החלבונים fepA , OmpA ו- OMPLA ?
הם חלבונים טרנסממברנליים שנמצאים על איקולי ,
בממברנה החיצונית ,
אומפה: רצפטור לוירוסים
אומפלה: אנזים ליפאז
פיפא: טרנספורטר לברזל
שלשתם בעלי צורת חבית בטא !
96
חביות בטא בממברנה:
- הם יוצרים מבנים קשיחים ויציבים
- ניתן לזהות אותם דרך קריסטלוגרפיית רנטגן (ולא עקומת הידרופתיות)
- כל חבית מורכבת מ 8-22 משטחים
**חשוב לזכור שרוב החלבונים בתאים יוקריוטים ופרוקריוטים שחוצים את הממברנה בנויים מסלילי אלפא**
97
היכן מתרחשת גליקוזילציה של חלבונים ?
בלומן של ה ER ובגולג׳י
98
רוב החלבונים הציטוזוליים בבעלי חיים עוברים גליקוזילציה:
נכון / לא נכון ?
לא נכון,
רוב החלבונים הטרנסממברנליים בבעלי חיים עוברים גליקוזילציה
99
חלבונים טרנסממברנליים בבעלי חיים עוברים גליקוזילציה , לאיזה צד תפנה השרשרת האוליגוסכרידית ?
״בדומה לגליקוליפידים, גם בחלבונים טרנסממברנליים שיירי הסוכר מתווספים בלומן של ה ER והגולג׳י , **ולכן השרשרת האוליגוסכרידית תמיד!!! תמצא בצד הלא ציטוזולי (כלומר בחיצוני) של הממברנה הפלסמטית**
100
בחלבונים טרנס ממברנליים , באיזה צד נמצא קשרים תיולים דיסולפידיים , SS ?
בצד הפונה מחוץ לתא ,
בתוך התא יש סביבה מחזרת (הודות לנוכחות צורונים מחזרים שמוסרים אלקטרונים כגון גלוטטיון) ולכן נמצא קשרי SH על חלבונים בצד הציטוזולי , מחוץ לתא , מאידך , יש תנאים מחמצנים , ולכן נמצא גשרי SS תיולים שמייצבים את המבנה המקופל של החלבון
101
סססססססוכר:
1. גשרים SS נמצאים בצד החיצוני של חלבונים טרנסממברנליים
2. גליקוזילציות יפנו תמיד לצד החיצוני (לומן של ER וגולג׳י)
3. שכבת גליקוקליקס נמצאת על הצד החיצוני של הממברנות
שכבת ה glycocalyx מספקת הגנה מכנית וכימית ומונעת אינטראקציות לא רצויות בין התאים
102
מה זה glycocalyx ?
- מעטפת סוכרית **אינטגרלית** על פני שטח התא, מחוברת לממברנה דרך קישור לחלבונים ולפידים ממברנליים.
- משתנה בגודלה והרכבה בין סוגי תאים שונים
- למרות שמשתנה בין סוגי התאים , המשותף זה שהיא בעלת מבנה מסועף
- נצבעת ע״י ruthenium red
- אתר קישור ללקטינים (חלבונים קושרי סוכר)
- תפקידה העיקרי והחשוב ביותר זה לספק הגנה כימית ומכנית לתא
- מהווה סוג של תעודת זהות עבור התא
103
מה זה דטרגנטים ?
חומרים אמפיפטיים , שיש להם צד הידרופילי וצד הידרופובי
מפריעים לאנטראקציות **הידרופוביות** , ולכן הורסים מבנה של ממברנה והופכים את החלבונים הממברנליים למסיסים
יותר מסיסים במים מאשר בשומן
דטרגנט מקיף את החלבון ההידרופובי והופך אותו למסיס
דטרגנטים יוניים יותר חזקים מדטרגנטים לא יוניים
104
כמה סוגי דטרגנטים יש ?
2
יוניים כגון (SDS)
לא יוניים כגון
- triton x-100
- b-octylglucoside
105
מהו הריכוז הקריטי של המיצלה,
Critical micelle concentration - CMC
?
זהו ריכוז מולקולות הדטרגנט בתמיסה , שמתחתיו הדטרגנט קיים כמונומר , ומעליו הוא מתחיל לייצר מיצלות.
מעל ה CMC **ריכוז המונומר נשאר קבוע** , כי הוא נמצא בשיווי משקל עם המיצלה , כלומר מולקולות שלו נכנסות ויוצאות ממנה בדיפוזיה חופשית .
שקף 107
106
המבנה של מיצלה שנוצרת מדטרגנט הוא אינו רגיל :
ולכן חלקים הידרופוביים נשארים חשופים , חלקית , לסביבה המימית
שקף 106
107
SDS:
דטרגנט יוני חזק
ככלל , דטרגנטים נקשרים לאזורים ההידרופוביים של חלבונים וממסכים אותם , כל שהם יכולים לשהות בסביבה מימית
**דטרגנטים חזקים** , הורסים את מבנה החלבון - עושים דנטורציה- שבחלק מהמקרים הפיכה ובחלק לא , ולכן כל עוד הם קשורים לחלבון , החלבון אינו פעיל
108
דטרגנטים חלשים:
דטרגנטים חלשים אינם מובילים לשינוי בקיפול החלבון , כלומר לא עושים דנטורציה , ולכן ניתן בעזרתם לבודד חלבונים בצורתם הפעילה
הם גם מבודדים פוספוליפידים מהממברנה 😅
109
מה הם גופי קחאל (cajal) ו- speckles ?
גופים גרעיניים
110
מהו גודלו של הגרעינון ?
- גודלו משתנה בתאים שונים , ויכול להשתנות באותו התא , לפי צורכי התא
- בתאים פעילים , שמייצרים הרבה חלבונים (ועל כן צורך רב בריבוזומים) , נפחו יכול להוות 25% מנפח הגרעין!
111
רוב מולקולות הרנא בתא הם ?
מולקולות rRNA שמהוות עד כ 80% מסך כל מולקולות הרנא בתא
מנגד, mRNA הם רק 3% עד 5%
112
בגרעין יש המון חלבונים ורנא מלבד הדנא , מה הם ?
מולק׳ small nuclear RNA - snRNA: מולקולת רנא שנמצאת בגרעין ומכוונת את תהליך השחבור
מולק׳ small nucleolar RNA- snoRNA: מולקולת רנא שנמצאת בגרעינון ומשתתפת בעיבוד rRNA
מולק׳ snRNP היא מולק׳ snRNA עם לפחות 7 תת יחידות של חלבונים , מרכיבה את הספלייסוזום למשל:
U1/U2/U4/U5/U6
**מולק׳ snoRNP:** מולק׳ snoRNA שקושרת חלבונים בגרעינון
113
גופפי קחאל , ו speckles הם דוגמאות לגופפים גרעיניים , מה תפקידם ?
**גופפי קחאל**: אתרים שבהם snRNP ו snoRNP עוברים את שלבי המטורציה הסופיים שלהם , כמו כן בהם מתרחש מחזור של ה snRNPs אחרי כל מיזור של שחבור.
**צברי גרנולות של אינטרכרומטין:** שנקראים גם speckles , הם אזורים בהם יש מאגרים של snRNPs בוגרים לחלוטין , שחלק מתפקידם זה עיבוד רנא ויצירה של mRNA
114
מה תפקידם של גופפים גרעיניים ?
