ביותא 4 Flashcards
(342 cards)
1
Q
הקדמה:
פרק 12
A
התא מכיל מאות אלפים של מאקרומולקולות , אלו מופרדות זו מזו מרחבית (בתוך אברונים) , ועל כן , גם הפעילות הביוכימית שלהם מופרדת , ומוגבלת לאזור בתא בו הם נמצאות.
ארגון פנימי , בעצם אברונים , הוא פיצ׳ר של תאים יוקריוטים , ומבדיל אותם מתאים פרוקריוטים.
מבין האברונים העיקריים שיש בתא יוקריוטי:
- רשתית אנדופלסמטית: ייצור של חלבונים
- מערך גולג׳י: מודיפקציות על חלבונים ו sorting
- ליזוזום: פירוק של דברים
- מיטוכונדריה: ייצור אטפ + חמצון בטא.
- כלורופלסט
אלו מאופיינים בכך שהם מוקפים בממברנה , הפלסטיד והמיטוכונדריה , בממברנה כפולה.
לציין , שפרוטטוזום הוא אינו אברון.
מלבד האברונים , ישנם גם קונדנסטים מולקולריים בתא , שהם צבר גדול של מאקרומולקולות שחוברות יחדיו ומתפקדות ״כמפעל״ ביוכימי או כגופיף אחסון.
בממוצע , תא יוקריוטי אנימלי מכיל כ 10 מליארד (10^10) חלבונים , מכ 10,000 סוגים שונים. הסנתזה של כמעט כל החלבונים הללו מתחילה בציטוזול (יש כאלה שמסונתזים במטריקס המיטוכונדריאלי) , ולאחר מכן כל חלבון מיובא לאברון הרלוונטי בעבורי , או לחילופין נשאר בציטופלסמה , אך המשותף לכולם זה שתחילת התרגום מתרחשת בציטוזול כאמור.
לכל אברון יש ממברנה ייחודית ומיוחדת בהקשר של הרכבה הלפידי והחלבוני , הרכב הליפידים והחלבונים משמש כסמן שלפיו התא ״יודע״ איזה חלבונים צריך לשלוח לאברון הזה ספיציפית , כך שהזהות של האברון נשמרת.
לכל אברון יש סט חלבונים מיוחד משל עצמו , שמגדיר אותו מבחינה מבנית ותפקודית - כגון קטליזה של ריאקציות ספיציפיות (אנזימים) , טרנספורט סלקטיבי של חומרים (טרנספורטרים ממברנליים) ועוד , כל אלה הם חלבונים שהתא צריך לשנע אל האברון.
2
Q
קומפרטמינטיזציה תאית:
כל התאים היוקריוטים מכיל , בגדול , את אותם אברונים:
A
תהליכים ביוכימיים רבים שקורים בתא , מתרחשים בתוך הממברנה או על גביה!!
כך נראה שאנזימים שנמצאים על הממברנה , עוסקים במטבוליזם של ליפידים למשל , נראה גם שאנזימים שנמצאים על גבי הממברנה הפנימית במיטוכונדריה מזרזים ריאציות של חמצון זרחוני , וכאלו שנמצאים על הממברנה הפנימית בכלורופלסט עוסקים בפוטוסיתזה , בשני המקרים אנזימים אלו מצמדים העברת פרוטון ויצירת גרדיינט לסנתזת אטפ.
הממברנות של האברונים אי לכך , מספקות פלטפורמה ענפה (הגדלת שטח פנים אינטראצלולרי) לתהליכים אנזימטיים שקורים עליהם , ובנוסף ממדרות את פנים התא לכדי אזורים נפרדים שכל אחד מתמחה בפעילות מסויימת.
המידור הפנימי בתוך התא , בעצם נוכחות האברונים , מאפשר לריאקציות שונות שדורשות סביבה שונה להתרחש במקביל. ברגע שלא הכל מתרחש בציטופלסמה , אלא בתוך אברונים נפרדים , לכל אברון יכולה להיות סביבה פנימית משלו שתתאים לסט ריאקציות ספיציפיות , אך לא תתאים לסט ריאקציות אחר , וכך שני הסטים של הריאקציות יכולים להתרחש במקביל , כל אחת באבאון הייעודי שלה , ללא מפריע. כמו כן , הודות לקומפרטמינטיזציה בתוך התא , ריאקציות שמתחרות זו עם זו (על המגיבים למשל) גם כן יוכלו להתרחש במקביל , ומבלי להפריע אחת לשניה.
הממברנה הלפידית הינה מחסום סלקטיבי עבור מרבית המולקולות , בייחוד ההידרופיליות. ועל כן כדי שיהיה ניתן לבצע ייצוא וייבוא של חומרים מהאברון ואל האברון , וכן הטמעת חלבונים רלוונטיים בממברנה שלו - כחלק מהזהות הייחודית שלו - הממברנה צריכה להכיל מערכת מתאימה שתאפשר את ביצוע המטלות האלה.
בפיגר 12.1 רואים מספר דוגמאות של אברונים: ER , מיטוכונדריה , ליזוזום , פירוקסיזום , אנדוזום ועוד… נפרט מעט על כל אחד מהם בכרטיסיות הבאות.
3
Q
ציטופלסמה:
A
המדור העיקרי בתוך התא ,
הציטופלסמה מורכבת מהציטוזול ומהאברונים התאיים ששוחים בה (מאורגנים באמצעות המיקרוטובולי) .
הציטוזול עצמו מהווה יותר ממחצית מנפח התא , והוא האתר העיקרי של סנתזת ודגרדציית חלבונים. כמו כן הוא תווך ביניים , שבו מרבית הריאקציות המטבוליות מתחילות ולאחר מכן נמשכות באברונים מתמחים , או שמתחילות באברונים מתמחים ומסתיימות בו. (כמו למשל גליקוליזה ומעגל קרבס).
4
Q
ER
A
ה ER עצמו (החלק והמחוספס) מהווה פחות מ 20% מנפח התא הכולל , אך אם נתייחס לשטח הממברנה , אז הממברנה שלו מהווה מחצית מסך השטח הממברנלי הכולל של תא יוקריוטי. כלומר אם נחשב את השטח של כל הממברנות בתא יוקריוטי , מחצית מזה היא של ה ER.
הייצור של מרבית החלבונים המסיסים שעתידים להיות מופרשים מהתא החוצה , או חלבונים שמיועדים להיות חלבונים אינטגרליים בממברנה הציטופלסמטית , או בממברנות של אברונים אחרים מתחיל ב ER.
הייצור של החלבונים האלה מתרחש ע״י ריבוזומים שקשורים לממברנת ה ER מבחוץ , כך שהחלבון בעודו מתארך הוא מוכנס תוך כדי אל תוך הלומן של ה ER. הריבוזומים האלה שקשורים לממברנת ה ER מבחוץ נותנים לו , תחת מיקרוסקופ אלקטרונים , מבנה מחוספס , ועל כן השם RER.
ה ER הוא גם ״המפעל״ שבו מיוצרים מרבית השומנים והסטרולים של התא , וכן משמש כמחסן לסידן , החלק הזה של ה ER שעוסק בנ״ל חסר ריבוזומים שצמודים אליו מבחוץ , לכן יש לו מראה חלק , SER.
אחרי שסנתזת החלבונים שמיוצרים ב RER מסתיימת , חלק גדול מהם משונעים ממנו הלאה לגולג׳י.
5
Q
מערך הגולג׳י:
A
מערך מאורגן של ממברנות דמויות דיסקיות שמקופלות זו על , צורת ארגון זו נקראת golgi cisternae
הגולג׳י מקבל שומנים וחלבונים מה ER , ומפזר אותם לייעדים הסופיים שלהם בתא . בד״כ , לפני שהם יוצאים לייעדם הסופי , חלבונים ושומנים אלו עוברים מודיפיקציות קוולנטיות בגולג׳י ולאחר מכן הם משונעים.
6
Q
ליזוזום:
A
הליזוזם עוסק בפירוק !!
הוא מכיל אנזימי עיכול (acid hydrolysis) שיודעים לפרק מאקרומולקולות שמגיעות אליו מהציטופלסמה , חלקי אברונים פגומים , וחומרים שנכנסו אל התא דרך אינדוציטוזה.
חומרים שנכנסו אל התא דרך אינדוציטוזה , בטרם הגעתם אל הליזוזום עצמו , הם עוברים דרך סדרה של אברונים אחרים שנקראים אנדוזום.
לציין , בתא יש מערכת trafficing ענפה בין ה ER , גולג׳י , ליזוזם , אנדוזום , והממברנה הפלסמטית , וזיקולות רבות נעות הלוך ושוב בין האברונים האלה.
7
Q
מיטוכונדריה וכלורופלסט:
A
שני האברונים האלה מייצרים את מרבית האטפ של התא , שמושקע בריאקציות הדורשות השקעת אנרגיה חופשית.
הכלורופלסט הוא סוג של פלסטיד , שעבר התמחות ומסוגל לאחסן עקב כך מולקולות מזון ופגמנטים. כלורופלסט נמצא בצמחים , אתות ופרוטוזואה.
8
Q
פירוקסיזום:
A
אברון קטן , שקיים בצורת ויזקולות שמכילות אנזימים אוקסידטיביים , שיודעים לפרק דברים.
9
Q
סיכום של סקירת האברונים:
A
בממוצע , כל האברונים של התא ביחד תופסים מחצית מנפח התא , כאמור , הציטוזול מהווה את המחצית השניה (טבלה 12-1).
גודלם של האברונים השונים משתנה מתא לתא כתלות בתפקיד התא ובפעולות אותן הוא ממלא. לצורך העניין , בתאי כבד ותאי לבלב , שני סוגי תאים שמאד פעילים מטבולית ודורשים המון חלבונים , נראה שממברנת ה ER גדולה (מבחינת שטח פנים) פי 25 מהממברנה הציטופלסמטית בתאי הכבד , ופי 12 בתאי הלבלב.
כך אנו רואים שבעבור תאים יוקריוטים רבים , הממברנה הציטופלסמטית , שמכילה את שאר האברונים והמדורים התאיים , נחשבת יחסית כקטנה מאד , מבחינת שטח ומסה , בהשוואה לממברנות של אברונים אחרים , שנמצאים בתוך התא בצורה דחוסה ומקופלת.
כל אברון בגדול , מקיים את אותם תפקידים ופעולות בסיסיות בתאים שונים. אך בכל זאת יש שוני קטן , השוני נובע מסוג התא ותפקידו , כך שייתכן שבסוגי תאים מסויימים נמצא אברון נתון בשכיחות גבוהה יותר מבתאים אחרים , וכן נמצא שאברונים מסויימים מסגלים לעצמם תפקידים נוספים ומיוחדים לתא הספיציפי בו הם נמצאים , שלא קיימים בתאים אחרים.
למשל, תאי פלסמה שמדי יום מפרישים כמויות גדולות מאד של נוגדים (מבחינת מסה , שווה למסה של התא עצמו) , חייבים שתהיה להם מערכת ER מחוספס מפותחת ביותר כדי שהתא יוכל לסנתז כמויות כה גדולות של חלבונים (נוגדנים). ה RER בתאים כאלה מאורגן בצורת flat sheets והוא מסיבי מאד.
מנגד , בתאי שריר הלב , תאים שצריכים להתכווץ כל הזמן ודורשים אנרגיה רבה, נמצא מערכת SER ענפה מאד שמאחסנת כמויות גדולות של סידן הנחוץ לפעולת השריר , וכן מיטוכונדריה רבות מאד.
לא רק זאת , מסתבר גם שהמיקום של האברונים בתוך הציטופלסמה הוא אינו רנדומלי , אלא נוטה להיות קבוע. כך נמצא שבמרבית התאים הגולג׳י נמצא סמוך לגרעין , בעוד ה ER יוצא ממנו ישירות ומשתרע בתוך הציטוזול. הארגון הזה הוא הודות לסיבי שלד התא , בייחוד מיקרוטובולי.
10
Q
טבלה 12-1
A
הנפח שתופס כל אברון בתוך תא הפטוצית.
כל האברונים ביחד תופסים כמחצית מנפח הציטופלסמה , הציטוזול לבד תופס את המחצית השניה.
11
Q
טבלה 12-2
A
החלק היחסי שהממברנות השונות מהוות מסך כל הממברנות של התא.
רואים עד כמה הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה יותר ענפה מהחיצונית. ממברנת ה ER היא הממברנה בעלת שטח הפנים הגדול ביותר יחסית לשאר האברונים , כולל הממברנה הפלסמטית.
12
Q
במצגת המורחבת , קופצים בשלב הזה לפרק 14
ודנים על מבנה המיטוכונדריה והכלורופלסט.
1
A
מרבית האטפ שנחוץ לתאים יוקריוטים מיוצר בשני אברונים שמתמחים בהמרת אנרגיה. אלה הם המיטוכונדריה והכלורופלסט.
המיטוכונדריה מתמחה בהמרת אנרגיה ממולקולות מזון אורגניות ליצירת אטפ , בתהליך של זרחון אוקסידטיבי.
המיטוכונדריה נמצאת בכל סוגי התאים היוקריוטים.
כלורופלסט , נמצא רק בצמחים ואצות ירוקות , והוא יודע להמיר אנרגיית אור לאטפ , בתהליך של פוטוסנתזה.
ניתן לראות את שני האברונים האלה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים , ובכך ניתן לראות שהחלק הכי משמעותי שלהם הוא הממברנה הפנימית , שעל גביה ישנם סטים רבים של חלבונים שיודעים להפיק אנרגיה ממולקולות אחרות , ואז להשתמש בה כדי ליצר אטפ.
גם למיטוכונדריה וגם לכלורופלסט יש דנא משל עצמם שנפרד מהדנא התאי (תאוריה אנדוסמביוטית). כיום חלק מאד קטן מהחלבונים שפעילים בשני האברונים האלה מסונתזים על ידם (מקורם בגנום שלהם) , כשמרבית החלבונים שפעילים בהם מקורם בגנום התאי.