גופפים גרעיניים הם מבנים שנמצאים בגרעין מלבד הגרעינון ,
הם חסרי ממברנה , ודינמיים מאד , כלומר נוצרים ונבנים מחדש לפי מחזור התא ותנאים סביבתיים (בתוך התא)
מורכבים מחלבונים ומולקולות רנא ויש להם תפקיד בסינתזה , התארגנות ואחסון של מאקרומולקולות הקשורות בביטוי גנים
בעלי אפקט קטן מאד על חיות התא מלבד בשלבים התפתחותיים קריטיים בהם הם נחוצים מאד, כעיקרון תפקידם זה לייצר ״מפעלים כימיים״ בהם מרכיבים תאיים נמצאים בסמיכות , כך שההרכבה שלהם תהיה יותר יעילה
למשל הרכבת ה snRNP מסוג U4/U6 תקרא פי 10 יותר מהר בגופםי קחאל מאשר אם המרכיבים היו מפוזרים בגרעין
115
תאר את הלמינה הגרעינית :
רשת חלבונית (למינים) , המספקת תמיכה מבנית לממברנת הגרעין , מהווה סוג של שלד גרעיני (מקביל לציטוסקליטון בציטופלסמה) , ואתר עיגון עבור כרומוזומים
הלמינה מחוברת לשלד התא , דרך קומפלקסים חלבוניים טרנסממברנליים שחוצים את מעטפת הגרעין , ומהווה קישור סטרוקטורלי בין הדנא , מעטפת הגרעין , ושלד התא
היא מחוברת גם ל NPC
116
תאר את מבנה ממברנת הגרעין:
ממברנה כפולה דו שכבתית , כאשר שתי השכבות המשכיות זו לזו
**ממברנה חיצונית** , המשכית עם ה ER ולכן ניתן למצוא עליה ריבוזומים גם כן
**ממברנה פנימית** , מכילה חלבונים הפועלים כאתרי קישור לכרומוזומים וללמינה (מטריקס הגרעיני)
בינהם חלל perinuclear space שהמשכי ללומן של ה ER
למרות ששתי הממברנות המשכיות זו לזו כאמור , (מתחברות ב NPC) הן מכילות הרכב חלבונים שונה
117
החלבונים kash ו- SUN ?
חלבונים שמקשרים בין הציטוסקליטון לבין פנים הגרעין , בכך הם שומרים על הגרעין יציב בתוך התא.
ה SUN שוכן בממברנה הפנימית של הגרעין וקושר את הלמינה / כרומוזומים
ה KASH נמצא בממברנה החיצונית וקושר את שלד התא
ביחד הם מייצרים גשר ב space הבין ממברנלי (פרינוקליארי)
וככה נוצר צימוד מכני בין הגרעין לשלד התא
הקישור הזה משרת תפקידים כמו תנועת כרומוזומים בזמן מיוזה , מיקום הגרעין וצנטרומרים וכו
שקף 121
118
כיצד קושר החלבון kash את שלד התא ?
הוא נקשר ישירות לסיבי אקטין ,
ובאופן לא ישיר למיקרוטובולים וסיבי ביניים
119
טרנספורט דרך הגרעין -
Nuclear transport
תהליך דו כיווני (שיכול להתרחש לשני הכיוונים בו״ז) , ומבוקר
חלבונים כגון הסטונים ופולימראזות מיוצרים בציטוזול ומיובאים באופן סלקטיבי לגרעין
מרבית מולקולות הרנא מיוצרים בגרעין ומיוצאים לציטוזול , למשל mRNA לא מיוצא לציטוזול אלא אחרי שהוא עבר עיבוד
חלבונים ריבוזומליים מיוצרים בציטוזול , מיובאים לגרעין , מתרכבים עם rRNA ומיוצאים שוב לציטוזול
120
האם המעבר דרך NPC הוא מעבר אקטיבי או פסיבי ?
תלוי בגודל המולקולה ,
מולקולות השוקלות פחות מ 40KD ובגודל של פחות מ 5nm יעברו באופן פסיבי
מולקולות גדולות יותר , יעברו באופן אקטיבי
מולקולות קטנות , פחות מ 5KD יעברו בדיפוזיה מהירה - ניתן עבור מולק כאלה להתייחס לממברנה כאילו היא חדירה
121
טרנספורט דרך NPC:
חלבוני NPC קיימים בכל התאים היוקריוטים
חסר מנגנון gating , כלומר תמיד פתוח
המעבר הוא דו כיווני
חלבונים שהתקפלו למבנה הסופי שלהם , ומולטי חלבונים יכולים לעבור דרכה
122
כיצד שונה טרנספורט אל ה ER , מיטוכונדריה , פלסטיד מהטרנספורט דרך ה NPC ?
בזה שאל שאר (רוב) האברונים מלבד הגריעין , הטרנספורט מערב מנגנון gating
הוא חד כיווני
**ודורש שהחלבון המועבר יהיה לא מקופל**
זאת אומרת רק אל תוך הגרעין נכנסים חלבונים שהם already מקופלים.
123
טרנספורט גרעיני אקטיבי:
ה cargo הוא החלבון אותו צריך להכניס / להוציא , מכיל את רצף הסיגנל NLS או NES
ה shuttle הוא רצפטור מסיס שיודע לקשור חלבון cargo , יש import receptor שמכניס לגרעין ויש export receptor שמוציא מהגרעין
חלבון נמל , הוא הוא RAN-GTPase , שיכול לקשור או גטפ או גדפ
124
תאר את מעגל הטרנספורט הגרעיני האקטיבי:
1. חלבון רצפטור מזהה רצף NLS על חלבון cargo בציטוזול וקושר אותו
2. ביחד הם נכנסים לגרעין , שם RanGTP נקשר לרצפטור, משחרר את ה cargo, וביחד הם יוצאים לציטוזול
3. בציטוזול GAP ממיר RanGTP ל RanGDP ומשחרר אותו מהרצפטור, שכעת פנוי לסבב נוסף
4. ה RanGDP חוזר לגרעין , שם GEF מדליק אותו חזרה ל RanGTP
125
כיצד עובד מעגל טרנספורט אקטיבי דרך הגרעין ?
דרך ריכוזי RanGTP לעומת ריכוז RanDGDP:
בעצם ריכוז RanGTP גבוה בגרעין (הודות ל GEF) ונמוך בציטוזול (הודות ל GAP) ולכן הוא יוצא מהגרעין לציטוזול עם הרצפטור
ריכוז RanGDP גבוה בציטוזול ונמוך בגרעין , כשהוא קושר גדפ Ran משחרר את חלבון הרצפטור ונכנס פנימה אל הגרעין. כניסת RanGDP אל הגרעין מתבצעת דרך רצפטור ייחודי שמייצר אינטראקציות עם רצפי FG ב NPC (מבנה רצפטור זה דומה לרצפטור הנוקליארי -שאטל)
126
מהו רצף NLS ?
רצף שמאותת למערכת התאית להכניס חלבונים מהציטוזול לגרעין ,
חלבון יכול להכיל רצף אחד או שני רצפים קצרים שעשירים ב ליזין K וארגינין R, ועל כן הוא רצף חיובי
המיקום שלו על החלבון משתנה , ודי חסר חשיבות
מספיק שעל קומפלקס ענק חלבון אחד יכיל NLS כדי שכל הקומפלקס יוכנס לגרעין
הרצף המדוייק של NLS משתנה מחלבון לחלבון , ומזוהה על ידי רצפטור אחר
KR = cargo (import)
127
רצף NES:
רצף הוצאה מהגרעין ,
עשיר בליאוצין
ליאוצין = להוציא
128
חלבון ה shuttle ,
או בשמו האחר nuclear impoet receptor דורש לעיתים אדפטור , תאר את האדפטור:
האדפטור יודע בעצמו לזהות את רצף NLS שעל ה cargo , והוא בעצמו מכיל רצף NLS שהרצפטור הנוקליארי יודע לזהות ולקשור.
האדפטור נקשר ל NLS שעל ה cargo וזה גורם לחשיפת ה NLS שלו עצמו , כעת הרצפטור קושר את האדפטור וביחד עם ה cargo נכנסים לגרעין
129
חלבוני NPC יוצרים תעלה , מהן תכונותיה של תעלה זו ?