העניין הזה ממחיש את עיקרון האנדוסימביוזה , המיטוכונדריה והכלורופלסט מסתמכים כמעט כליל על התא שייצר בעבורם חלבונים (הגנים של ה 95% מהחלבונים הפעילים במיטוכונדריה נמצאים בגרעין) , והתאים צריכים את האברונים שייצרו עבורם אנרגיה , וכן , שיעשו עוד כל מיני תהליכים מטבוליים.
התהליך שבו האברונים מייצרים אטפ , הינו תהליך כימואוסמוטי , הכימו מתייחס לייצור עצמו של האטפ , האוסמוטי , מתייחס לגרדיינט הפרוטונים שמספק את הכח המניע ליצירת האטפ , שני תהליכים אלה מצומדים. חיידקים רבים משתמשים בעיקרון הזה גם כן ליצירת אטפ, כשהגרדיינט נוצר מסביב לממברנה הפנימית שלהם.
פיגר 14.1 מתייחס לאזור הממברנלי בו מתקיים התהליך הכימואוסמוטי ליצירת אנרגיה.
במיטוכונדריה: הממברנה הפנימית ספיציפית בקריסטות , המיטוכונדריה מכילה שתי ממברנות (דו שכבתיות) כאשר הממברנה השניה מכילה קיפולים רבים ואינוגינציות , עליה ישנם האנזימים הנחוצים לתהליך ומסביבה נוצר גרדיינט הפרוטונים.
כלורופלסט: גם כן מכיל שתי ממברנות דו שכבתיות אחת פנימית ואחת חיצונית , אך מכיל בנוסף מערך ממברנלי שלישי , שנקרא הממברנה התילקואידית thylakoid membrane שעליה ישנם האנזימים הנחוצים לתהליך , ומסביבה נוצר הגרדיינט.
בחיידקים: יש אנזימים דומים שעושים תהליך דומה על הממברנה הפנימית.
13
Q
המיטוכונדריה:
A
המיטוכונדריה תופסת כ 20% מנפח הציטופלסמה במרבית התאים היוקריוטים. בניגוד לתפיסה המוטעית שהמיטוכונדריה (ביחיד מיטוכונדריון) הם מבנים קטנים דמויי חיידק שנמצאים בציטופלסמה , בפועל הם מבנים דינמיים מאד , שכל הזמן זזים בתוך התא , משנים את צורתם , מתאחים זו עם זו ומתבקעים.
בד״כ כשמתבוננים בתאים יוקריוטים , לא נמצא את המיטוכונדריה מפוזרות באופן רנדומלי ברחבי התא , אלא שהן יהיו מחוברות לסיבים של שלד התא , שקובע את צורת ואופן הפיזור שלהם ברחבי הציטופלסמה בסוגי תאים שונים. בנוירונים למשל , מיטוכונדריה מיוצרות בגוף התא , אך לאחר מכן משונעות על גבי סיבי המיקרוטובולי לאורך האקסון עד שחלק מהם מגיעם עד לסינפסה. בתאים אחרים , נראה שסיבי שלד התא שקושרים את המיטוכונדריה מקבעים אותם למקום נייח בציטופלסמה , למשל בתאי זרע הוא יחזיק אותם ליד הפלג׳לה , ובתאי שריר שלד ולב , הן יהיו דחוסות בין המיופיברילות (פיגר 14-5)
מיטוכונדריה גם נמצאו מתאחות לעיתים עם אברונים אחרים דרך הממברנה שלהם , בייחוד כם הממברנה של ה ER. האיחוי הינו דינמי , ויוצר דומיינים מיוחדים שדרכם יש מעבר של ליפידים , סידן ומולקולות אחרות בין הממברנות. מסתבר שאותם אזורים בממברנת המיטוכונדריה שמתאחים עם ממברנת ה ER הם גם המוקד בוא המיטוכונדריה עוברים ביקוע.
אלולא המיטוכונדריה , ייצורים גדולי מימדים לא היו מסוגלים לשרוד , הפקת אטפ מגלוקוז דרך גליקוליזה אין בה כדי לספק להם את צורכיהם האנרגטיים. במיטוכונדריה הגלוקוז עובר פירוק מלא , לכדי מים ופחמן דו חמצני , ומיוצר ממנו פי 15 יותר אטפ ממולקולת גלוקוז נתונה שמתפרקת , רק באופן חלקי , בציטופלזמה דרך גליקוליזה.
14
Q
למיטוכונדריה יש שתי ממברנות:
אחת פנימית ואחת חיצונית.
A
שתי הממברנות נבדלות זו מזו בתכונות שלהן ובתפקידים , והן מייצרות מידור אינטרא-אברוני… כלומר כל אחת מהן מקיפה מדור ששונה בתכונותיו מהמדור השני.
הממברנה הפנימית: הרבה יותר מסיבית מהממברנה החיצונית , אינה חדירה , ועל גביה ישנם האנזימים המשתתפים בתהליך הנשימה התאית. הממברנה הזו תוחמת בתוכה את המטריקס המיטוכונדריאלי. הממברנה הפנימית מאופיינת בזה שיש בה המון קיפולים , אינבגינציות , שנקראים קריסטות (קריסטה ביחיד). על הקריסטות האלה נמצאים האנזימים של שרשרת מעבר האלקטרונים. בחלקים שאין בהם קריסטות , המבברנה הפנימית נמצאת במקבית לממברנה החיצונית , חלקים אלה בממברנה הפנימית נקראים ״ממברנת הגבול הפנימי״ או inner boundary membrane. בין חלקי ממברנת הגבול הפנימי לממברנה החיצונית (שהם פרללים אחד לשני) , ישנו מרווח קטן , בין 20 ל 30 ננומטר , שנקרא ״המרווח הבין ממברנלי״.
הקריסטות , שהן קיפולים של הממברנה כאמור , יכולות להיות בשתי צורות , דסקיות וטבולים , חלקם מכנסים עמוק אל תוך המטריקס , עובי הקריסטה הוא כ 20 ננומטר , והתוכן שלה נקרא crista space.
ממברנת הקריסטה , crista membrane הינה המשכית ל inner boundary membrane , בנקודת החיבור של שתי הממברנות נוצרים חריצים קטנים שנקראים crista junction.
הממברנה החיצונית: בדומה לממברנה החיצונית בחיידקים , גם הממברנה ה חיצונית של מיטוכונדריה הינה חדירה , היא חדירה ליונים , ולמולקולות קטנות (עד 5000 דלתון). החדירות של הממברנה החיצונית היא הודות לשכיחות הרבה של מבני ה porin , שזהו סוג מיוחד של פורות - aqueous pores , בעלות מבנה של חבית β שחוצות את הממברנה.
הודות לחדירות הגבוהה של הממברנה החיצונית , שיונים ומומסים יכולים לחצות אותה בקלות יחסית , התכולה היונית , לרבות ריכוז הפרוטונים , של החלל הבין ממברנלי , זהה לזו של הציטוזול , כך שמסביב לממברנה החיצונית אין גרדיינט אלקטרוכימי.
15
Q
פיגר 14-6
מבנה המיטוכונדריה
A
מיטוכונדריה וכלורופלסט הם מספיק גדולים עד כדי כך שניתן לראות אותם במיקרוסקופ אור (פלורסנטי) בתוך תאים חיים.
באיור , מובאים המיטוכונדריה דרך מיקרוסקופ אלקטרונים.
מרבית החלבונים שנמצאים במיטוכונדריה נמצאים במטריקס , מה שמותן לו גוון כהה במיקרוסקופ אלקטרונים , החללה בתוך הקריסטות , והחלל הבין ממברנלי נראים יותר בהירים הודות לתכולה דלה יותר של חלבונים.
בתוך הממברנה הפנימית אנחנו מבדילים בין שני מדורים , ה inner boundary membrane וה crista membrane.
במיטוכונדריה ישנם 3 חלחים:
- החלל הבין ממברנלי (תחום בממברנה החיצונית)
- החלל בתוך הקריסטות (תחום ב crista membrane)
- המטריקס (תחום בממברנה הפנימית)
16
Q
המיטוכונדריה הן מבנים דינמיים שעוברים ביקוע , איחוי , הפצה ודגרדציה.
A
בתאים יונקים , הגנום המיטוכונדריאלי מהווה פחות מ 1% מסך כל הדנא שקיים בתא. בתאים אחרים , שאינם יונקים , ייתכן שהדנא המיטוכונדריאלי או הפלסטידי יהיה יותר משמעותי , ויהווה חלק יותר גדול מסך כל הדנא בתא (טבלה 14-1).
אי לכך , נראה שביצורים האלה , בניגוד ליונקים , חלק מאד גדול מתהליכי סנתזת הרנא (שעתוק) והחלבון (תרגום) מתרחשים באברון עצמו!!
בהסתכלות על מיטוכנדריה של ייצורים חיים דרך מיקרוסקופ אור פלורסנטי , עולה התמונה כי מיטוכונדריה הם אברונים מאד דינמיים שעוברים מחזורים רבים של איחוי fusion, ביקוע fission , ושהם כל הזמן משנים את צורתם
(פיגר 14-7)
כשמיטוכונדריה עוברות ביקוע , יוצאים מהם אברונים קטנים יותר , הדבר חיוני ונחוץ ומשרת מטרות רבות. כאשר התא רוצה לשנע מיטוכונדריה לקצות האקסונים והדנדריטים הוא לוקח את המיטוכונדריה הקטנים שנוצרו בתהליך הביקוע ומשלח אותם ליעדים שלהם. כאשר תא יוקריוטי מתחלק , שני תאי הבת מקבלים מיטוכונדריה קטנים שהם תוצר של ביקוע שמתחלקים בינם. כמו כן , כאשר מיטוכונדריה צריכה לעבור דגרדציה mitochondrial autophagy , היא עוברת ביקוע והחלקים הקטנים שנוצרים הם אלה שמושמדים בתא.
תהליכי הביקוע והאיחוי הם תהליכים מורכבים , שחייבים להתרחש באופן שיבטיח שהמדורים השונים של המיטוכונדריה שתחומים בממברנות השונות לא יהרסו או יתערבבו , ושהמידור ישמר.
תהליכי הביקוע והאיחוי כמו כן שולטים במספר המיטוכונדריה שיש בתא נתון , ובצורתם , שיכולה להשתנות בין סוגי תאים שונים באופן דרמטי: מצורה ספרית , דרך צורה מוארכת דמויית תולעת , ועד לכדי רשתות מפותחות ומסועפות שנקראות reticulum.
לכל תהליך מבין השניים , הביקוע והאיחוי , יש סט חלבונים שונה שמבקר אותו:
ביקוע של המיטוכונדריה מתרחש כאשר נוצר אוליגומר הליקלי של חלבונים דמויי דינמין dynamin related GTPase שמקיף את המיטוכונדריה הטובולרית ומתלפף סביבה באזורים מסויימים (אותם אזורים שמתאחים עם ה ER) , ביקוע של הגטפ ע״י החלבונים דמויי הדינמין גורם לאוליגומר ההליקלי להתהדק סביב המיטוכונדריה , כך נוצר לחץ מכני מקומי שמבקע את המיטוכונדריה לשניים בבת אחת , גם את הממברנה החיצונית וגם את הפנימית בו״ז (פיגר 14-8).
באיחוי התמונה שונה מעט , כך שנדרש סט חלבונים אחד שמאחה בין הממברנות החיצוניות , וסט חלבונים אחר שיאחה בין הממברנות הפנימיות , לפי פיגר 14-9 , תחילה יש איחוי של הממברנות החיצוניות , ולאחר מכן של הפנימיות.
מיטוכונדריות פגומות , שהתא מבין שהם פגומות כאשר הן מאבדות את הגרדיינט האלקטרוכימי של הפרוטונים בממברנה הפנימית , עוברות פרגמנטציה רבה , הודות לתהליכי ביקוע רבים , אך מעט מאד תהליכי איחוי. במצב כזה המיטוכונדריה עוברת דגרדציה מבוקרת מאד דרך תהליך מיוחד של אוטופגיה שנקרא מיטופגיה שייחודי לאברונים mitophagy.
מנגנון אחד שגורם למיטופגיה הוא הפרעה ביבוא חלבונים אל המיטוכונדריה. ייבוא חלבונים למיטוכונדריה עושה שימוש , בין היתר , בגרדיינט האלקטרוכימי שקיים על הממברנה הפנימית , כך שהגרדיינט עוזר להכניס חלבונים דרכה. בהעדר הגרדיינט , החלבון PINK1 קינאז לא נכנס למיטוכונדריה אלא מוטמע על הממברנה החיצונית (המקום הלא תקין שלו) , פה הוא מזרחן שני חלבונים אחרים:
- PARKIN
- mitichondria associated ubiquitin
פרקין הוא רגולטור של מיטופגיה , כששני החלבונים מזורחנים הם מאתחלים יצירה של אוטופאגוזום שבולע מיטוכונדריה פגומות.
מוטציות בשני הגנים לחלבונים פרקין ופינק1 נמצאו בחולי פרקינסון רבים (מכאן השם) , בחולי פרקינסון אי לכך יש הצטברות של מיטוכונדריה פגומים.
17
Q
טבלה 14-1
A
רואים את האחוז הזניח שהגנום המיטוכונדריאלי מהווה בתא של עכבר (יונק) , ומנגד אחוז יותר משמעותי שהדנא המיטוכונדריאלי מהווה בשמר.
לשים לב שמבחינה מספרית , יש הרבה יותר מיטוכונדריה פר תא יונק מאשר תא שמר , אך בכל זאת מבחינת אחוזים הגנום המיטוכונדריאלי ביונקים הינו זניח.
18
Q
פיגר 14-7
A
מבנה ה reticulum של המיטוכונדריה בשמר.
האיזון שבין תהליכי ביקוע לבין תהליכי איחוי קובע את הצורה של הציטוכונדריה בתא נתון.
19
Q
פיגר 14-8
מודל לביקוע של מיטוכונדריה
A
דינמין הינו דימר מסיס שנמצא בציטוזול , כמה יחידות דימריות חוברות יחדיו , בתהליך שדורש גטפ , ליצירת אוליגומר.
האוליגומר נוצר באתרים מיוחדים על הממברנה והוא נקשר אליה דרך אדפטור. אתרי היווצרות האוליגומר הם גם האתרים בהם הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה מתאחה עם הממברנה של ה ER.
הדינמין בעצמו הוא GTPase , ביקוע של הגטפ על ידו מייצר את האנרגיה הנחוצה , שמהדקת את האוליגומר , מה שגורם לבסוף לתהליך הביקוע.
כאמור הביקוע חותך גם את הממברנה הפנימית וגם את החיצונית יחדיו.
20
Q
פיגר 14-9
A
איחוי של הממברנה החיצונית נעשה ע״י חלבון ממשפחת ה GTPase ספיציפי לממברנה החיצונית.
ג׳יטיפיאזות כאלה משתי הממברנות מתחברים יחדיו ליצירת אוליגומר (טרנסממברנלי) , כאשר מהיחידות באוליגומר מעוגנים לממברנות של המיטוכונדריה שעומדות להתאחות. איחוי של הממברנות החיצוניות של המיטוכונדריה דורש :
1) ביקוע גטפ (נדרש בריכוז נמוך)
2) גרדיינט פרוטונים מסביב לממברנה הפנימית.
איחוי של הממברנה הפנימית:
שתי הממברנות הפנימיות שעומדות להתאחות נקשרות זו לזו על ידי חלבונים דמויי דינמין dynamin related proteun שיוצרים אוליגומר (טרנסממברנלי) , כאשרים יחידות באוליגומר מעוגנות לממברנות. איחוי של הממברנה הפנימית דורש:
1) ביקוע של גטפ (נדרש בריכוז גבוה)
2) פוטנציאל חשמלי על הממברנה הפנימית.
21
Q
על הקריסטות של הממברנה הפנימית ישנם החלבונים של מערכת העברת אלקטרונים וסנתזת אטפ:
A
למרות ששתי המערכות הממברנליות , הקריסטות ו- ה inner boundary הם המשכיות זו לזו מבחינה מבנית , אלא שהן נבדלות אחת מהשניה ברמה הפונקציונלית:
הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה הינה סלקטיבית , ולא מאפשרת מעבר דיפוזי חופשי של יונים דרכה , בניגוד לממברנה החיצונית של המיטוכונדריה שהיא חדירה ומאפשרת מעבר דיפוזינשל יונים דרכה. בכך , הממברנה הפנימית במיטוכונדריה דומה יותר לממברנה הפנימית של חיידקים שגם היא סלקטיבית.
אז למה הממברנה הפנימית כן חדירה ?
- ליונים מסויימים כגון פרוטונים ופוספט
- מטבוליטים כגון אטפ ואדפ
- פירובט
כל אלה חוצים את הממברנה דרך טרנספורטרים ממברנליים.
הממברנה הפנימית , כמו כן , מחולקת ברמה הפונקציונלית לאזורים מתמחים. כל אזור בממברנה מכיל סט מסויים של חלבונים ואנזימים ועל כן מתמחה במסלולים מטבולים ספציפיים. באזורים אחרים יש סט אנזימים אחר , ועל כן התמחות במסלולים אחרים.
אז אלו אנזימים נמצאים על הקריסטות ? ובתוך כך אילו תהליכים מתקיימים בה ?
1) האנזים ATP synthase , זהו האנזים שמייצר את האטפ במיטוכונדריה , ולמעשה את מרבית האטפ בתא. סבורים שהקומפלקס הזה מסייע בהחזקת המבנה המקופל של הקריסטות.
2) אנזימי ה respiratory chain , שהם חלבוני מערכת העברת האלקטרונים.
אי לכך , והודות לנוכחות קומפלקסי הענק האלה , החלק של הקריסטות בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה מכילות את היחס הגדול ביותר של חלבונים לעומת שומנים לפי משקל:
75% מהרכב הממברנה (לפי משקל) בקריסטות הוא חלבונים , ורק 25% הם שומנים.
אם כך , אז מה יש על ה inner boundary membrane ?
על החלק הזה של הממברנה הפנימית נמצא 3 מערכות אנזימטיות:
- protein import machinery
- new membrane protein insertion machinery
- machinery for Assembly of
respiratory chain complexes.
האזור שנקרא cristae junctions , היכן שהקריסטות וה inner boundary מתחברים , ישנו קומפלקס חלבוני שפועל כמחסום , ומונע מהחלבונים והאנזימים של הקריסטות לנדוד ל inner boundary ולהפך. הסברה היא שהחלבונים האלה הם גם אלה שמעגנים את הקריסטות לממברנה החיצונית , וכך מחברים בין שתי הממברנות יחדיו ושומרים על המבנה המקופל של הקריסטות.
22
Q
בשלב הזה יש חלקים חופפים עם ביוכימיה , נקבל על זה מצגת בנפרד.
A
23
Q
למיטוכונדריה יש תפקידים רבים במטבוליזם של התא:
A
7) למיטוכונדריה כמו כן תפקיד מרכזי בסנתזת ליפידים של הממברנה. קרדיוליפין cardiolipin הינו פוספוליפיד דו ראשי שמיוצר במיטוכונדריה (מכיל 4 זנבות פחמימניים) , ונמצא אך ורק בממברנה המיטוכונדריאלית ולא בשום מקום אחר בתא.
מלבד קרדיוליפין שמיוצר במיטוכונדריה ונמצא רק בה , המיטוכונדריה מייצרת עוד מספר ליפידים מבניים של הממברנות השונות של התא לרבות הציטופלסמטית:
- פוספטידיל-אתנול-אמין
- פוספטידיל-גליצרול
- חומצה פוספטדית
כל אלה מיוצרים במיטוכונדריה , בעוד פוספוליפידים כמו:
- פוספטידיל-אינוזיטול
- פוספטידיל-כולין
- פוספטידיל-סרין
מסונתזים בעיקר ב ER.
מרבית הממברנות של התא מיוצרות ב ER , כאשר בין המיטוכונדריה ל ER מתקיים שחלוף של הליפידים האלה , כאשר הממברנות של שני האברונים האלה מתאחות יחדיו (כאמור באזורים סםיציפיים).
שקף 19
פיגר 14-11
24
Q
פיגר 14-11
המבנה של קרדיוליפין
A
קרדיוליפין הוא למעשה שני פוספוליפידים שקשורים זה לזה באופן קוולנטי , כך שבסך הכל , במבנה של מולקולת קרדיוליפין אחת ישנם 2 ראשים פוספטים , ו- 4 זנבות של ח. שומן ולא 2 בדומה לפוספוליפידים אחרים.
פוספטידיל-כולין ופוספטידיל-אתנול-אמין הם שני הפוספוליפידים הכי שכיחים בממברנה של המיטוכונדריה , כל אחד בעלעל שלו.
כאמור קרדיוליפין מיוצר במיטוכונדריה , בממברנה הפנימית הוא נמצא באינטראקציה עם האנזימים שעושים פוספורילציה אוקסידטיבית וכן טרנספורטרים של אטפ. המבנה הלא רגיל שלו תורם לאחזקת הקיפולים הרבים של הקריסטות.
לפי הציור , הוא נמצא רק בעלעל החיצוני של הממברנה !?
פוספטידילגלצרין הוא שם כולל של משפחת פוספוליפידים:
פוספטידיל-כולין + פוספטידיל-אנוזיטול שייכים למשפחה הזאת. לפי מה שכתוב בספר הם בעיקר מיוצרים ב ER , בעוד פוספטידיל-גליצרול עצמו בעיקר מיוצר במיטוכונדריה !! ההנחה שלי היא שה backbone כלומר הפוספטידיל-גליצרול מיוצר במיטוכונדריה , ואז עובר ל ER הודות לאיחוי של הממברנות של שני האברונים , שם מתווספים עליו קבוצות הראש כולין ואנוזיטול.
25
חוזרים לפרק 12:
טרנספורט של חלבונים למיטוכונדריה ולכלורופלסט:
שני האברונים הנ״ל מכילים ממברנה כפולה (שתי ממברנות דו שכבתיות) , ומתמחים בין היתר , ביצירת אטפ.
במיטוכונדריה יצירת האטפ היא בעזרת **אנרגיה שמתקבלת בשרשרת מעבר האלקטרונים + פוספורילציה אוקסידטיבית.** בכלורופלסט האנרגיה ליצירת אטפ מתקבלת מפוטוסנתזה.
למרות ששני האברונים מכילים דנא משל עצמם , ריבוזומים , ועוד מרכיבים אחרים שחיוניים ליצירת חלבונים , בפועל רק חלק קטן מהחלבונים שלהם מיוצרים בהם (ביונקים רק 1%) , כשכמעט כל החלבונים שנמצאים ופועלים בהם **מקודדים בגרעין של התא , ומיוצרים בציטוזול** , ורק לאחר מכן מיובאים אליהם (99%).
כידוע לנו , הממברנה הכפולה של האברונים האלה מייצרת מידור נוסף בתוך האברון עצמו , כך שהחלבונים שצריך לייבא מהציטוזול , לא רק שצריכים להגיע לאברון עצמו , אלא שצריכים להגיע לתת המדור הנכון בתוך האברון.
בכלורופלסט יש ממברנה כפולה גם כן , הסטרומא stroma מקבילה למטריקס במיטוכונדריה. בכלורופלסט קיים מדור שלישי , שאין לו מקבילה במיטוכונדריה , נקרא החלל התילוקואידי thylakoid space שתחום בממברנה התילקואידית.
**הממברנה התילקואידית במקור נוצרת מהממברנה הפנימית של הכלורופלסט** , שבתהליך הבשלת הפלסטיד חלק ממנה מתנתק והופך להיות מדור בפני עצמו , כאמור החלל התילקואידי.
כל תת מדור בשני האברונים האלה מכיל סט חלבונים מיוחד וספיציפי לו.
מיטוכונדריה וכלורופלס חדשים לא נוצרים יש מאין , אלא שהם נוצרים מאברונים קיימים , האברונים האלה קודם כל גדלים ולאחר מכן מנצים מהם האברונים החדשים בתהליך של fission , כאשר תהליך הגדילה של האברון הקיים דורש ייבוא של חלבונים רבים מהציטוזול.
26
פיגר 12-47
החללים השונים של מיטוכונדריה וכלורופלסט
במיטוכונדריה רואים שהחלל שבין שתי הממברנות , הפנימית והחצונית , מורכב משני
חלקים :
1) החלל הבין ממברנלי intermembrane
space
2) חלל הקריסטות crista space
רואים כת החלל התילקואידי בכלורופלסט , שבניגוד לחלל הקריסטות , נפרד לחלוטין מהממברנה הפנימית ואינו קשור אליה.
27
הטרנסלוקציה למיטוכונדריה תלויה בשני דברים:
- רצף סיגנל
- טרנסלוקטורים ממברנליים
(וכן גרדיינט פרוטונים מסביב לממברנה הפנימית).
בסך הכל , ישנו מספר מועט מאד של רצפי סיגנל שמנחים ייבוא חלבונים מהציטוזול למיטוכונדריה , ובתוך כך , גם למדורים השונים שלה. רצפים אלה מזוהים על ידי מגוון הטרנסלוקטורים הממברנליים שבתורם מכניסים את חלבוני ה cargo ליעד שלהם.
1) החלבונים שמיועדים **למטריקס** המיטוכונדריאלי מכילים רצף סיגנל בקצה ה N- טרמינלי שלהם , הרצף הזה מהר מאד נחתך ומוסר ברגע שהם מגיעים למטריקס ע״י **סיגנל פפטידאזות**.
2) **כל** החלבונים שמיועדים לממברנה החיצונית , **חלק גדול** מהחלבונים שמיועדים לממברנה הפנימית , וחלבונים שמיועדים למרווח הבין ממברנלי מכילים רצף סיגנל **אינטרלי** (כלומר לא נמצא הקצה) **שאינו מוסר** גם אחרי שהחלבון מגיע לייעד שלו.
רצף הסיגנל הוא גם **הכרחי וגם מספיק** כדי שתהיה לוקליזציה תקינה של החלבון במיטוכונדריה. כאשר במעבדה שמים את רצף הסיגנל על חלבון רנדומלי בציטוזול , נראה שהחלבון יגיע למדור הנכון במיטוכונדריה (גם אם במקור החלבון אינו מיועד למיטוכונדריה) הדבר נעון גם עבור אברונים אחרים שמקבלים חלבונים במנגנון של טרנסלוקציה.
אמרנו שהטרנסלוקציה למיטוכונדריה תלויה בשני גורמים , רצף סיגנל על חלבוני ה cargo וכן טרנסלוקטורים. הטרנסלוקטורים הם חלבונים מרובי תת יחידות multisubunit שפועלים גם כדי להכניס את ה cargo דרך הממברנות השונות לחללים ולמדורים הנכונים , וגם כדי להטמיע את חלבון ה cargo בתוך הממברנה הרלוונטית.
כעיקרון , כל טרנסלוקטור יודע לזהות סוג ספיציפי של רצף סיגנל , ולאחר מכן הוא (הטרנסלוקטור) גם משמש בתור המוליך שמכניס את חלבון ה cargo לאתר המתאים. חלק מהטרנסלוקטורים קיימים בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה , חלקם האחר בממברנה הפנימית , וביחד , מערך הטרנסלוקטורים המיטוכונדריאליים יודעים לנתב כ 1500 סוגי חלבונים שונים מהציטוזול למיטוכונדריה ולמדורים שלה.
**הסידור** של רצפי הסיגנל (על חלבון נתון ייתכן יותר מרצף סיגנל יחיד) קובע לאילו טרנסלוקטור/ים ה cargo יקשר , וכן לאיזה ייעד סופי החלבון ילך.
נוכחות טרנסלוקטורים שונים וכן רצפי סיגנל שונים , אומר שלמדור מסויים בממברנה ייתכן יותר מנתיב הגעה אחד , כך שלממברנה הפנימית לצורך העניין ניתן להגיע דרך **שלשה** מסלולים שונים.
28
היעדים השונים במיטוכונדריה אליהם מגיעים חלבוני cargo מהציטוזול:
- הממברנה החיצונית
- החלל שבין שתי הממברנות שמחולק לחלל הבין ממברנלי + לחלל הקריסטה
- הממברנה הפנימית
- המטריקס
29
פיגר 12-48
מסלולי ה import המטוכונדריאליים השונים.