ה NPC היא בעצם תעלה המורכבת מחלבונים , האזורים הלא מאורגנים בחלבון הם אלא שיוצרים את ״חלל״ התעלה
אזורים אלה עשירים בחזרות הידרופוביות קצרות של F פנילאלנין + G גליצין
חזרות FG יוצרות אינטראקציות חלשות זו עם זו, כך שבתווך של ה NPC נוצר מטריקס דמוי ג’ל שמהווה מסננת עבור מולקולות גדולות , שלא מאפשר להם לעבור.
130
כיצד נכנס הרצפטור nuclear import receptor אל הגרעין ?
דרך אינטראקציות עם חזרות FG
על הרצפטור אתרי קשירה רבים עבור FG ,
בעזרתם הוא נקשר תחילה ל FG הכי חיצוניים שפונים לציטוזול , מתנתק מהם ומתקדם בכיוון הרצפים היותר פנימיים , נקשר ומתנתק וכן הלאה עד שהוא נכנס לגרעין
האפיניות בין רצפי FG לאתרי הקישור על הרצפטור נמוכה , מה שמאפשר את מחזורי הניתוק-חיבור
בכל פעם שהרצפטור נקשר ל FG הוא מתיך מקומית את הקשרים בינהם וכך הוא מתקדם
שקף 131
131
היכן נמצא פקטור GEF ?
בגרעין , קשור לכרומטין
132
חלבון GAP נמצא ב ?
ציטוזול ,
קשור לשלד התא
133
Ran:
חלבון ציטוזולי מסיס ,
מונומרי ,
הוא למעשה GTPase
134
Nuclear import vs nuclear export:
המעגל קשור באקסקלוסיביות הקשר שבין ה cargo ל RanGTP
ב import, נוצר קשר בין RanGTP והקומפלקס receptor-cargo בגרעין , מה שגורם ל cargo להשתחרר בגרעין, ולרצפטור + RanGTP לצאת החוצה יחדיו
ב , export, נוצר תהליך הפוך , קישור הרצפטור ל RanGTP דווקא גורם לרצפטור לקשור את ה cargo , ואז שלשתם יוצאים לציטוזול , שם יש המרה ל RanGDP, ודווקא פה ה cargo מתנתק (וגם RanGDP)
שקף 135
135
חלבוני nuclear import + nuclear export שייכים לאותה משפחה , איך קוראים למשפחה זו ?
קריופרינים ,
Karyopherins
136
במיקרוסקופ אור , כמה **סוגי** עדשות יש ?
יש שני סוגים :
סוג אחד - עשדת condenser , שממקדת את האור **בדגימה**
סוג שני -
עדשות
objective lense,
tube lense,
eyepiece lense
**שממקדות את האור בעיניי המתבונן**
137
מיקרוסקופ אור מוגבל לאורכי גל בתחום הנראה , מהם אורכי גל אלה ?
סגול - 400 ננומטר
אדום - 700 ננומטר
138
מהו כושר ההפרדה המקסימלי שניתן להגיע אליו דרך מיקרוסקופ אור ?
תאורטית ,
200 ננומטר
(0.2 מיקרון)
תחת תנאים אופטימליים ( אורך גל סגול 400 מנומטר ) + ו NA של 1.4
139
מהו גבול הרזולוציה ?
גבול ההפרדה שבו שני אובייקטים נראים מובחנים זה מזה , למעשה רזולוציה היא יחידת מרחק בין 2 נקודות.
140
Calcineurin :
פוספטאז ,
מוריד זרחן מפקטור השעתוק NF-AT בציטוזול של תאי T במערכת החיסון ,
ועקב כך גורם לשפעול שלהם
141
האנזים CDK
Cyclin dependent kinase
זהו אנזים ממשפחת הקינאז , יש מספר סוגים שלו , חלק מהם עוברים אקטיבציה בתחילת המיטוזה ומפרקים את הלמינה הגרעינית.
האנזים מזרחן נוקליאופורינים (NPC) , למינים וחלבונים של **הממברנה הפנימית** בגרעין ובכך מפריע לאינטראקציות שלהם עם הכרומטין,
ובכך הוא גורם לפירוק הלאמינה הגרעינית , NPC , ממברנת הגרעין במהלך המיטוזה
אחרי הפרדת הכרומוזומים , cdk עובר אינאקטיבציה , מה שמאפשר דה פוספורילציה של הנוקליאופורינים , הלאמינים וחלבוני ממברנת הגרעין , ולבסוף ל reassembly של מעטפת הגרעין
142
בזמן התפרקות הגרעין במיטוזה , מה קורה לחלבונים גרעיניים **שאינם קשורים למעטפת הגרעין או לכרומוזום** ?
מתערבבים לחלוטין עם החלבונים מהציטוזול
143
האם בכל היוקריוטים הגרעין מתפרק בזמן מיטוזה ?
לא , בשמרים הוא נשאר שלם ,
ומתחלק בין שני תאי בת דרך fission
144
מה עולה בגורלו של החלבון Ran בזמן מיטוזה ?
גם אחרי שמעטפת הגרעין נשברת , RanGEF נשאר קשור לכרומטין , מה שאומר שסביב הכרומטין יש המון RanGTP , ענן של RanGTP , שהוא חשוב ליצירת הכישור המיטוטי
וביצירה מחדש של מעטפת הגרעין
145
גודלו של תא אנימלי טיפוסי ?
10 - 20 מיקרון
146
NA -
Numerical aperture
ה NA משפיע על יכולת העדשה לאסוף את האור (לפקס אותו) ,
הוא מכפלה של זווית האור שנכנס לעדשה ו התווך הרפרקטיבי של העדשה
במיקרוסקופ אור , שתי העדשות שקובעות איזה NA יהיה למיקרוסקופ הם עדשת העצם (objective lense) ועדשת ה צמצמ (condenser lens)
שקף 135
147
כיצד נקבל את הרזולוציה הטובה ביותר במיקרוסקופ אור ?
אורך הגל הקטן ביותר (סגול 0.4 מיקרומטר) + ה NA הגדול ביותר יתן את הרזולוציה הטובה ביותר
148
לפי איזה עדשות נקבעת הרזולוציה במיקרוסקופ אור ?
Condenser
Objective
149
כיצד פועלים המיקרוסקופים השונים ?
**מיקרוסקופ אור רגיל , נקרא גם bright field:**
במיקרוסקופ זה **התא מת** , כי אנחנו חותכים אותו ומקבעים אותו לצלחת.
מכתימים את הדגימה שחתכנו ומאירים עליה באור נראה, הצבע סופג חלק מגלי האור ומעביר חלק , האור יהיה חזק יותר (לבן יותר) ככל שיש פחות צבע , וכך אנחנו רואים את הדגימה צבועה על רקע לבן (כי אינו מכיל תאים צבועים)
(שקפים 156 ו 158)
**מיקרוסקופ dark field:**
**התאים חיים** , ואינם דורשים הכתמה.
מאירים על הדגימה אור בזווית אלכסונית , כשהאור פוגע בדגימה חלק מקרני האור נשברים ונקלטים בעדשה, קרני אור שלא נשברו לא נקלטים בעדשה , כך נוצרת תמונה בהירה (איפה שהאור נשבר) על רקע שחור (שקף 157)
**מיקרוסקופ phase contrast**:
התא חי , ואפשר לראות אותו בתלת מימד
בחלקים שונים של התא יש אינדקס רפרקציה שונה , בגלל שבתא יש חלקים עבים יותר (גרעין) וחלקים עבים פחות , קרן האור שעוברת דרך הדגימה תישבר באופן שאינו אחיד. אזורים עבים או צפופים ישברו את האור יותר , ואזורים דקים ישברו פחות , וכך אזורים עבים ייראו כהים יותר (שקף 159)
150
מיקרוסקופים אופטיים שעובדים עם אור :
DIC - הדגימה חיה
dark field - הדגימה חיה
Phase contrast - הדגימה חיה
Light field - הדגימה מתה
במיקרוסקופ dark אנחנו יכולים לראות את מבנה התא ואת תנועתו , אבל לא יכולים לראות מרכיבים פנימיים שלו
151
איזה אורך גל יש לאור שנפלט מהדגימה , במיקרוסקופ פלורסנטי , יחסית לאורך הגל של האור שנקלט ?