1) הקומפלקס TOM , אחראי על הייבוא של **כמעט כל** החלבונים המיטוכונדריאליים שמקודדים בגרעין , ומיוצרים בציטוזול. רואים באיור שהכניסה עבור מרבית החלבונים למדורי המיטוכונדריה השונים , לרבות הממברנות השונות , מתחילה במעבר דרך קומפלקס טום. הוא מזהה את רצף הסיגנל של חלבוני ה cargo , ואז **מכניס אותם כצעד ראשון מהציטוזול לחלל הבין ממברנלי**.
=>
מהחלל הבין ממברנלי (פריפלסמטי) , חלבונים שונים , כתלות ביעד שלהם ובסיגנל שיש עליהם הולכים בנתיבים שונים - או שהם נשארים בחלל הבין ממברנלי , או שהם עוברים לקומפלקס Sam , או שהם עוברים לקומפלקסים של הממברנה הפנימית:
2) חלבונים בעלי צורת חווית β **ששכיחים במיוחד בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה** מועברים מ TOM ל SAM , שמטמיע אותם בממברנה החיצונית.
3) חלבונים שאינם מיועדים לממברנה החיצונית ממשיכים הלאה מ TOM ומגיעים לטרנסלוקטורים של הממברנה הפנימית:
TIM23 , TIM22 , OXA
**לשים לב שאין מעבר ישיר בין טום ל oxa** , חלבונים ציטוזוליים שמגיעים מטום ל oxa , עושים זאת דרך מעבר בקומפלקס tim23 תחילה.
@ חלבונים שמיועדים **למטריקס** , מועברים מ TOM ל TIM23 וזה משחיל אותם , דרך הממברנה הפנימית , למטריקס.
@ חלבונים שלא מיועדים למטריקס המיטוכונדריאלי אלא מוטמעים בממברנה הפנימית יכולים לעשות את זה כאמור דרך 3 טרנסלוקטורים שונים:
- TIM23
- TIM22
- OXA
רק 1% מהחלבונים שבמיטוכונדריה מיוצרים בה , השאר מיובאים מהציטוזול. אלו מסונתזים ע״י ריבוזומים מיטוכונדריאליים ואז **מוטמעים בממברנה הפנימית** אך ורק דרך קומפלקס OXA.
החלבונים שמיוצרים במיטוכונדריה , ועתידים להיטמע בממברנה הפנימית , מתחברים עם חלבונים שיובאו מהציטוזול , ליצירת קומפלקסים פונקציונליים כאלה ואחרים , כמו למשל חלבוני שרשרת הנשימה התאית ששותפים בתהליך יצירת האנרגיה בתא.
30
פיגר 12-48
עובדות שלא ידעתם על טרנסלוקטורים מטוכונדריאליים:
1) ששה חלבונים מהווים טרנסלוקטורים מיטוכונדריאליים שמנתבים חלבונים שונים (כ 1500) ליעד הסופי שלהם במיטוכונדריה:
- **בממברנה החיצונית:**
TOM , SAM , MIM1
- **בממברנה הפנימית:**
TIM23, TIM22 , OXA
כולם חלבונים טרנסממברנליים וכולם חלבונים **מולטימריים**.
2) החלק ב TIM23 וב TIM22 שמהווה את תעלת המעבר (דרכה מתרחשת הטרנסלוקציה) דומים גם **מבחינה מבנית** ולא רק תפקודית , מה שמלמד על מקור אבולוציוני משותף של השניים.
3) בחלק שפונה למטריקס , TIM23 מחובר לחלבון ממשפחת ה ATPase שקשור אליו , ומסייע בהכנסת החלבונים למטריקס. ה ATPase הזה , שפועל כ import ATPase הוא למעשה החלבון hsp70 שמבקע אטפ ומשתמש באנרגיה שלו כדי למשוך חלבונים פנימה למטריקס.
4) בתאים אנימליים , בסוגי תאים שונים ייתכן שנמצא הרכב שונה **במעט** של תת היחידות שמרכיבות כל קומפלקס , כדי להתאים לצורכי התא הספיציפיים.
בשקף , בציור הקטן , רואים מסלולים שונים שבהם חלבונים יכולים להגיע ליעד שלהם:
1) חלבון שמיועד להיטמע בממברנה החיצונית יעשה זאת דרך שני מסלולים אלטרנטיביים:
- כניסה דרך TOM למרווח הבין ממברנלי , משם הוא הולך ל SAM וזה בתורו מטמיע אותו בממברנה החיצונית.
- החלבון מגיע מראש לקומפלקס MIM1 , וזה מטמיע אותו בממברנה החיצונית בלי מעבר בקומפלקס Sam ובחלל הבין ממברנלי.
2) חלבונים שמיועדים להיטמע בממברנה הפנימית עושים זאת דרך 3 קומפלקסים:
TIM23 , TIM22 , OXA
כאשר שני ה TIM , מטמיעים חלבונים שהגיעו מקומפלקס TOM דרך החלל הבין ממברנלי בממברנה הפנימית.
קומפלקס OXA מטמיע חלבונים בממברנה הפנימית בשני אופנים:
- חלבונים שנוצרו מראש במטריקס ואז ישירות דרכו מוטמעים בממברנה הפנימית.
- חלבונים שהגיעו מהציטוזול , נכנסו למטריקס דרך TOM ואז TIM23 , ובשלב האחרון קומפלקס OXA מחדיר אותם לממברנה הפנימית.
חלבונים ציטוזוליים שמיועדים למטריקס יכולים להגיע אליו רק דרך TIM23.
31
ייבוא חלבונים מיטוכונדריאליים מהציטוזול נעשה באופן **פוסט-טרנסלטורי** , כאשר החלבונים **אינם מקופלים**.
חלבונים שמיוצרים ב ER (נדון בהם בהמשך) , מיוצרים באופן שאנו מגדירים **כטרנסלוקציה קו-טרנסלטורית**. כלומר זמן קצר אחרי שהחלבון מתחיל להיווצר בריבוזום חופשי בציטוזול , כשרק הקצה האמיני שלו מבצבץ מהריבוזום , כל המערך - הריבוזום ביחד עם החלבון שנוצר בו - מיובאים ל ER ונקשרים עליו מבחוץ , מה שנותן ל ER את המראה המחוספס שלו. **הריבוזום עצמו נקשר לטרנסלוקטור על ממברנת ה ER**, ובו בזמן החלבון מסונתז ומתארך פנימה אל תוך הלומן של ה ER , כך שהתרגום והטרנסלוקציה מתרחשים במקביל.
במיטוכונדריה זה שונה , **הטרנסלוקטורים המיטוכונדריאליים אינם קושרים ריבוזומים**. אי לכך , חלבונים מיובאים למיטוכונדריה מהציטוזול רק אחרי שהם סיימו להתרגם , והם מיובאים בצורת שרשרת פוליפפטידית פתוחה , **ישרה** , ולא מקופלת.
הדבר לא אומר שאין בכלל ריבוזומים שקשורים לממברנת המיטוכונדריה מבחוץ , אלא שהמסלול העיקרי ב import מיטוכונדריאלי הוא מסלול פוסט-טרנסלטורי , ועל כן **ניתן למצוא מספר זעום ביותר של ריבוזומים** שקשורים למיטוכונדריה מבחוץ.
לאחר שחלבוני cargo המיועדים למיטוכונדריה תורגמו במלואם , מגיעים חלבונים מסיסים שנמצאים בציטוזול ונקשרים אליהם , תפקיד החלבונים האלה הוא למנוע מחלבוני ה cargo להתקפל , וכן מונעים מהם ליצור אגרגטים כדי שיגיעו בצורה ישרה למיטוכונדריה. חלק מהחלבונים הציטוזוליים האלה הם שפרונים **כלליים** ממשפחת ה hsp70 , **וחלקם האחר הם חלבונים יעודיים רק ל import מיטוכונדריאלי** שיודעים לזהות ולקשור את רצף הסיגנל שקיים על חלבוני ה cargo למיטוכונדריה.
בשלב הבא , כל הקומפלקס הזה: חלבון ה cargo/שפרוני hsp70/והחלבונים הציטוזוליים היעודיים מגיעים מהציטוזול למיטוכונדריה. פה , **רצף הסיגנל** של חלבון ה cargo מזוהה ע״י אזור בטרנסלוקטור TOM שפועל כרצפטור ונקשר אליו , ברגע שרצף הסיגנל והרצפטור שעל טום נקשרים , מתחיל תהליך ההכנסה של ה cargo , תחילה נכנס רצף הסיגנל עצמו , ובעקבותיו שאר החלבון מושחל פנימה דרך תעלת הטרנסלוקציה של TOM אל תוך החלל הבין ממברנלי (פיגר 12-48 + פיגר 12-49).
בזמן שחלבון ה cargo מוכנס פנימה , כל החלבונים הציטוזוליים היעודיים + השפרונים hsp70 שקשרו אותו בציטוזול ומנעו ממנו להתקפל מוסרים ממנו , וכך ה cargo נכנס דרך TOM אל החלל הבין ממברנלי.
ברגע שחלבון ה cargo נכנס לחלל הבין ממברנלי , רצפי סיגנל נוספים שיש עליו קובעים מה יעלה בגורלו.
ניתן במעבדה להקפיא מיטוכונדריות באופן מהיר , וכך לעצור את תהליך הטרנסלוקציה באמצע לפני שהוא הושלם , בשיטה זו התקבל הממצא הבא:
כאשר הקפיאו את התהליך ראו שחלבונים שמיועדים למטריקס , חוצים בו זמנית את שתי הממברנות של המיטוכונדריה , כאשר הקצה ה N-טרמינלי של חלבון ה cargo נמצא במטריקס , ובו בזמן הקצה ה C- טרמינלי מבצבץ החוצה מהמיטוכונגריה לציטוזול. מסתבר גם כן לפי הממצאים שרצף הסיגנל בחלבונים כאלה שמיועדים למטריקס נמצא בקצה ה N טרמינלי של חלבון ה cargo , וברגע שהקצה הזה מגיע למטריקס , signal peptidase שישנו שם חותך אותו , בזמן הזה כפי שתיארנו , הקצה ה C טרמינלי עודנו בחוץ. מכאן ניתן להגיע למסקנה שרצף הסיגנל של חלבונים המיועדים למטריקס נמצא בקצה ה N טרמינלי , והוא נכנס ראשון דרך TOM , ממנו מגיע ל TIM23 , וממנו למטריקס ושם הוא נחתך (פיגר 12-49).
בדרך כלל נראה ששני הקומפלקסים TOM ו- TIM23 עובדים יחדיו ומעבירים חלבוני cargo ביחד דרך שתי הממברנות. במעבדה גילו שהדבר אינו אובליגטורי וכל קומפלקס מסוגל לבד לעשות טרנסלוקציה ללא נוכחות הקומפלקס השני.
אם מפרקים מיטוכונדריה ומשאירים רק את הממברנה החיצונית נוכל לראות ש TOM לבד מסוגל להעביר דרכה חלבונים , וכך גם לגבי TIM23 כאשר מקלפים את הממברנה החיצונים ממיטוכונדריה.
32
מרבית מה שידוע לנו על טרנסלוקציה מיטוכונדריאלית התקבל דרך ממצאים ניסויים:
- במבחנה פזרו חלבונים כאלה ואחרים ומיטוכונדריות שמיצאו מתאים , ולפי כל ראו איזה סיגנלים על חלבוני ה cargo משתתפים בתהליך
- ניתן בכלים מעבדתיים לקרר במהירות רבה מיטוכונדריות במבחנה , ולפי כך לעצור את תהליך הטרנספורט בכל מיני שלבי ביניים.
-
33
פיגר 12-49
שלשה דברים:
1) החלק ה C טרמינלי של החלבון שנמצא בציטוזול במהלך הטרנסלוקציה עדיין יקשרו אליו שפרונים כל עוד הוא בחוץ.
2) רצף הסיגנל ברגע שהוא מחתך עובר ישר דגרדציה
3) השפרונים hsp70 יורדים מה cargo ע״י ביקוע אטפ.
34
ייבוא חלבונים למיטוכונדריה דורש אנרגיה מ 3 מקורות שונים: ביקוע אטפ , פוטנציאל **חשמלי** ופוטנציאל חמצון חיזור של הממברנה הפנימית:
טרנספורט **כיווני** של חלבונים דורש אנרגיה , ובתוך כך , גם ייבוא חלבונים מהציטוזול למיטוכונדריה.
כדי ליבא חלבונים למיטוכונדריה , נדרשת השקעת אנרגיה ב 4 שלבים שונים בתהליך , מ 3 מקורות שונים.
מקורות האנרגיה הנחוצה ל import של חלבונים למיטוכונדריה הם:
- ביקוע אטפ ע”י שפרונים
- פוטנציאל **חשמלי** של הממברנה הפנימית
- פיטונציאל חמצון חיזור בממברנה הפנימית (שנוצר בשרשרת מעבר האלקטרונים).