אורל הגל הנפלט , גדול יותר מזה של הגל הנקלט , וזה מה שמאפשר למראה להעביר אותו דרכה ולא לשבור אותו
(שקף 163)
152
כמה פילטרים יש במיקרוסקופ פלורסנטי ?
שני פילטרים ,
אחד לפני הדגימה ואחד אחריה!
הפילטר שלפני הדגימה מסנן את כל אורכי הגל ומעביר רק כאלה שיעוררו את הדגימה.
הפילטר שאחרי הדגימה מעביר רק את אורכי הגל שנפלטים מהדגימה הפלורסנטית.
153
כיצד משמש אותנו מיקרוסקופ פלורסנטי ?
מיקרוסקופ פלורסנטי משמש אותנו לרוב כדי לזהות חלבונים או מולקולות **ספיציפיות** בתאים וברקמות **חיות** ,
זאת עושים דרך שימוש בגלאים נוקליאוטידים פלורסנטיים ב שיטה שנקראת
In situ hybridization
בעצם אנחנו מכוונים את הגלאים הנוקליאוטידים למולקולה מסויימת שאנחנו רוצים לדעת איפה היא נמצאת , באיזה רקמות וכו , דרך היברידיזציה הגלאי מתחבר למולקולה הזאת ואנחנו יכול לעקוב אחריה.
שיטה נפוצה לעשות in situ hybridization היא לחבר צבעים פלורסנטיים לנוגדנים , שאז הנוגדנים מתחברים לתא המטרה.
ניתן להשתנש בשני נוגדנים , שמתחברים לשתי מולקולות שונות , וכך לעשות השוואה בפיזור של שתי המולקולות
בשיטה זו אנחנו רואים תאים חיים.
154
סמנים פלורסנטיים נפוצים בשימוש :
רודמין - rhodamine: מקרינים אור ירוק - צהוב
ומקבלים אדום 🟡🟢 = 🔴
פלואורוסין: מקרינים כחול , מקבלים ירוק
הסמן DAPI: סמן נוקליאוטידי שקושר אזורים עשירים ב AT , מקרינים UV מחזיר כחול
155
Galactocerebroside:
הוא **גליקוליפיד** ממברנלי בעל מטען ניטרלי ,
כי קבוצת הסוכר שהוא מכיל איננה טעונה
שקף 62
156
מלבד תנועה לטרלית , flip flop (פליפ פלופ) , ורוטציה , יש תנועות נוספות בממברנה:
ויברציה , התבלטות של פוספוליפידים (protrusion) , תנועת מתיחה (flexion) ותנועת כיפוף.
תנועות אחה פחות נפוצות משלשת העיקריות
157
הפלואידיות של הממברנה תלויה ב:
ההרכב שלה:
חומצות שומן בלתי רוויות , ובעלות זנבות קצרים גורמים לממברנה להיות יותר פלואידית.
הטמפרטורה של הסביבה:
ככל שהטמפ׳ עולה , הממברנה תהיה יותר פלואידית
158
כולסטרול משפיע על הפלואידיות של הממברנה:
הכולסטרול הוא בעל מבנה אמפיפטי ,
החלק הפולרי שלו נדחק בין הראשים הפוספוליפידיים , בעוד החלק הסטרואידי הטבעתי וההדרופובי , נקשר לזנבות , קישור זה מפחית את המוביליות שלהם וכתוצאה מכל ומקשיח את מבנה הממברנה.
מסתבר שבאזור שיש בו גם הפחתה בתנועתיות של זנבות הממברנה , כתוצאה מקישור הכולסטרול , יש גם הפחתה בחדירות שלה למולקולות מסיסות במים - כי המבנה פחות ניתן לשינויים
מנגד , נוכחות הכולסטרול מפרה את הסדר של הזנבות , ומונעת מהם להתקרב מדי זה לזה , וכך נמנעת היווצרות קשרי ון דר ולס ביתר שאת , מה שמונע התמצקות יתרה של הממברנה !
לסיכום:
כשהטמפרטורה גבוהה מאד , כולסטרול מונע התנזלות של הממברנה
כשהטמפרטורה נמוכה מדי , הכולסטרול מונע קיפאון של הממברנה
159
דומיינים ממברנליים:
הסברה הייתה שהשומנים המבניים בממברנה יתפזרו בה באופן אחיד ורנדומלי , כי קשרי וו דר ולס שמחזיקים אותם ביחד אינם סלקטיביים מספיק כדי להחזיק קבוצות של פוספוליפידים יחד
בפועל , נמצא שכאשר מוסיפים ליפידים מסויימים בממברנה מלאכותית , ניתן לתפות בהתאחדות של ליפידים ספיציפיים בדומיינים נפרדים , ולא בפיזור אחיד ואקראי שלהם
לפי תצפית זו , אנו רואים שיש מעבר מפאזה פחות מסודרת לפאזה יותר מסודרת (נוגד תרמודינמיקה)
שקף 78:
הוספת 1:1 PC ו- SM יוצר ממברנה אחידה
הוספת 1:1:1 SM , PC וכולסטרול יוצרת דומיינים ממברנליים
שאלה 22 ביותא 1
160
פוספטידיל סרין תורם למטען השלילי בעלעל הפנימי של הממברנה:
על סרין יש מטען שלילי , עצם זה שהפוספוליפיד הזה טעון שלילית ופונה לעעל הציטוזולי , יוצר מטען שלילי בפנים התא
161
אנחנו יודעים שפוספוליפידים שונים מפוזרים בצורה לא אחידה בין שתי שכבות הממברנה , החיצונית והציטוזולית , אך זה לא נכון לגבי כולסטרול:
כולסטרול מפוזר באופן די אחיד בין שני עלעלי הממברנה
162
לאיזה משפחה שייך האנזים פלופאז ?
מוגדר כמשאבה מסוג ABC transporter
163
כיצד חלבונים טרנסממברנליים מוחזקים בממברנה ?
כשהמסה העיקרית שלהם פונה באופן כמעט בלעדי כלפי צד אחד של הממברנה
שקף 91
164
חלבונים פרפריאליים:
חלבונים שמצומדים לחלבונים אינטגרליים בקשר לא קוולנטי
חלבונים אלו מאופיינים בכך שניתן למצות אותם מהממברנה ע״י תהליכי מיצוי עדינים יחסית
חלבונים אינטגרליים וחלבונים שמצומדים לעוגן לפידי לא ניתן לשחרר אותם בדרכים אלו
165
מהו גליקופורין ?
חלבון טרנס ממברנלי
דימרי
בעל מבנה של סלילי אלפא , שנפוץ מאד בממברנה של תאי דם אדומים
166
רוב החלבונים שחוצים את הממברנה הם סלילי אלפא:
תעלות שנבנות מסלילי אלפא , יכולות להיסגר ולהיפתח , לפי סיגנל (ליגנד , מתח חשמלי וכו׳)
תעלות שבנויות ממשטחי בטא , אינן מאפשרות שינויים במבנה החלבון
167
היכן מתווספים שיירי סוכר בגליקוליפידים ובחלבונים טרנסממברנליים ?
בלומן של ה ER ובגולג׳י ??
168
פירוק הלמינה הגרעינית:
פוספורילציה גורמת לרשת הלמינה הגרעינית להתפרק, וזה קורה במהלך המיטוזה
התהליך הפיך , וכאשר מורידים את הזרחנים , הלמינה נבנית שוב
169
הגראדיינט של שתי קונפורמציות חלבון Ran מניע את הטרנספורט של חלבוני המטען cargo בכיוון הנכון
שקף 134
170
פקטור NF-AT ,
nuclear factor of activating T cells
פקטור רגולטורי שמווסת nuclear import בזמן שפעול תאי T
כשתאי T אינם פעילים , הפקטור נמצא בציטוזול **במצב מזורחן**،
כאשר תאי T משופעלים (ע״י חשיפה לאנטיגן זר) , מתרחשת עליה בריכוז הסידן הציטוזולי , עליה בריכוז הסידן מאקטבת פוספטאז בשם calcineurin שנקשר ל NF-AT ומוריד את הזרחן ממנו
הדהפוספורילציה של NF-AT חושפת על פניו רצף NLS וחוסמת רצף NES , כל שכעת הקומפלקס NF-AT + calcineurin נכנסים לגרעין, והפקטור NF-AT מפעיל שעתוק של גנים החיוניים לפעילות תאי T
המצב מסתיים כשיש ירידה בריכוז הסידן בציטוזול , מה שגורם לניתוק בין ״נפאט״ לבין קלצינורין , רהפוספורליזציה של נפאט , חשיפת NES, וחסימת NLS , ויציאת נפאט חזרה לציטוזול
שקף 137
171
מעטפת הגרעין מתפרקת ונבנית מחדש בזמן מיטוזה:
בתאים אנימליים מעטפת הגרעין מתפרקת בזמן מיטוזה כדי שהמיררוטובולי יוכלו להיקשר אל הכרומוזומים המשוכפלים לצורך ההפרדה שלהם לתאי הבת
בסוף ההפרדה , מעטפת הגרעין נבנית מחדש , והחלוקה האסימטרית של המרכיבים בין הציטוזול לגרעין מתחדשת
172
בזמן מיטוזה בתאים אנימליים הגאעין מתפרק באופן רברסיבילי , אילו הם המרכיבים הגרעיניים שמתפרקים ?
הלאמינה הגרעינית
הממברנה של הגרעין
NPC
173
בזמן מיטוזה פוספורילציה ודה פוספורילציה גורמים להתפרקות ובניה מחד של הגרעין:
פוסםורילציה של למינים , גורמת להתפרקות הלאמינה הגרעינית , מה שבתורו גורם להתפרקות מעטפת הגרעין , תהליכי פוספורילציה דומים מתרחשים על ה NPC ועל חלבונים בממברנה הפנימית של מעטפת הגרעין , לבסוף תהליכים אלה גורמים להתפרקות המעטפת והגרעין
בתהליך ההפוך אחרי החלוקה התאית , ישנה התרכבות של הגרעין בתאי הבת , בשלב זה מתרחשת דהפוספורילציה .
אחרי המיטוזה , הכרומטין כבר אינו במצב הדחוס שלו , מסביבו למינים לא מזורחנים מתחילים להתקבץ , הם מושכים חלקי ממברנה שמכילים רצפטורים קושרי למין שמתקבצים יחדיו ליצירת מעטפת גרעין דו שכבתית
174
כיצד נבנה הגרעין מחדש אחרי מיטוזה בתאי הבת ?
אחרי הפרדת הכרומוזומים לשני תאי בת , cdk עובר אינטקטיבציה , וכך מתרחש תהליך דהפוספורילציה לכל מרכיבי הגרעין
ענן RanGTP שנשאר קשור לכרומטין הוא זה שמסמן למרכיבי המעטפת הגרעינית להיווצר במיקום הנכון
אחרי שהם עוברים דהפוספורילציה , למינים נקשרים חזרה לכרומטין (שכבר איננו דחוס) , למינים אלה מגייסים את ממברנת ה ER אל האזור בו הם נמצאים עם הכרומטין , על ממברנת ה ER יש רצופטורים ללמינים דרכם הם נקשרים
ה ER הולך ועוטף את הכרומוזומים עד שנוצרת מעטפת גרעין מלאה
בשלב הראשון כשנוצר הגרעין , הוא מכיל אל ורק את החלבונים שקשורים לממברנת ה ER שבנצה את מעטפת הגרעין
אולם ריכוז גבוה של RanGTP על הכרומטין , ומנגד ריכוז גבוה של RanGDP בציטוזול , מאפשר חידוש המלאי של החלבונים שנמצאים בגרעין לפי המסלול שאנחנו מכירים.
175
מה תפקידה של עדשת ה condenser במיקרוסקופ dark field ?
עדשת ה condenser יוצרת קרני אור בזווית אלכסונית שלא מגיעים לעדשת ה objective אך כן מגיעים לדגימה.
176
במיקרוסקופ אופטי , מסוג phase contrast לא ניתן להבחין בפרטים מבניים בתוך התא:
וזאת כי התא אינו צבוע
177
מיקרוסקופ פלורסנטי עושה שימוש בפלורופור:
פלורופור זה מולקולות פלורסנטיות שסופגות אור באורך גל מסויים , ופולטות אור באורך גל גדול יותר עם אנרגיה נמוכה יותר
במיקרוסקופ פלורסנטי מספיק כמות קטנה של פלואורוסנסיה כדי שתהיה דטקציה של הדגימה (הפלורופור)
178
החלבון GFP:
Green fluorescent protein
מעורר בכחול ופולט ירוק
מורכב מ 238 ח״א
מקודד ע״י גן אחד שניתן לשבט אותו לאורגניזמים שונים , שאז הם מבטאים אותו , וכך נוכל לעקוב אחרי הסיטוי שלו בתאים חיים
החלבון הוא בעל מבנה של חבית בטא שמורכב מ 11 גדילי בטא
אינו פעיל מיד , אלא כשעה אחרי שהוא נוצר
שקף 169
179
אימונוציטוכימיה:
שיטה שעובדת עם מיקרוסקופ פלורסנטי ומיקרוסקופ אלקטרונים:
**במיקרוסקופ פלורסנטי**: השיטה משתמשת בנוגדנים כדי להבחין במולקולות ספיציפיות
אנחנו מסמנים נוגדנים עם חומר פלורסנטי , הנוגדן (שאליו קשור הפלורסנט) נקשר באופן ספיציפי למולקולה שמעניינת אותנו , וכך אנחנו יכולים למקם את המולקולה בתוך התא
**במיקרוסקופ אלקטרונים**: אותו עיררון , רק במקום חומר פלורסנטי , אנחנו מסמנים את הנוגדנים עם כדורי זהב , colloidal gold spheres
180
ישנם שני סוגים של אימונוציטוכימיה;
1) סוגר ראשון: **ישיר או נוגדן ראשוני** ,
הסמן הפלורסנטי נקשר ישירות לנוגדן שקושר את הדגימה
2) סוג שני: **בלתי ישיר או נוגדן שניוני** ,
ישנו נוגדן שנקשר אל הדגימה , אל הנוגדן הזה נקשר נוגדן שני , שאליו נקשר הסמן הפלורסנטי.
השיטה השניונית היא מאד רגישה כי ישנו מספר גדול יחסית של נוגדנים שניוניים שיכולים לקשור את הנוגדן הראשון!
!! **הנוגדן השני מחובר באופן קוולנטי לסמן הפלורסנטי** !!
181
התכונה הכי בולטת של נוגדנים:
ספיציפיות ,
נוגדן הוא מאד ספיציפי למולקולה שהוא קושר , ועל כן , השימוש הנפוץ בהם בעבודה מיקרוסקופית
182
שימוש במיקרוסקופ אור רגיל דורש חיתוך הדגימה , ולכן לא ניתן לראות אותה בתלת מימד:
כדי להתמודד עם זה קיימות שתי שיטות:
1) שחזור תמונה בשיטת דה קונבולציה
image deconvolution
2) ע״י שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי
שתי השיטות משיגות אותה תוצאה , אך עובדים בדרכים שונות.
הרעיון מאחורי השיטות הנ״ל הוא שהן משפרות את הרזולוציה , עוזרות לנו להיפטר מטשטוש שקיים בתמונה שמוסגת ממיקרוסקופים אחרים , וכן , נותנת תמונה תלת מימדית.