כאמור , האנרגיה הזאת נדרשת ב 4 שלבים שונים של ה import והם:
1) **השלב הראשון:** שמירה על החלבון פתוח ולא מקופל בציטוזול לפני הגעתו למיטוכונדריה , **נעשה דרך ביקוע אטפ**. החלבונים שמשתתפים בתהליך , השפרונים hsp70 , עושים שימוש באנרגיית אטפ באופן מחזורי: הם קושרים מולקולות אטפ ומפרקים אותם שוב ושוב ובכך שומרים על החלבון ישר ופתוח ומונעים ממנו להתקפל (זה שיש להשקיע אנרגיה בשמירת החלבון פתוח מלמד שהקיפול שלו הוא תהליך ספונטני). כמו כן , בהגעת החלבון למיטוכונדריה , ברגע שהוא מתחיל להיכנס אליה דרך TOM , השפרונים שקושרים את הזנב שלו שעדיין נמצא בציטוזול מתחילים לרדת בהדרגה , **הניתוק שלהם הוא גם תהליך הדורש אטפ.**
2) **השלב השני**: ברגע שהחלבון התחיל להיכנס אל המיטוכונדריה דרך קומפלקס TOM , חוצה את החלל הבין ממברנלי , ונכנס אל TIM23 , הפוטנציאל החשמלי של **הממברנה הפנימית** דוחף אותו עוד יותר פנימה. בפיגר 12-50 אנחנו רואים שהעלעל החיצוני של הממברנה הפנימית טעון חיובית יחסית לעלעל הפנימי. הפרש זה **במטענים** מסביב לממברנה מהווה את החלק **האלקטרי** של הגרדיינט האלקטרוכימי של **פרוטונים** שנוצר מסביב לממברנה הפנימית. גרדיינט אלקטרוכימי זה נוצר בצימוד למעבר האלקטרונים בשרשרת מעבר האלקטרונים בממברנה הפנימית , כאשר מעבר האלקטרונים בשרשרת מייצר את הכח המניע שמוציא פרוטונים מהמטריקס אל המרווח הבין ממברנלי , הצטברות פרוטונים שם מקנה לממברנה בצידה החיצוני מטען חיובי. הכח שאצור בגרדיינט (ספיציפית החלק האלקטרי שלו כלומר הפרש המטענים ולא הריכוזים) משמש ככח מניע שדוחף את חלבון ה cargo פנימה. הדבר מתאפשר הודות לנוכחות ח״א חיוביות ברצף הסיגנל בקצה האמיני של החלבון , מטענם החיובי נדחה ע״י המטענים החיוביים של הממברנה מבחוץ וזה דוחף את חלבון ה cargo פנימה.
3) **השלב השלישי**: ברגע שקצה חלבון ה cargo מגיע למטריקס , שפרון מיטוכונדריאלי ממשפחת hsp70 נכנס לתמונה ומושך אותו פנימה (בדומה ל bip ב ER). hsp70 מיטוכונדריאלי נמצא קשור ל TIM23 בחלקו שפונה למטריקס (פיגר 12-48) , הוא מבקע מולקולת אטפ , מה שמשרה בו שינוי קונפורמציה ,שינוי זה מייצר את הכח הנחוץ כדי שהשפרון **ימשוך** את החלבון פנימה. hsp70 עובר מספר מחזורים של ביקוע אטפ-שינוי קונפורמציה-משיכת ה cargo פנימה , עד שכל החלבון נכנס למטריקס. בשלב זה , חלק מחלבוני המטריקס (אך לא כולם) נקשרים לשפרון מיטוכונדריאלי אחר שנקרא hsp60 שמסייע בקיפול שלהם , ובכך הם נשארים במטריקס.
4) **השלב הרביעי**: מסלול שעושה שימוש **בהפרש בפוטנציאלי החימצון-חיזור שקיימים בין הציטוזול למיטוכונדריה**. מסלול זה משמש חלבונים שהייעד שלהם הוא המרווח הבין ממברנלי. לחלק מחלבונים אלה יש **מוטיב של צסטאין** במבנה שלהם , בעודם בציטוזול , הצסטאינים נמצאים במצב מחוזר SH , ברגע שחלבון ה cargo מתחיל להיכנס דרך קומפלקס TOM אל המרווח הבין ממברנלי , פוגש אותו שם חלבון שנקרא mia40 , mia40 יודע לחמצן את הצסטאינים וליצור איתם קשרים קוולנטים (דיסולפידיים) **זמניים**, היווצרות קשרים זמניים אלה בין הצסטאינים של ה cargo ל mia40 מונעת מה cargo לצאת חזרה לציטוזול דרך TOM , אחרי שכל ה cargo נכנס למרווח הבין ממברנלי , הוא מתנתק מ mia40 ונותר במצבו המחומצן SS , **כך שכעת בתוכו ישנם גשרים דיסולפידיים** , במצב זה שהוא מקופל , חלבון ה cargo נשאר לכוד בתוך המרווח הבין ממברנלי ולא מצליח לצאת ממנו.
בזמן ש mia40 מחמצן את ה cargo הוא בעצמו הופך להיות מחוזר (מכיל אלקטרונים) , חמצון חוזר שלו מתרחש ע״י זה שהוא מוסר אלקטרונים אל שרשרת מעבר האלקטרונים בממברנה הפנימית.
חלבוני hsp70 , גם הציטוזוליים וגם המיטוכונדריאליים הם בעלי אפיניות גבוה לשרשראות פוליפפטידיות גבוהות , כלומר , לחלבונים לא מקופלים.
35
שקף 12-50
אנרגיה , ותפקידה ב import של חלבונים למיטוכונדריה.
36
טרנספורט לממברנה הפנימית של המיטוכונדריה מתרחש דרך מספר מסלולים:
בממברנה הפנימית ישנם 3 טרנסלוקטורים:
TIM23, TIM22, OXA
**לשלשתם יש את היכולת להטמיע חלבונים בממברנה** (כלומר לשלשתם יש העברה לטרלית) , כל אחד מהם פועל במסלול שונה מהרגע שהוא מקבל את חלבון ה cargo ועד הרגע שהוא מטמיע אותו בממברנה.
1) **המסלול הכי נפוץ** להטמעת חלבונים בממברנה הפנימית הוא דרך TOM ו- TIM23. במסלול הזה חלבון ה cargo מגיע מהציטוזול , הוא מתחיל להשתחל דרך קומפלקס TOM , תחילה דרך רצף הסיגנל שלו בקצה האמיני , ובעקבותיו שאר החלבון. מ TOM הוא מגיע ל TIM23 ומשתחל דרכו למטריקס , **אולם במסלול זה אך ורק הקצה האמיני של החלבון נכנס למטריקס** הודות לנוכחות רצף סיגנל אנטרלי שמורכב **מחומצות אמינו הידרופוביות** שעוצרות את הטרנסלוקציה. המיקום האסטרטגי של חומצות האמינו הללו ישר אחרי רצף הסיגנל האמיני מזוהה ע״י TIM23 כדומיין טרנסממברנלי של חלבון ה cargo , אי לכך , במקום ש TIM23 ימשיך בטרנסלוקציה של החלבון אל המטריקס , **הוא עושה לו העברה לטרלית** , דרך שער צדדי שיש לו , דרכו הוא מעביר את החלבון הצידה אל תוך הממברנה ומטמיע אותו בתוכה. שאר החלבון ממשיך להיכנס דרך TOM אל המרווח הבין ממברנלי , ורצף הסיגנל ה N טרמינלי נחתך במטריקס. כך אנחנו מקבלים חלבון שקשור לממברנה הפנימית , כשקצהו הקרבוקסילי נמצא במרווח הבין ממברנלי , וקצהו האמיני נמצא במטריקס.
2) מסלול ההעברה השני , הינו מסלול ייחודי להטמעת **רצפטורים** של מולקולות **קטנות** בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. הרצפטורים הנ״ל הינם סלקטיבים ומשמשים להעברת סובסטרטים עבור אנזימים מטבוליים שנמצאים **במטריקס** של המיטוכונדריה , וכן להעברת התוצרים של האנזימים הללו חזרה לציטוזול. דוגמה לכך הם האנזימים שפועלים במעגל החומצה הציטרית (מעגל קרבס) , אנזימים אלו שוכנים **במטריקס** של המיטוכונדריה , הם מקבלים סובסטרטים מהציטוזול דרך הרצפטורים הנ״ל , ומעבירים דרכם את התוצרים שלהם חזרה לציטוזול.
חלבונים אלו מתאפיינים בכך שהם **multipass** , כלומר חוצים את הממברנה מספר פעמים , אי לכך , הם חייבים להכיל מספר דומיינים הידרופוביים דרכם הם יוטמעו בממברנה.
**חלבונים אלה אינם מכילים רצף סיגנל בקצה ה N טרמינלי כלל וכלל** , אלא שמדובר במספר רצפים **פנימיים** של חומצות אמינו , שמשמשות אותם כדי להיכנס **בשלמותם** דרך קומפלקס TOM אל המרווח הבין ממברנלי. בהגיעם למרווח הבין ממברנלי , הם פוגשים שפרון שמנחה אותם לקומפלקס TIM22 ,שמטמיע אותם , דרך הדומיינים ההידרופוביים , בממברנה.
הכח המניע שפועל במסלול הזה הוא הפוטנציאל החשמלי של הממברנה , תפקידו הוא להבטיח כניסת המקטעים הנכונים של השרשרת הפוליפפטידית (ה cargo) אל המטריקס , בעוד מקטעים אחרים נמצאים במרווח הבין ממברנלי , ובינהם החלקים הטרנסממברנליים.
3) **המסלול השלישי והאחרון** להטמעת חלבונים בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה פועל דרך קומפלקס OXA. **לקומפלקס OXA ניתן להגיע אך ורק דרך המטריקס** , הוא אינו מקבל חלבונים מהמרווח הבין ממברנלי (כמו TIM22) או מ TOM (כמו TIM23).
קומפלקס OXA יודע להטמיע שני סוגי חלבוני בממברנה הפנימית:
- חלבונים ממקור מיטוכונדריאלי
- חלבונים ממקור נוקליאלי.
**חלבונים ממקור מיטוכונדריאלי**: 1% מהחלבונים במיטוכונדריה מיוצרים בה , אלו מיוצרים במטריקס ע״י ריבוזומים מיטוכונדריאליים , מדנא מיטוכונדריאלי. OXA הוא הקומפלקס היחיד שיודע להטמיע חלבונים מהסוג הזה בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה.
**חלבונים ממקור נוקליאלי**: 99% מחלבוני המיטוכונדריה מגיעים אליה מבחוץ , הם מקודדים בגרעין התא , ומסונתזים **בשלמותם** ע״י ריבוזומים ציטוזוליים (חופשיים). במסלול הזה , חלבוני ה cargo , מתחילים להשתחל , דרך רצף הסיגנל ה N-טרמינלי שלהם , בתעלת הטרנסלוקציה של TOM , עוברים דרך TIM23 , ולבסוף נכנסים בשלמותם למטריקס. במטריקס רצף הסיגנל ה N-טרמינלי נחתך , ובכך נחשף רצף סיגנל אחר , **הידרופובי** , שמזוהה ע״י OXA ומשמש אותו כדי להטמיע את חלבון ה cargo מהמטריקס לממברנה הפנימית.
**רצף סיגנל N-טרמינלי:** נוכחות הרצף הזה על חלבון ציטוזולי תכוון את החלבון למטריקס של המיטוכונדריה. כשהוא נמצא לבד , חלבוני ה cargo אכן יגיעו **למטריקס** , דרך שני הקומפלקסים TOM ו TIM23. נוכחות רצפי סיגנל נוספים בשרשרת הפוליפפטידית , למשל רצף חומצות אמינו הידרופוביות , ישנה את ייעוד החלבון.
37
פיגר 12-51
**מסלול ראשון:** נוכחות רצף סיגנל הידרופובי ישר אחרי רצף הסיגנל ה N-טרמינלי למטריקס , עוצרת את הטרנסלוקציה למטריקס , וגורמת ל TIM23 להטמיע את ה cargo בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. סדר הדברים הוא כזה שתחילה נעצרת הטרנסלוקציה , TOM מכניס את שאר החלבון למרווח , וכשזה נמצא בשלמותו במרווח רצף הסיגנל ה N-טרמינלי , שאך ורק הוא הגיע למטריקס , נחתך ובמקביל TIM23 עושה העברה לטרלית לחלבון אל תוך הממברנה.
**מסלול שני**: מסלול זה משתמש ב TIM22 , הטרנסלוקטור הזה **מתמחה בהטמעה של חלבוני multipass בממברנה הפנימית** , חלבונים אלה משמשים כרצפטורים שמספקים למיטוכונדריה מטבוליטים ציטוזוליים לכל מיני ריאקציות אנזימטיות , ומשחררים את תוצריהם חזרה לציטוזול. רצף הסיגנל בחלבונים כאלה אינו נמצא בקצה האמיני , ולכן החלבון אינו ״מיועד״ למטריקס , ועל כן אינו עושה שימוש בצמד TOM / TIM23 , אלא שרצף הסיגנל נמצא בחלק יותר פנימי על ה cargo. הוא נכנס בשלמותו למרווח הבין ממברנלי , ומכוון ע״י שפרונים ל TIM22.
**מסלול שלישי**: רואים את OXA קושר חלבון **מיטוכונדריאלי** במטריקס , לחלבון זה יש רצף סיגנל בקצה שלו שמזוהה ע״י OXA ונקשר אליו. OXA כעת פועל כטרנסלוקטור ומעביר את החלבון לחלל הבין ממברנלי , וכן עושה העברה לטרלית של רצף הסיגנל אל תוך הממברנה (רצף הידרופובי?).
חלבונים ציטוזוליים שמיועדים ל OXA מכילים שני רצפים , רצף N-טרמינלי דמכוון אותם תחילה למטריקס , במטריקס רצף זה נחתך , מה שחושף רצף חדש , **הידרופובי** , שממוקם בקצה ה N-טרמינלי החדש (שנוצר אחרי חיתוך הרצף הקודם) , הרצף ההידרופובי מנחה הטמעה של החלבון בממברנה.
38
בקטריות מטמיעות חלבוני β barrels בממברנה החיצונית במנגנון שדומה למיטוכונדריה:
מיטוכונדריה התפתחה מחיידק בתהליך של אנדוסימביוזה. הדבר בולט במיוחד כשמסתכלים על מאפיינים מבניים של השניים.
בהקשר של ממברנות וטרנסלוקטורים , רואים דימיון רב בין הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה , והממברנה החיצונית של חיידקים **גרם שליליים**. למשל , שתי הממברנות עשירות בחלבוני פורין porins , שהם חלבוני בעלי מבנה של β barrels שמייצרים פורות בממברנה החיצונית , **הפורות האלה הינם חדירים ליונים ומטבוליטים קטנים , אך אינם חדירים למרבית החלבונים**.