183
שיטת image deconvolution:
דה - קונבולציה
פועלת ע״י השגת סדרת תמונות מטושטשות , ממצלמת CMOS ולאחר מכן עיבוד דיגיטלי של אוסף התמונות הדיגיטליות
184
מיקרוסקופ קונפוקלי:
מבוסס על קרני לייזר ופלורסניסיה
אך בניגוד לפלורסנסיה רגילה שמשתמשת באור לבן ופילטר כדי להשיג אורך גל רצוי ,
מיקרוסקופ קונפוקלי מראש עושה שימוש בקרן לייזר שהיא כבר מונוכרומטית (קרן לייזר היא לא אור לבן) ולכן האור יהיה חזק יותר (וחד יותר) כי אין בו פלטרציה
בעזרת שני pinholes אנחנו מצליחים לגרום לקרן הלייזר להיות מאד חדה וממוקדת
בפועל אנחנו משתמשים בשתי קרני לייזר , כל קרן לייזר יכולה לחדור את הרקמה לעומק שונה , וכך אנחנו מקבלים תמונה תלת מימדית
185
מה ההבדלים בין מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל ומיקרוסקופ קונפוקלי ?
שניהם עושים שימוש בפלורסניסה , ובשניהם האור המוחזר מהדגימה הוא באורך גל יותר גדול מהאור שהקרנו.
מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל מאיר את **כל הדגימה** , ורק חלקים ממנה , היכן שיש עירור , מחזירים אור באורך גל מסויים שנקלט בעדשה.
מיקרוסקופ קונפוקלי מפקס אור וממקד אותו **בנקודה אחת ויחידה** בדגימה בעומק ספיציפי
כדי שמיקרוסקופ קונפוקלי יוכל באמת למקד את האור הוא עושה שימוש ב , pinhole , יש שניים כאלה , אחד לפני הדגימה , והשני לפני העדשה של המתבונן ,
האור נע בקו יישר דרך שני ה pinholes, אור שאינו בקו הפוקוס של ה pinhole השני (שקרוב לעדשת המתבונן) הולך לאיבוד ולא נקלט בעדשת המתבונן , כך הרזולוציה תהיה חדה יותר , והתמונה פחות מטושטשת
קונפוקלי יותר חד מפלורסנטי רגיל
186
מיקרוסקופ קונפוקלי לעומת שיטת דה - קונבולוציה:
שתי השיטות אינן טובות עם דגימות עבות מדי !!
אך יחד עם זאת מיקרוסקופ קונפוקלי עדיף על פני דה - קונבולוציה כשמדובר בדגימות טיפה עבות , יכול להשיג תמונות בעובי דגימה של עד 150 מיקרון
שיטת de convolution , יעילה באיסוף כמויות קטנות של אור (קליטת סיגנלים חלשים) והפקת תמונות תלת מיימדיות מדגימות שצבועות באופן חלש , או שיכולות להינזק מהאור הבהיר שמשתמשים בו במיקרוסקופ קונפוקלי , אפשר לעבוד בשיטה זו עם דכימות בעובי 40 מיקרון לכל היותר
187
מיקרוסקופ אופטי - מולטי פוטוני:
שיטה שמוצעת כפתרון לבעיית העובי שקיימת בשיטת דה - קונבולציה (שמוגבלת ל 40 מיקרון) , ומיקרוסקופ קונפוקלי (שמוגבל ל 150 מיקרון).
מיקרוסקופ מולטיפוטוני מאפשר ליצור תמונה בעומק של 0.5 מילמיטר בתוך **דגימה חיה**
גם בשיטה זו יש שימוש בחומר פלורסנטי , אך בניגוד למיקרוסקופ פלורסנטי רגיל שבו מושג עירור לדגימה באמצעות פוטון יחיד בעל אנרגיה גבוהה , פה משתמשים בשני פוטונים (או יותר) , כשכל אחד בעל אנרגיה נמוכה , שני הפוטונים נפגשים עמוק בתוך הדגימה ומעוררים אותה , נזכור שהדגימה פלורסנטית , ולכן היא מחזירה אור אחרי העירור שנקלט אתלנו וכך רואים את התמונה.
שיטה זו טובה לרקמות חיות, כגון הדמיית פעילויות דינמיות של סינפסות ונוירונים מתחת לפני השטח של מוחות חיים.
188
מיקרוסקופ אופטי - סופר רזולוציה:
מיקרוסקופ שמאפשר לנו להתגבר על דפרקציה והכך משפר רזולוציה ,
דפרקציה נוצרת כאשר קרן אור נעה דרך מחסום עם חורים או פתחים הקטנים מאורך הגל שלה
בעצם בתוך התא , אברונים ומבנים תאיים מהווים סוג של מחסום , והמרחק בינהם הוא הפתח הזה שדרכו קרן האור מהמיקרוסקופ צריכה לעבור.
כל שיטות מיקרוסקופיית האור שתיארנו עד כה מוגבלות לרזולוציה (מרחק בין שתי נקודות ) של 0.2 מיקרון (200 ננומטר) , הרבה מבנים תאיים נמצאים קרוב יותר אחד לשני מ 0.2 מיקרון, ולכן במיקרוסקופיית אור שאינה סופר רזולוציה לא ניתן להבחין בהם , והם נראים כגוף אחד.
מיקרוסקופ סופר רזולוציה מתגבר על בעיית הדפרקציה , ומצליח לייצר רזולוציה של עד 10 ננומטר (0.01 מיקרון)
שיפור של פי 20
189
ישנם 4 סוגים של מיקרוסקופי סופר רזולוציה:
STORM
PALM
SIM
STED
190
SIM:
עושה שיפור של פי 2 מציקרוסקופ אור רגיל או פלורסנטי רגיל
מיקרוסקופ אופטי - סופר רזולוציה
מדובר למעשה בשיטת הדמיה **פלורסנטית** עם רזולוציה של בערך 100 ננומטר (0.1 מיקרון) , שזה שיפור פי 2
מיקרוסקופ sim משתמש ברשת מיוחדת שעושה התאבכות , וזה משפר את הרזולוציה , יש לסובב את הרשת מספר פעמים (בדרך כלל 3) כדי שאזורים בדגימה שמוסתרים מהרשת יחשפו כאשר מסובבים אותה ,
סים יכול להיות בשימוש עם כל סמן פלורסנטי , ונותן תמונה בתלת מימד.
שקף 188
191
STED:
מיקרוסקופ סופר רזולוציה ,
מקטין את פונקציית פיזור הנקודות .
ב STED אנחנו משתמשים בפרובים פלורסנטיים שניתן להדליק ולכבות אותם באופן הםיך באמצעות אורכי גל שונים.
192
מה משותף לכל המיקרוסקופים שהם סופר רזולוציה ?
מקטינים את פונקציית פיזור הנקודות
יכולות לכלות תמונות בצבעים רבים
נותנות תמונות תלת מימדיות
עושות הדמיה של תא חי בזמן אמת
193
PALM ו- STEM
הם שני מיקרוסקופים אופטיים , ממשפחת הסופר רזולוציה
1) הם משתמשים בקרני אור לייזר שמדליקים באופן רציף קבוצות של מולקולות פלורסנטיות בדגימה ,
2) לאחר מכן מולקולות פלורסנטיות אלה עוברים הדמיה לפני שיאבדו את הפלורסנסיה שלהם , וקבוצה חדשה של מולקולות מופעלת.
כל מולקולה בעצם מפיקה אלפי פוטונים כתגובה לעירור לפני שהיא נכבית
3) תהליך ההדלקה / כיבוי חוזר על עצמו מאות עד אלפי פעמים , מה שמאפשר לקבוע את הקאורדינטות המדויקות של סט גדול של מולקולות בודדות
194
Expansion microscopy-
ExM
שיטה שבה מגדילים את הדגימה , או בעצם מנפחים אותה , מה שמביא לשיפור ברזולוציה
**השיטה טובה עם מיקרוסקופים קונבנציונליים , ולא סופר רזולוציה**
1) צובעים את הדגימה עם תגים פלורסנטיים
2) עושים קישור צולב שמחבר בין הדגימה לבין התגים
3) הוספת ג׳ל (אקרילאט ואקרילאמיד)
4) התגים מתחברים לג׳ל קוולנטית , מה שמקבע את הדגימה במקומה בתוך הג׳ל
5) **עיכול חומרים פנימיים שעלולים להפריע לתהליך כגון חלבונים** , כלומר הדגימה אינה חיה
6) ניפוח הג׳ל , ע״י הסרת המלח מהתמיסה
שיטה זו מאפשרת לראות את הפרטים בצורה טובה יותר
195
מיקרוסקופ אופטי - light sheet microscopy
זוהי שיטה שמאפשרת לבחון מבנים (אורגניזמים) רב תאיים , באורגניזם חי
מאירים את הדגימה בקרן לייזר **דקה במיוחד** בצורה אנכית לציר שממנו הפלורוסנסיה המפלטת נצפית
קרן הלייזר סורקת לאורך הדגימה ומעוררת רק מולקולות מסומנות בעומק הדגימה
יתרונות:
- מיגודיות גבוה עם מעט bleaching
- תלת מימדי
- שיטה מהירה (מאות מישורים בשניה)
ניתן לשלב את השיטה עם STED ו- ExM
196
טכניקות פלורסנטיות :
בעזרת שיטות אלו , אנחנו יכולים ללמוד על הקנטיקה של חלבונים ועל האנטראקציות שלהם עם מולקולות אחרות
יש 3 טכניקות פלורסנטיות שמאפשרות לחקור דינמיקה של חלבונים בתאים חיים:
1) FRET
2) photo activation
3) FRAP
197
FRET:
Fluorescence resonance energy transfer
**בשיטה זו אנחנו בודקים היכן ומתי יש אינטראקציה בין שני חלבונים שונים**
בשיטה זו שני חלבונים מסומנים בשני פלורוכרומים שונים ,
אנחנו מעוררים את אחד החלבונים, ה (donor) , בעזרת אור, כשהחלבון הזה דועך הוא פולט אור שעובר ברזוננס לחלבון השני , ה (acceptor) , ונקלט בתוכו , כעת כשהמקבל דועך הוא פולט אור גם כן.
**ניתן לכמת את ההפחתה בפלורוסנסיה של התורם בנוכחות המקבל**
התנאי שהשיטה תעבוד היא שהמרחק בין התורם למקבל לא יעלה על 5 ננומטר , וזה סימן לכך ששני החלבונים אכן נמצאים באינטראקציה או בפוטנציאל לייצר אינטראקציה
אם המרחק גדול מ 5 ננומטר , כלומר אין אינטראקציה בין שני החלבונים , אנחנו נראה שהאור הנפלט הוא רק של החלבון הראשון
אם נגדיל את המרחק בין שני החלבונים , יעילות השיטה תרד ״במרחק״ בחזקת 6
שקף 206
198
פוטו אקטיבציה -
Photoactivation
זוהי טכניקה שבודקת קנטיקה
ניתן להנדס חלבוני GFP ועוד חלבונים פלורסנטיים אחרים כך שהם יזהרו בעוצמה כשהם עוברים אקטיבציה ע״י פולס חזק מאד של אור בגלים שונים , כך שהם יאירו בעוצמה או אפילו ישנו צבע
ניתן לעקוב אחר חלבונים בתא שיכולים לעבור איחוי עם חלבוני GFP ונגזרותיו
השיטה מאפשרת לנו לעקוב אחרי זמן החיים וההתנהגות של חלבונים
199
FRAP:
Fluorescence recovery after photobleaching
שיטה זו בדומה לפוטו אקטיבציה נותנת מידע על הקנטיקה של חלבונים
השיטה עושה שימוש ב GFP , מאירים בצורה חזקה מאד **וממוקדת** באמצעות קרן לייזר באזור מסויים בתא כדי לעורר את ה GFP , העירור הוא חזק מאד עד כדי שנוצר photobleaching ובמולקולות הלא מאירות יותר
נותנים למערכת זמן , ורואים שיקום של הפלורסנסיה , מעיד על כך שיש תנועה של מולקולות פלורוסטיות שלא נפגעו לאזור שעבר bleaching
ולכן בשיטה זו לומדים על מיקום חחבונים ומולקולות , דיפוזיה , קצב דיפוזיה , קצב של טרנספורט אקטיבי , וקצב אסוציאציה ודיסוציאציה של חלבונים.
200
TIRF:
שיטה שבעזרתה ניתן לדמות מולקולות בודדות ,
כגון חלבוני מנוע שנעים לאורך סיבי אקטין או מיקרוטובולי
201
מיקרוסקופ אלקטרונים:
משתמש באלקטרונים ולא בגל אור
מגיע לרזולוציות יותר נמוכות כי אורך הגל של אלקטרון קצר יותר מזה של פוטון
הכנת הדוגמית למיקרוסקופ אור הינה תהליך מסובך, וקשה להיות בטוחים שמה שאנו רואים תואם במדויק למבנה החי המקורי
הביצועים של מיקרוסקופ אלקטרונים משתפרים ע״י מקורות הארה של המיקרוסקופ שנקראים field emission guns
ניתן בעזרת מיקרוסקופ אלקטרונים לבנות תמונה תלת מימדית בעזרת טכניקת **״אנליזה ממוחשבת של תמונה״**
202
השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים דורש תהליך הכנה מורכב , ולא תמיד בטוחים שהדוגמית אחרי ההכנה אכן מייצגת את המבנה המקורי כמות שהוא בטבע:
כדי להתגבר על מגבלה זו ניתן להשתמש בשיטות של הקפאה מהירה - cryo , כדי לשמר מבנים בצורה אמינה לצורך שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים
203
הרזולוציה של מיקרוסקופ אלקטרונים:
הרזולוציה של מיקרוסקופ אלקטרונים נקבעת ע״י אורך הגל של האלקטרון ,״אורך הגל של אלקטרון יורד ככל שהמהירות שלו גוברת״.
לאלקטרון אורך גל מאד קטן: 0.004 ננומטר, מכאן:
בתאוריה , מיקרוסקופ אלקטרונים יכול להגיע לרזולוציה של 0.002 ננומטר
בפרקטיקה, הרזולוציה מגיעה ל 0.05 ננומטר , בגלל שניתן להשתמש רק במרכז העדשה של המיקרוסקופ
ברקמות ביולוגיות , עקב מגבלות של הכנת הדוגמית , ניגודיות ונזק מקרינה , הרזולוציה האפקטיבית מגיעה עד ל 1 ננומטר
**ניתן לשפר ביצועי מיקרוסקופ אלקטרונים בעזרת field emission gun**
204
ישנם שני סוגי מיקרוסקופ אלקטרונים:
TEM
SEM
205
TEM-
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר
דומה מבחינת מבנה ועיקרון עבודה למיקרוסקופ אור , רק שהוא בנוי הפוך וסדר החלקים בו הפוך , למשל , מקור האלקטרונים - סליל או קטודה , נמצאים בחלקו העליון (בניגוד למקור האור במיקרוסקופ אור שנמצא בתחתית)
האלקטרונים עלולים להתפזר אם נתקלים במולקולות אוויר , ולכן צריך ליצור ואקום לאורך מסלול התקדמות האלקטרונים , וגם לשים את הדגימה בואקום
קרן האלקטרונים ״מפוקסת״ בעזרת סלילים מגנטיים , כמו שעדשות מפקסות את קרן האור במיקרוסקופ אור
אזורים צפופים יותר בדגימה , או עבים יותר יראו כהים יותר כי הם מפזרים את האלקטרונים ואלו לא נקלטים בגלאי , ואזורים צפופים פחות יראו בהירים
הדגימה אינה חיה , נחתכת לסלייסים דקים בעובי של 25 - 100 ננומטר כדי שהאלקטרונים יוכלו לחדור אותה
206
כיצד מכינים דגימה במיקרוסקופ אלקטרונים TEM:
1) ייבוש הדגימה
2) החדרת רזין שאז מתפלמר לבלוק פלסטיק (נראה לי כמו שמן ששמים במיקרוסקופ אור)
3) חיתוך ע״י מיקרוטום
4) החזקת וקיבוע הדגימה בעזרת רשת מתכתית
5) הקפאה מהירה של הדגימה כדי להבטיח שהיא דומה באמת למצב האימית בתא או שימוש בשיטת freeze substitution
כמו במיקרוסקופ אור , הדגימה בדרך כלל נצבעת , אך במיקאוסקופ אלקטרונים הדגימה תצבע במתכת כבדה כגון אורניום , עופרת או אוסמיום.