עד כה דיברנו על טרנסלוקטור TOM כטרנסלוקטור נטו (היה התייחסות לרצפטור שלו שקושר את רצף הסיגנל ה N-טרמינלי) , אך לא התייחסנו ליכולתו לעשות העברה לטרלית של חלבונים!! מסתבר , שלקומפלקס TOM יש את היכולת להטמיע חלבונים בממברנה אך יכולת זאת מוגבלת **לחלבונים בעלי דומיינים α הליקליים הידרופוביים** , ואינו מסוגל לעשות העברה לטרלית אל תוך הממברנה לחלבוני β barrels. הואיל והממברנה החיצונית של המיטוכונדריה (וחייקדים גרם שליליים) עשירה בחלבוני β , הטמעת החלבונים האלה מתרחשת אך ורק דרך קומפלקס SAM. תחילה החלבון נכנס דרך TOM למרווח הבין ממברנלי , בעודו ישר ופתוח , שפרונים במרווח נקשרים אליו ומונעים אגרגציה שלו , ולהסוף החלבון הזה **מקופל ומוטמע** בממברנה החיצונית ע״י קומפלקס SAM.
אחת היחידות המבניות **המרכזיות** בקומפלקס SAM במיטוכונדריה הינה הומולוגית מבנית ליחידה דומה בקומפלקס חלבוני שנמצא בממברנה החיצונית של חיידקים , החלבון הזה שנקרא BAM הינו אנלוג של SAM ופועל גם כן להטמעת חלבוני β barrels בממברנה החיצונית , של בקטריות.
לציין , תת היחידות המרכזיות הן ב TOM והן ב SAM הן חביות β , משמע , יצירה נוספת של שני הקומפלקסים האלה והטמעתם בממברנה החיצונית של מיטוכונדריה דורשת קיום מוקדם שלהם , אחרת אין מי שיכניס את העותקים החדשים לממברנה.
39
פיגר 12-52
הטמעת פורינים porins בממברנה החיצונית במיטוכונדריה וחיידקים:
המרווח הפריפלסמטי בחיידקים הינו האקוויולנט הטופולוגי של המרווח הבין ממברנלי במיטוכונדריה.
שני קומפלקסים , SAM ו- BAM תחיחה מטמיעים את החלבון בצורתו הפתוחה כשרשרת פוליפפטידית בממברנה החיצונית , ולאחר מכן מקפלים אותו לצורת חביות β
40
**שני רצפי סיגנל עוקבים** מכוונים חלבונים לממברנה התילקואידית בכלורופלסט:
טרנספורט של חלבונים למיטוכונדריה ולכלורופלסט חולקים מאפיינים משותפים רבים:
- שניהם מייצרים פחות מ 1% מהחלבונים שלהם
- שניהם קורים באופן פוסט טרנסלטורי
- משתמשים בטרנסלוקטורים שונים בכל ממברנה
- דורשים אנרגיה
- משתמשים במגוון רצפי סיגנל עבור כל תת מדור
אך יחד עם זאת , קיימים מספר הבדלים בין השניים:
- חלק מתת היחידות שבונות את הטרנסלוקטורים המיטוכונדריאליים שונות מאחו שבכלורופלסט.
- בעוד מיטוכונדריה עושה שימוש בגרדיינט החשמלי של הפרוטונים מסביב לממברנה הפנימית כדי להניע טרנסלוקציה של חלק מהחלבונים , **בכלורופלסט אין גרדיינט אלקטרוכימים של פרוטונים מסביב לממברנה הפנימית** (ובתוך כך גם אין את הרכיב החשמלי שדוחף את התהליך) , **הגרדיינט קיים רק מסביב לממברנה התילקואידית** ולכן טרנסלוקציה דרך **שתי הממברנות** , הפנימית והחיצונית , נעשית דרך שימוש באנרגיית **אטפ וגטפ**.
הואיל ולתאים צמחיים יש גם מיטוכונדריה וגם כלורופלסטים , רצפי הסיגנל שמכוונים לכל אחד מהאברונים חייבים להיות שונים במקצת זה מזה , למרות דימיון מסויים שכן קיים בינהם.
בניסוי שערכו , הצמדת רצף סיגנל N-טרמינלי **מיטוכונדריאלי** לחלבון ציטוזולי בתאי צמחים הביא את החלבון למיטוכונדריה , הצמדת רצף סיגנל N-טרמינלי כלורופלסטי **לאותו חלבון** מביא אותו לכלורופלסט. משמע , האברונים והטרנסלוקטורים השונים מגיבים ופועלים לפי הסיגנלים השונים.
אותם תת מדורים שקיימים במיטוכונדריה , קיימים גם בכלורופלסט , ובשני המקרים לכל אחד מהם יש את החלבונים המיוחדים שלו. אולם בכלורופלסט קיים מדור נוסף , **התילקואיד** , שאינו קיים במיטוכונדריה.
חלק גדול מחלבוני הכלורופלסט , לרבות תת יחידות של אנזימי הפוטוסנתזה וסנתזה של אטפ ממוקמים ופועלים בתוך התילקואיד , כאשר הייצור שלהם מתרחש בציטוזול , משמע הם צריכים לחצות **שלש ממברנות** כדי להגיע לייעד שלהם: ממברנה חיצונית , ממברנה פנימית , וממברנת התילקואיד.
חלבוני ה cargo לכלורופלסט מגיעים אליו בעודם פתוחים כשרשרת פוליפפטידית ישרה , והם מכילים רצפי סיגנל ״כפולים״:
**רצף סיגנל ראשון** , הינו רצף סיגנל N-טרמינלי כלורופלסטי שמכוון כניסת ה cargo מהציטוזול אל **הסטרומה** דרך שתי הממברנות הפנימית והחיצונית (מקביל לרצף האמיני המיטוכונדריאלי שמכניס חלבונים למטריקס). בסטרומה אנזים מסוג signal peptidase חותך את הרצף הנ״ל ומוריד אותו , בכך , נחשף **רצף הסיגנל השני**, thylakoid signal , שכעת נמצא בקצה האמיני החדש של ה cargo , ומכוון אותו או לחלל התילקואידי , או לחילופין לאינטגרציה בממברנה התילקואידית.
בממברנה התילקואידית ישנם שלשה סוגים שונים של טרנסלוקטורים , כל אחד מזהה סוג אחר של רצפי סיגנל , וכל אחד משתמש לצורך הטרנסלוקציה באנרגיה באופן שונה.
כאמור , הממברנה התילקואידית נגזרת מהממברנה הפנימית של הכלורופלסט בתהליך הבשלת האברון , אי לכך נראה שהממברנה הפנימית של חיידקים חולקת עימה מאפיינים משותפים , לרבות נוכחות טרנסלוקטורים אנאלוגיים בממברנת החיידק.
41
פיגר 12-53
טרנסלוקציה של cargo לתילקואיד
החלבון מיוצר בציטוזול , ומיובא בצורתו הפתוחה לכלורופלסט. חלבוני cargo שמיועדים לתילקואיד מכילים שני רצפי סיגנל , רצף סיגנל N-טרמינלי כלורופלסטי , ומיד אחריו רצף סיגנל תילקואידי.
מנגנון הכנסת חלבון ה cargo אל הסטרומה של הכלורופלסט דומה מאד למנגנון הכנסת cargo למטריקס של המיטוכונדריה , שניהם מונחים ע״י רצף N-טרמינלי , אולם הטרנסלוקטורים בכלורופלסט TOC ו- TIC שונים מהטרנסלוקטורים המיטוכונדריאליים TOM ו- TIM.
בסטרומה , רצף הסיגנל האמיני נחתך , וכך נחשף רצף הסיגנל התילקואידי שבא אחריו.
טרנסלוקציית חלבונים , הן לממברנה התילקואידית , והן לחלל התילקואידי , יכולה להתרחש בשלשה מסלולים שונים **לפחות**:
1) **מסלול Sec:** נקרא כך כי חלק מהחלבונים המשתתפים בו דומים לחלבוני sec של ה ER ולחלבוני sec של הממברנה הציטופלסמטית בחיידקים. מסלול זה עושה שימוש באנרגיית אטפ + אנרגיה שאצורה בגרדיינט האלקטרוכימי של פרוטונים.
2) **מסלול דמוי OXA:** עושה טרנסלוקציה דרך אנאלוג כלורופלסטי לקומפלקס OXA המטוכונדריאלי. עושה שימוש בגטפ + גרדיינט אלקטרוכימי של הפרוטון.
המסלול הזה עושה שימוש באנלוג כלורופלסטי של SRP (דומה ל SRP ציטוזולי שפועל בטרנספורט ל ER) , אך נבדל ממנו בכמה תכונות:
- בניגוד ל SRP הציטוזולי , ה SRP הכלורופלסטי אינו מכיל תת יחידה של RNA
- בניגוד ל ER שהריבוזום וה SRP שניהם נמצאים בציטוזול , בכלורופלסט שני השחקנים נמצאים בשני מדורים שונים
- ה SRP הכלורופלסטי מתווך טרנספורט פוסט טרנסלטורי ולא קו טרנסלטורי , כי הוא נמצא במדור נפרד מהריבוזום (שנמצא בסטרומה).
3) **מסלול TAT**: בשמו המלא Twin Arginine Translocator. כך נקרא משום שברצף הסיגנל התילקואידי חייבות להיות שתי חומצות אמיניות מסוג ארגנין , אחרת ה cargo לא יגיע אליו. עושה שימוש רק בגרדיינט האלקטרוכימי של הפרוטונים מסביב לממברנה התילקואידית.
42
סיכום:
טרנסלוקציה למיטוכונדריה מונעת מפירוק אטפ , פוטנציאל הממברנה הפנימית , ופוטנציאל החמצון-חיזור של שרשרת מעבר האלקטרונים של הנשימה התאית.
טרנסלוקציה לכלורופלסט מונעת מאנרגיית אטפ (sec) , אנרגיית גטפ (OXA like) ומפוטנציאל הממברנה התילקואידית (כל המסלולים).
43
חזרה לפרק 14:
המערכת הגנטית של המיטוכונדריה והכלורופלסט:
כפי שכבר נאמר , מיטוכונדריה וכלורופלסט התפתחו מתאי חיידקים פרוקריוטים בתהליך של אנדוסמביוזה. אי לכך , שני האברונים עדיין מכילים גנום משל עצמם , שנפרד מהגנום התאי , ובתוך כך , גם את המערכות התאיות הנחוצות לשכפול , שעתוק ותרגום הגנום הנ״ל.
בדומה לחיידקים , שני האברונים מתרבים דרך גדילה וחלוקה , כלומר אברון קיים גדל במיימדיו (בעיקר ע״י יבוא חלבונים מהציטוזול) ולאחר מכן הוא מתפצל לאברונים חדשים , שיכולים אז להתפזר בין תאי הבת.
בתאי מתחלקים כגון תאי אפיתל במעי , המיטוכונדריה חייבים **להכפיל** את גודלם בין חלוקה לחלוקה , ולאחר מכן להתפזר לשני תאי הבת. בתאים שלא מתחלקים , נוירונים למשל , התא צריך כל הזמן לייצר אברונים חדשים כדי לפצות על כאלה שהתפרקו ועברו דגרדציה , כדי לשמור על ה organelle turnover , או כדי לתת מענה לצרכי הגוף המשתנים. מכאן , שגדילת האברונים בתא וחלוקתם הם תהליכים מאד מבוקרים.
תהליך הביוגנזה של מיטוכונדריה וכלורופלסט מורכב במיוחד. מואכבות זו נובעת מהעובדה שהחלבונים הפועלים באברונים מיוצרים בשני מקומות שונים , חלקם הגדול בגרעין ובציטוזול , וחלקם האחר , הקטן יותר , באברון עצמו. אי לכך , הדבר דורש קורדינציה רבה ותיאום בין הגרעין לאברון.
44
המערכת הגנטית במיטוכונדריה וכלורופלסט דומה לזו של פרוקריוטים:
תאים יוקריוטים התפתחו מארכיאה שבלעה פרוקריוט , ספיציפית α-proteobactirium , שממנו התפתחה המיטוכונדריה. כלורופלסט התפתח כאשר ציטנובקטריה נבלעה באופן דומה.
התאוריה האנדוסמביוטית נתמכת בכך שתכונות רבות של המיטוכונדריה והכלורופלסט דומות יותר לחיידקים מודרניים מאשר לתכונותיהם של תאים יוקריוטים , תכונות משותפות של חיידקים , מיטוכונדריה וכלורופלסט:
- בשלשתם הגנום הינו מעגלי , ואינו ממודר
- אופן ארגון הגנום בשלשתם בעל תכונות דומות
- הריבוזומים של שלשתם דומים מבחינת המבנה , ומבחינת הרגישות שלהם לאותם סוגי AB.
- גם בחיידקים וגם בכלורופלסט תרגום של חלבונים מתחיל עם N-formylmethionine , ולא עם מתיונין כמו בתאים יוקריוטים
- מערכת השעתוק הדנא במיטוכונדריה דומה לזו של חיידקים ופאג׳ים
- בשלשתם אין הפרדה בין שכפול , שעתוק ותרגום - בחיידקים הכל מתרחש בציטופלסמה , במיטוכונדריה הכל מתרחש במטריקס , ובכלורופלסט בסטרומה.
- האנזימים שפועלים בתהליכי השכפול, שעתוק, תרגום דומים יותר לאנזימים חיידקיים מאשר יוקריוטים
בגדול , הדמיון בין הכלורופלסט לחיידקים מודרנים יותר ניכר מהדמיון בין המיטוכונדריה לחיידקים, כמו כן הגנום של הכלורופלסט יותר גדול מזה של המיטוכונדריה , ומכיל גנים שמקודדים לאנזימים שםועלים השעתוק ותרגום , בעוד המיטוכונדריה מקבלת זאת מהגרעין.
45
עם הזמן , המיטוכונדריה וכלורופלאסט ייצאו את מרבית **הגנים** שלהם לגרעין:
התהליך אינו פשוט , גנים שיוצאים מהאברונים ועוברים אינקורפורציה בגרעין צריכים להתאקלם לסביבה החדשה - שעתוק בגרעין + תרגום בציטוזול , כמו כן , עליהם לרכוש רצף סיגנל מתאים שיבטיח הגעת החלבונים שהם מקודדים אליהם חזרה לאברונים.
המיטוכונדריה של ייצורים שונים מכילים גנים שונים , הגנום המיטוכונדריאלי הקטן ביותר והכי מתקדם מכיל מעט גנים , ומקודד למעט חלבונים:
- חלבונים הידרופוביים של הממברנה הפנימית שמשתתפים בשרשרת העברת אלקטרונים בתהליך הנשימה התאית.