לבסוף ניתן לצפות הדגימה בדטקטור או לתעד אותה בעזרת CMOS
שקף 218 + 220 + 221
207
מיקרוסקופ אלקטרונים ו immunogold:
כפי שניתן להשתמש בנוגדנים במיקרוסקופ פלורסנטי כדי למקם מאקרומולקולות ספיציפיות
ב TEM ניתן להשתמש ב colloidal gold , שזה חלקיקי זהב שמחברים אותם לנוגדן שניוני שמתחבר לנוגדן ראשוני שמתבר לדגימה
בתמונה שמתקבלת , חלקיקי הזהב נראים בצבע שחור
208
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק - SEM
מפיק תמונה תלת מימדית של פני שטח הדגימה!!
בניגוד ל TEM שמפיק תמונה מעוצק הדגימה באמצעות אלקטרונים שחדרו אותה.
התמונה ש SEM מפיק היא באמצעות אלקטרונים שהתפזרו על פני שטח הדגימה או נפלטו ממנו
גם ב SEM הדגימה עוברת הכנה:
קיבוע , ייבוש וציפוי של מתכת כבדה או לחילופין , הקפאה מהירה והכנסה ישירות למיקרוסקופ
209
טומוגרפיה של EM:
עיקרון:
איסוף חתכים מכיוונים שונים של אותה הדגימה , ושקלול של כל החתכים לתמונה תלת מימדית
שיטה זו עוזרת לנו להתגבר על המגבלות של שני מקרוסקופי האלקטרונים שאנחנו מכירים , TEM ו- SEM
ב **SEM** מתקבלת תמונה רק מפני השטח של האובייקט, וזה כמעט ולא נותן מידע על היחס התלת מימדי של מאקרומולקולות ואורגנלות בתוך התא
ב **TEM** , הסלייסים הדקים (כחלק מהכנת הדגימה) , הרבה פעמים לא מעבירים מידע על הסידור התלת מימדי של מרכיבי התא
הפתרון כאמור הוא טומוגרפיה , לבנות תמונה תלת מימדית מסדרה של סלייסים.
210
גם ב SEM הדגימה עוברת הכנה:
קיבוע , ייבוש וציפוי של מתכת כבדה או לחילופין , הקפאה מהירה והכנסה ישירות למיקרוסקופ
211
מהי הרזולוציה של מיקרוסקופ SEM:
בין 0.5 ננומטר ל 10 ננומטר
212
אופן הפעולה של מיקרוסקופ SEM:
קרן שקה של אלקטרונים יוצאת מ electron gun,
סלילים מגנטיים , שמשמשים ״כעדשות״ מפקסים את קרן האלקטרונים אל הדגימה ,
קרן האלקטרונים סורקת את פני השטח של הדגימה , האלקטרונים מהקרן מתנגשים בדגימה ונפלטים ממנה בכל מיני כיוונים , חלקם נקלטים ב detector שאז נותן תמונה של הדגימה על מסך
שקף 227
213
תכונות של מיקרוסקופ SEM:
1) בגלל שהמיקרוסקופ סורק ולא חודר , לעיתים אין צורך לחתוך את הדגימה לסלייסים של 25 עד 100 ננומטר , כמו שעושים ב TEM , אלא שאפשר לשים חתיכה שלמה של צמח או בעל חיים קטן עם מעט מאד הכנה.
2) בגלל שכמות האלקטרונים המתפזרים מהדגימה תלויה בזווית בין פני השטח שלה לקרן האלקטרונים , לתמונה יש אזורים מוארים והצללות שנותנות מראה תלת מימדי.
3) בגלל היותו מיקרוסקופ סורק עם רזולוציה של 0.5 עד 10 ננומטר , SEM מתאים לסריקת צאים שלמים ורקמות יותר מאשר אורגנלות תוך תאיות
214
מיקרוסקופ SEM ו- field emission gun:
הרזולוציה של SEM פחות טובה מזו של TEM ,
אך יחד עם זאת פותח SEM עם רזולוציה גבוהה מאד שמשתמש ב field emission gun כמקור אלקטרונים שםולט אותם בצורה בהירה וקוהרנטית.
**בגלל שהרזולוציה ב SEM אינה תלויה ב אורך הגל של קרן האלקטרונים אלא בגודל של נקודת האלקטרונים שנסרקת לאורך הדגימה , הסוג הזה של SEM עם field emission gun יכול להפיק תמונות שמתחרות ברזולוציה עם negative staining של TEM
215
איזה רצף לוקליזציה יהיה חשוף על הפקטור NF-AT בזמן שהוא מזורחן ?
רצף NES , מה שמבטיח שהפקטור נשאר מחוץ לגרעין
216
מדוע אין גליקוליפידים על ממברנת ה ER ?
גליקוליפידים מיוצרים בגולג’י , כלומר תהליך הוספת הסוכר לשומן מתרחש בגולג’י!!
ה ER מייצר ליפידים ממברנליים עבור עצמו , אלה אינם עוברים בגולג’י ולכן אינם מסוכרים , אי לכך , אין גליקוליפידים בממברנת ה ER
217
גנגליוזיד הוא:
סוג של גליקוליפיד, בעצם הגליקוליפיד הכי מורכב שיש.
גליקוליפידים תמיד ימצאו בממברנה בעלעל שפונה הרחק מהציטוזול
218
הגליקוליפידים הנפוצים ביותר בתאי עצב הם גנגליוזידים:
נכון / לא נכון?
לא נכון ,
גנגליוזידים אמנם נפוצים הכי הרבה בממברנה של תאי עצב (יחסית לתאים אחרים) , אולם בתאי העצב יש גליקוליפידים שיותר נפוצים מגנגליוזידים.
219
פוספטידיל אתנול אמין , פוספטידיל כולין ו- פוספטידיל סרין הם:
פוספו גליצרו ליפידים
סוג זה של שומני ממברנה הוא הכי נפוץ , יותר מגליקוליפידים (בתאים אנימליים גליקוליפידים הם ספינגוליפידים בהכרח) ויותר מפוספו ספינגו ליפידים.
שלשת הפוספוליפידים הנ”ל מהווים ביחד יותר ממחצית מסת השומנים ברוב ממברנות התאים היונקים
ההבדל בינהם הוא בקבוצת הראש שמחוברת לפוספט
Phosphatidylethanolamine
Phosphatidylcholine
Phosphatidylserine
220
תאר את ממברנת ה lipid droplets:
ממברנה חד שכבתית ,
בעצם מדובר בממברנה החיצונית של ה ER. ה droplets מיוצרות ביו שתי שכבות הממברנה של ה ER, ואז החיצונית מתנתקת והופכת להיות ממברנה חד שכבתית של ה lipid droplet
הואיל ובממברנת ה ER אין גליקוליפידים , ה droplet אינה מכילה שיירים סוכרתיים.