- mitochondrial rRNA
- mitochondrial tRNA
גנומים מיטוכונדריאלים יותר מפותחים מכילים עוד כמה גנים בנוסף לאלה , בעיקר כאלה שפועלים במטבוליזם של הדנא כמו למשל רנא פולימראז מיטוכונדריאלי , או תת יחידות של חלבונים ריבוזומליים.
הגנום המיטוכונדריאלי בבני אדם בנוי מ 16,600 ז״ב המרכיבים בסה״כ 37 גנים. 2 מתוכם מקודדים ל rRNA (רנא ריבוזומלי) , 22 מקודדים ל tRNA , והשאר , 13 , מקודדים לחלבונים. הגנום המטוכונדריאלי מכיל שני פרומוטורים , פרומוטור אחד על כל גדיל (פיגר 14-59).
מבנה וארגון הדנא המיטוכונדריאלי שמור אבולוציונית בין בעה״ח רבים , עד כדי כך שבבעלי חיים מסויימים יש אותו מספר גנים בדנא המיטוכונדריאלי , וכן אותו סדר של הגנים.
חלבונים שמיוצרים במטריקס , מיוצרים על גבי ריבוזומים מיטוכונדריאליים , מ mRNA מיטוכונדריאלי. חלבונים אולו **כמעט באופן מוחלט** מוגבלים למיטוכונדריה , ולא עוברים תהליכי export לציטוזול אלא באופן נדיר ביותר , וכך גם לגבי הכלורופלסט. במקרים חריגים , כאשר התא עומד לבצע **אפפטוזיס** , המיטוכונדריה מפרישה החוצה חלבונים , **בעיקר ציטוכרום c** , מחלל הקריסטא אל הציטוזול , כחלק ממערך אותות יותר רחב שגורם למוות תאי מבוקר.
46
פיגר 14-60
ביוגנזה של חלבוני שרשרת הנשימה התאית במיטוכונדריה אנושית:
בגרף רואים 3 מדורים שונים: **הגרעין , הציטוזול , והמיטוכונדריה** , כל אחד מהמדורים האלה הוא בעל תפקיד חשוב ותורם לתהליך יצירת חלבוני שרשרת הנשימה.
תחילה , ישנו שעתוק של הגנים הרלוונטיים שמקודדים לחלבונים הנ״ל **בגרעין**. למעשה מרבית תת היחידות של האנזימים בשרשרת הנשימה התאית מקורם מהגרעין. לאחר השעתוק בגרעין , והתרגום בציטוזול החלבונים מיובאים למיטוכונדריה , בעצם **למטריקס** , דרך הקומפלקסים TOM ו- TIM23.
במטריקס ישנם החלבונים המיטוכונדריאליים , 13 במספר , שנוצרו ע״י ריבוזומים מיטוכונדריאליים ,
בשלב הבא , כל החלבונים שנמצאים כעת במטריקס , גם הנוקליאריים וגם המיטוכונדריאליים מוטמעים בממברנה הפנימית ע״י OXA. להסוף מתרחש אסימבלי של כל החלבונים יחדיו על הממברנה הפנימית ליצירת אנזימי שרשרת הנשימה התאית .
שעתוק הגנום המיטוכונדריאלי מייצר 13 גדילי mRNA , מהם נוצרים 13 חלבונים שכולם משתתפים בהרכבת אנזימי שרשרת הנשימה התאית (משמע הפולימראזות של הדנא המיטוכונדריאלי מגיעים מהגרעין). בנוסף , בתהליך השעתוק נוצר שתי מולקולות rRNA המשתתפות ביצירת הריבוזום המיטוכונדריאלי ו- עוד 22 מולקולות tRNA המשתתפות בתהליך התרגום של 13 החלבונים.
הגרעין מייצר בין 1200 ל 1600 חלבונים מיטוכונדריאליים , מרביתם משתתפים בהרכבת האנזימים והקומפלקסים של שרשרת מעבר האלקטרונים. בינם גם נמצאים חלבוני הדנא והרנא פולימראזות , לצד חלבוני maintenance אחרים שמטפלים בגנום המיטוכונדריאלי , ולבסוף , כל המרכיבים החלבוניים של הריבוזום המיטוכונדריאלי מיוצרים אף הם בגרעין.
47
הגנום המיטוכונדריאלי שונה ומיוחד:
הגנום המיטוכונדריאלי האנושי שונה מהגנום הגרעיני , שונה מהגנום של הכלורופלסט ושונה מגנום חיידקי בכמה אופנים:
1) בשונה מגנומים אחרים , הגנום המטוכונדריאלי כמעט ולא מכיל דנא שאינו מקודד , כמעט כל נוקליאוטיד מבין ה 16,600 הוא חלק מרצף מקודדבין אם לחלבון (13) או ל רנא (24). נראה שהאזור היחיד שאינו מקודד הוא רצף ה origin.
2) במיטוכונדריה יש 22 חומצות אמינו , שזה פחות מבאברונים אחרים/ חיידקים. וזאת כי תופעת ה wobble מאד נפוצה בקודונים מיטוכונדריאליים עד כדי כך שכל tRNA במיטוכונדריה יכול לקרוא כל קודון , ולכן הצורך המועט ב tRNA.
3) מתוך 64 קודונים אפשריים , 4 במיטוכונדריה מקודדים לח״א ששונה משאר הגנומים באברונים אחרים או במיטוכונדריה (טבלה 14-4).
מסתבר שהקוד הגנטי המיטוכונדריאלי הינו ואריאבילי , ומשתנה מאורגניזם לאורגניזם , UGA שהמשמעות האוניברסלית שלו היא stop codon בגנום המיטוכונדריאלי של ייצורים רבים הוא מקודד לטרפטופאן. AGG שהמשמעות האוניברסלית שלו היא ארגנין , במיטוכונדריה של יונקים הופך להיות סטופ.
48
בין כלורופלסט וחיידקים יש דימיון מפליא:
הגנום של הכלורופלסט בצמחים יבשתיים נע בגודלו מ 70,000 ז״ב עד 200,00. נמצא שהגנום של הכלורופלסט הינו דומה בין צמחים רבים , גם צמחים שרחוקים אבולוציונית.
גנום הכלורופלסט **מעורב** ב 3 פעולות עיקריות:
-שעתוק
- תרגום
- פוטוסנתזה
בשלשת המסלולים האלה נמצא חלבונים שמקורם בגנום הכלורופלסטי.
גנום הכלורופלסט בד״כ מקודד ל:
- 80-90 חלבונים
- 45 מולקולות רנא , מתוכם 37 tRNA
מרבית החלבונים שהגנום מבטא הם תת יחידות של אנזימים מטבוליים , שמתחברים לחלבונים מהגרעין ליצירת אנזים / קומפלקס פעיל , כמו למשל חלבוני הפוטוסנתזה.
הגנום החיידקי והגנום של הכלורופלסט דומים בצורה יוצאת דופן. רצפים רגולטוריים בסיסיים , כגון פרומוטורים וטרמנטורים הם פשוט זהים. רצף חומצות האמינו (מבנה ראשוני) בחלבונים ממקור כלורופלסטים , זהים לרצף חומצות האמינו של חלבונים מקבילים בחיידקים. ולבסוף clusters של גנים , שמקודדים לתוצרים שקשורים זה לזה (חלבונים של מסלול מטבולי כלשהו למשל ) מסודרים בגנום הכלורופלסט באופן זהה לסדר שלהם בחיידקי אי קולי וציאנובקטריה (Operon)
האופן שבו כלורופלסט וחיידקים מתחלקים הוא גם כן דומה למדי , ובשני המקרים נעשה שימוש בחלבוני FtsZ שהם
**tubulin** related self assembling GTPase.
בחיידקים, FtsZ הם חלבונים מסיסים שמתחברים יחדיו ליצירת מבנה טבעתי שנקשר לממברנה מבפנים ומהווה פיגום שעליו נקשרים חלבונים אחרים שמשתתפים בתהליך , טבעת ה FtsZ מתכווצת ויוצרת את הכח הנחוץ לחלוקת התא , בכלורופלסט מתרחש תהליך דומה.
מנגד , אם נשווה חלוקת הכלורופלסט עם חלוקה של המיטוכונדריה נראה שאם כי בשניהם יש גיוס של חלבוני GTPase שנקשרים לממברנה , התהליך ביסודו שונה. בכלורופלסט ובחיידקים התהליך מתרחש מהבפנים החוצה ועושה שימוש ב FtsZ , בעוד במיטוכונדריה זה קורה מהבחוץ פנימה ועושה שימוש בחלבונים דמויי דינמין dynamin. הכלורופלסט אם כך דומה למקור החיידקי ממנו הוא התפתח הרבה יותר מהמיטוכונדריה. מיטוכונדריה התאלקמו יותר טוב במאכסן היוקריוטי , עד כדי כך שמצד אחד הן ויתרו על חלק גדול מאד מהגנום שלהם (יותר מהכלורופלסט) , ומצד שני תהליכים כמו יצירת וזיקולות ובניית ממברנה בתאים יוקריוטים שואבים השראה מתהליך ה fission של המיטוכונדריה.
**אין משמעות הדברים שבין הכלורופלסט למאכסן שלו אין קשר. תהליכי עיבוד של מולקולות רנא ממקור כלורופלסטי , כגון דגרדציה של תעתיקים פוליצסטרוניים , או המרת בסיסים מסוג C ל U , מתבצעים בעזרת מערכות של התא.**
49
הגנים של מיטוכונדריה וכלורופלסט , מורשים מהאם:
ברביה של שמר ההנצה , שני תאים הפלואידיים נפגשים , ומהם נוצרת זיגוטה דיפלואידית , כאשר כל אחד משני ההורים תורם כמות שווה של גנום מיטוכונדריאלי , צורת תורשה שכזאת נקראת biparental , שבה כל הורה תורם חלק שווה. בהמשך , השמר הבוגר מתרבה בצורה אמינית (ויגיטטיבית) , בשלב הזה חלוקת המיטוכונדריה בין תאי הבת קורית באופן רנדומלי , כך שלאחר מספר דורות של חלוקה כל תא בת יכיל מיטוכונדריה ממקור הורי יחיד - חלק מהתאים יכילו רק מיטוכונדריה אבהית וחלק יכילו רק מיטוכונדריה אימהית , תופעה שנקראת mitotic segregation שהיא סוג של הורשה **אל מנדלית** , או **הורשה ציטופלסמטית**.
הורשת מיטוכונדריה בבעה״ח וצמחים מתרחשת באופן שונה. פה ההורשה היא unipatental , משמע שהורה אחד תורם יותר מיטוכונדריות (ובתוך כך גנום מיטוכונדריאלי) מההורה השני.
בעצם תא ביצית מכיל כ 100,000 עותקים של מיטוכונדריה , ותא זרע (או פולן בצמח) מכיל רק כמה עותקים , ולכן הסתברותית מרבית המיטוכונדריות שיעברו הלאה יהיו ממקור אמהי , לא רק זאת , אלא שבתאי זרע אחרי שהם מבשילים ישנה דגרדציה של הגנום המיטוכונדריאלי והרס שלו , ובנוסף , כל המיטוכונדריה ממקור אבהי שכן הצליחו להגיע לביצית בעת ההפריה , עוברות אוטופאגיה , הם מסומנות ביוביקוויטין ומושמדות בליזוזום (בגומה להשמדת מיטוכונדריה פגומה).
אי לכך הורשת מיטוכונדריה בבעה״ח וצמחים היא יוניפרנטלית אמהית.
במרבית הצמחים העילאיים , שני שליש מהכלורופלסט בפולן אינו מצליח להגיע לזיגוטה , בדומה להורדה מיטוכונדריאלית אם כך , גם הורשת הכלורופלסט הינה יוניפרנטלית אימהית.
בשאר הצמחים הורשת הכלורופלסט הינה ביפרנטלית. במצב כזה יתכן אפקט של varigation במידה וחלק מהכלורופלסט פגום , ולכן נוצרים צמחים עם פאצ׳ים (פיגר 14-62) , האזור הירוק מכיל כלורופלסט תקין והאזור הלבן מכיל כלורופלסט פגום.
50
מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי גורם למחלות מורשות:
המיטוכונדריה הן אברון חשוב וקריטי בעבור האורגניזם , ומייצרות בעבורו תוצרים רבים כגון אטפ. אולם בזמן יצירת החומרים הטובים במיטוכונדריה נוצרים גם חומרים מזיקים מסוג ROS , שהם בעצם רדיקלים חופשיים כגון H2O2. הצטברות חומרים אלו במיטוכונדריה פוגעת בגנום שלהם וגורמת **למוטציות חסר ומוטציות נקודתיות.**
במיטוכונדריה יש מערכת תיקון נזקי דנא פחות מפותחת ויעילה מבגרעין , ולכן מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי אינן מתוקנות כמו שצריך , עד כדי כך שבמיטוכונדריה יש פי 100 יותר היארעות של מוטציות חסר ומוטציות נקודתיות מאשר בגרעין.
אם במאכר המיטוכונדריה של הפרט יש מיטוכונדריה פגומה , בגלל תופעת ה mitotic segregation , חלק מהתאים שלו מקבלים מיטוכונדריה פגומות מאד , וחלק מקבלים מיטוכונדריה פגומות פחות , לעיתים נדירות , התאים שירשו מיטוכונדריה פגומות יעבירו אותם הלאה בתורשה לדורות הבאים.
בבני אדם , כל המיטוכונדריה בזיגוטה היא ממקור אימהי , אם לאימא יש מיטוכונדריה פגומות בתאים (שככל הנראה ירשה מאימא שלה) , יתכן שהיא תעביר אותם הלאה לילדים שלה , אם הילד יורש מספר רב של מיטוכונדריה פגומות הוא יפתח מחלה , ואם הוא יורש מספר קטן של מיטוכונדריה פגומות הוא לא יפתל מחלה. לציין , בנים שירשו מיטוכונדריה פגומה מאימא שלהם , גם אם יהיו חולים בעצמם , הם לא יורישו את המחלה הלאה , בנות כן.
מרבית המחלות שמערבות גנום מיטוכונדריאלי פגום מערבות מחלות של השרירים ושל הנוירונים , בגלל הצורך הרב של הרקמות האלה באטפ , ועל כן התלות הרבה שלהם במיטוכונדריה.
51
פיגר 14-63
כדתא נבט מכיל ערבוביה של מיטוכונדריה תקינות ופגומות , הוא מעביר אותם **באופן רנדומלי** (סגרגציה מיטוטית) לביציות פרימריות , כך שבזמן שהביציות האלה מבשילות , המיטוכונדריה מתרבות (דרך גדילה וביקוע) , ביצית שירשה מספר גדול של מיטוכונדריה פגומה תפתח מחלה , ביצית שירשה מספר קטן לא !
52
מדוע מיטוכונדריה וכלורופלסט שומרים על גנום נפרד מהגרעין?
נוכחות הגנום המיטוכונדריאלי והפלסטידי היא עסק יקר מאד! יותר מ 90 חלבונים נדרשים כדי לתחזק את הגנום הזה , שהתא צריך לייצר אותם בעבורו ולהשקיע בהם משאבים יקרים. כמו כן , הגנום של המיטוכונדריה מועד להמון מוטציות , וחושף את האורגניזם למחלות.
בנוסף , הגנום של האברון מייצר חלק קטן מהחלבונים שנחוצים בעבורו , שהם לאוב תת יחידות של קומפלקסים אנזימטיים , שכדי שהם יתפקדו נכונה , הם צריכים לקבל תת יחידות נוספות מהגרעין להשלמת הקומפלקס , משמע הדבר דורש תיאום רב בין הגרעין לאברון , לצד מערכת טרנספורט ובקרה יעילות.
אז למה בכל זאת התא משאיר את הגנום המיטוכונדריאלי ? מספר השערות:
1) החלבונים הלא רובוזומליים שהאברון מייצר הם בד״כ מאד הידרופוביים (הגיוני מיועדים להיטמע בממברנה הפנימית כחלק מקומפלקס אנזימטי) , ולכן הייצור והשינוע שלהם בציטוזול קשה (סביבה הידרופילית). טיעון נגד: חלק גדול מהחלבונים המיוצרים בציטוזול הם הידרופוביים.
2) שריד אבולוציוני מתקופת האנדוסמביוזה שלא נפתר.
3) יתכן שתהליך ההיפטרות מהגנום האברוני עדיין קיים , אך הוא קורה לאט , וכפי שהאברונים נפטרו מחלק גדול מהגנים שלהם בעבר , הם ימשיכו לעשות זאת גם בעתיד.
53
פרק 12
פירוקסיזום:
פרוקסיזום הוא אברון תאי **שעושה שימוש נרחב בחמצן** כדי לקיים את הריאקציות שלו. , בעצם ריאקציות אוקסידטיביות.
הוא נמצא בכל התאים האנימחיים (מלבד אריתרוציטים) ובצאי צמחים רבים.
בפרוקסיזום נמצא כמויות גדולות מאד של אנזימים כגון קטלאז catalase ו- אוראט אוקסידאז urate oxidase.
הנוכחות הכל כך נרחבת של אנזימים בתוך האברון מקנה לו מופע יחודי של ליבה **קריסטלואידית** , עד שבתאים מסויימים האברון בולט , תחת מיקרוסקופ אלקטרונים , ביתר שאת הודות לכך (פיגר 12-43).
המקור האבולוציוני של הפרוקסיזום אינו ידוע לחלוטין , ויש מספר הנחות לאופן התפתחותו. אחת ההמחות היא שהפרוקסיזום התפתח ממערכת ממברנלית שתפקדה בעבר כוזיקולות של הפרשה או אנדוציטוזה , אחרת טוענת שהוא התפתח מאברון קדום שהיה קיים ביוקריוטים ישנים שפעל כאתר חמצון עיקרי בתא.
התפתחות המיטוכונדריה בתאים יוקריוטים גרעה מחשיבות הפרוקסיזום , חלק גדול מהריאקציות שמתקיימות בפרוקסיזום ודורשות חמצן , יכולות להתרחש גם במיטוכונדריה, ההבדל העיקרי הוא **שאותן ריאקציות בפרוקסיזום לא הניבו רווח אנרגטי** בעוד במיטוכונדריה אותן ריאקציות , בעצם מה שנקרא היום **חמצון אוקסידטיבי** , מצומדות ליצירת אטפ , ורווח אנרגטי רב. אם כך , ריאקציות החמצון שעדיין מתרחשות בפרוקסיזום כיום הן הריאקציות שלא נלקחו ממנו על ידי המיטוכונדריה במהלך האבולוציה.
54
פרוקסיזום עושה ריאקציות חמצוניות רבות:
הפרוקסיזום הוא אברון שעבר התמחות ובתוכו מתרחשות ריאקציות אוקסידטיביות (חמצון) רבות. לשם כך הוא משתמש ב **O2 ו- H2O2**
בפרוקסיזום מתרחשות מספר ריאקציות , ננסה לקטרג אותם.
**פירוק חומרים ונטרול רעלים:**
1) בשלב הראשון , אנזים כלשהו , בעזרת חמצן מולקולרי, מחמצן את **סובסטרטים אורגניים** שמגיעים לאברון , בעצם לוקח להם מימנים:
1) RH2 + O2 -> H2O2 + R
בשלב השני, האנזים **קטלאז** משתמש בתוצר H2O2 של הריאקציה הנ״ל כדי לחמצן סובסטרטים אחרים כגון חומצה פורמית , פורמלדהיד ואלכוהול:
2) R’H2 + H2O2 -> R’ + 2H2O
כך שלבסוף אנחנו מקבלים מים.
הריאקציה השניה נקראת ריאקציית **peroxidation** , והיא חשובה במיוחד בתאי **כבד וכליה** , בהם מתרחשים תהליכי דהטוקסיפיקציה ונטרול רעלים בזרם הדם. 25% מהאתנול שהם שותים מנוטרל בכבד בריאקציית פירוקסידציה לכדי אציטלדהיד.
**פרוקסידציה היא ריאקציית חמצון של חומרים אורגניים שמבוצעת ע״י האנזים קטלאז , שעושה שימוש ב H2O2 כמקבל האלקטרונים**.
2) תפקיד חשוב נוסף של הפרוקסיזום הוא נטרול של H2O2 שנוצר בתאים. במהלך המיטבוליזם שמתרחש בגוף , נוצרים צורונים ריאקטיבים ורדיקלים חופשיים כתוצר לוואי , אחד מהם הוא כאמור H2O2 , וכך עודפים שלו שמצטברים בתא מנוטרלים בפרוקסיזום כדי שחלילה לא יגרמו נזק. בריאקציה זו H2O2 הופך למים וחמצן:
2H2O2 -> O2 + H2O
**מטבוליזם**:
3) ריאקציה חשובה שלישית של הפרוקסיזום היא חמצון חומצות שומן , או בשמן האחר **חמצון β**. בריאקציות אלה מוסרים מהשרשרת האלקילית (בעצם השלד הפחמימני של חומצת השומן) שני פחמנים בכל סבב , שהופכים למולקולת אציטיל קו-A , שלאחר מכן מיוצאת מהפרוקסיזום לציטוזול , ולוקחת חלק בריאקציות מטבוליות רבות.
ביונקים , חמצון β יכול להתרחש גם בפרוקסיזום וגם במיטוכונדריה , בשמרים וצמחים , הריאקציה מתרחשת באופן בלעדי בפרוקסיזום.
**ביוסנתזה**:
**בבעה״ח**, פירוקסיזום לוקח חלק חשוב בביוסנתזה של פלאסמהלוגנים plasmalogens , אלו הם פוספוליפידים חשובים , **שנמצאים בכל תאי בעלי החיים** , אך חשיבותם ניכרת במיוחד במוח , שם הם מרכיב חיוני של מעטפת המיילין (פיגר 12-44).
חשיבות הפרוקסיזום בתהליך היא **שהריאקציה הראשונה בביוסנתזה של פלאסמהלוגנים מתרחשת בפרוקסיזום**. אי לכך , בפרטים בהם יש פרוקסיזום פגום , ובעיה בייצור פלאסמהלוגנים , נראה מחלות נוירולוגיות כתוצאה מפגיעה במעטפת המיילין.
פרוקסיזום הוא אברון דיברסבילי , **ותכולתו האנזימטית** משתנה כתלות בסוג התא שבו הוא נמצא. בתאי צמחים למשל , נמצא שני סוגי פרוקסיזומים עיקריים , אחד בעלים שמשתתף בריאקציית פוטורספרציה , וסוג אחר בזרעים, שם הוא ממיר חומצות שומן לסוכרים שנחוצים לגדילת הצמח.
תהליך המרת השומן לסוכר בפרוקסיזום של צמחים מתרחש במסלול מטבולי שנקרא glyoxylate cycle , אי לכך פרוקסיזומים בזרעי צמחים נקראים גליוקסיזומים. בתהליך הזה נוצר בגליוקסיזום אציטיל קו-A משבירת חומצות שומן , הוא הופך להיות חומצה סוקציניט , ואז זו יוצאת אל הציטוזול שם היא מומרת לגלוקוז.
אין תהליך מקביל בבעלי חיים , ולכן בעלי חיים אינם מסוגלים להמיר שומן לסוכר.
מלבד השוני בפרוקסיזומים בין תאים שונים בגוף , נמצא גם שפרוקסיזום משתנה בתא נתון בהתאם ךתנאי הסביבה. בגידול שמרים במצע סוכרי נראו פרוקסיזומים קטנים , בעוד גידול אותם שמרים במצע עשיר באתנול ושומן גרם להתפתחות פרוקסיזומים גדולים וענפים , כדי שהתא יוכל לשבור את האתנול ואת השומן.
55
פיגר 12-44
מבנה הפלאסמהלוגן
פלאסמהלוגנים מהווים בין 80% ל 90% מהרכב **הפוספוליפידים** בממברנת המיילין. תהליך הייצור שלהם מתחיל בפרוקסיזום.
לפלאסמהלוגנים יש מבנה ייחודי:
- שלד של גליצרול
- פוספט טעון
- קבוצת ראש טעונה חיובית של אתנולאמין
- זנב **אחד** של חומצת שומן ארוכה
- זנב אחד של fatty alcohol
המטען נטו על plasmalogen הוא 0
56
פיגר 12-45
העלים של צמחים , הפרוקסיזום נמצא באסוציאציה (כנראה דרך הממברנות) עם הכלורופלסט , ככל הנראה כדי ליעל את תהליכי הפוטורספרציה.
בתאים צמחיים הואקוולה היא המקבילה של הליזוזום בתאים אנימליים.
כמו כן רואים פרוקסיזומים בזרעי עגבניה (גליוקסיזום ), רואים קרבה פיזית בין הגליוקסיזום לטיפות השומן , הפרוקסיזום בזרעים משחק תפקיד חשוב במטבוליזם של שומן ובגלוקונאוגנזה בזמן **הנביטה** של הזרעים.
57
ה import של חלבונים לפרוקסיזום:
עושה שימוש רחב בפרוקסינים peroxins
כל הגנים שמקודדים לחלבוני הפרוקסיזום נמצאים בגרעין. שני מסלולים לייבוא חלבונים לפרוקסיזום:
- דרך ה ER
- ישירות מהציטוזול (רוב החלבונים)
**ייבוא דרך ה ER**:
מסלול זה משמש לייבוא חלק **מהחלבונים האינטגרליים של ממברנת הפרוקסיזום**. תחילה חלבונים אלה מוכנסים ל ER דרך הטרנסלוקטור sec61 , בשלב השני , החלבונים הללו נארזים בוזיקולות פרוקסיזימליות ראשוניות specialised peroxisomal precursor vesicles , שמנצות מה ER ומתאחות יחדיו ליצירת פרוקסיזום חדש , או לחילופין מתאחות עם הממברנה של פרוקסיזום קיים.
**ייבוא ישיר מהציטוזול**:
חלבונים אלו מיוצרים בציטוזול ומיובאים באופן ישיר **לפרוקסיזומים קיימים**. רוב חלבוני ה cargo הפרוקסיזימליים מיוצרים בציטוזול ולא ב ER. לחלבונים כאלה יתכנו שני סוגים של רצפי סיגנל שמכוונים אותם:
1) רצף סיגנל קצר **שממוקם בקצה הקרבוקסילי של חלבון ה cargo** , ומורכב מ 3 חומצות האמינו , סרין, לזין, לאוצין (SKL).
2) רצף סיגנל מעט יותר ארוך מה SKL , **ומעט הידרופובי** שממוקם בקצה האמיני של חלבון ה cargo.
**מספיק אחד מבין השניים כדי להביא חלבון מהציטוזול לפרוקסיזום**.
לשים לב: יצירת פרוקסיזום חדש היא רק דרך המסלול שמערב ER , כמו כן בגלל שיש פה וזיקולות , אז פרוקסיזום קיים גדל גדל במנגנון הזה.
יבוא חלבונים לפרוקסיזום דורש השקעת אנרגיה של אטפ , ומערב קבוצה של חלבונים שנקראים **פרוקסינים** peroxins שמקטלזים את התהליך.
חלבוני cargo בעלי רצף SKL מיובאים לפרוקסיזום ע״י רצפטור ציטוזולי שנקרא pex5 ,פקס5 קושר את ה cargo שלו בציטוזול ומלווה אותו כל הדרך עד לממברנת הפרוקסיזום , פה הם פוגשים טרנסלוקטור שיושב על גבי הממברנה , וזה מכניס את ה cargo אל תוך האברון.
אחרי שחרור ה cargo אל תוך הפרוקסיזום , יש צורך למחזר את pex5 ולהחזיר אותו לציטוזול. תהליך המחזור של pex5 לציטוזול דורש תחילה סימון שלו ע״י **תג יוביקוויטין**. שרשרת היוביקוויטין שנוצרת על pex5 משמשת שני חלבוני **ATPase** כמעין מנוף שבעזרתו **ובעזרת האנרגיה מביקוע של מולקולת אטפ** הם משחררים אותו מהפרוקסיזום לציטוזול. שני חלבונים ה ATPase הם בעצמם פרוקסינים ונקראים pex6 ו- pex1.
חלבוני cargo בעלי רצפי סיגנל שנמצאים בקצה ה N-טרמינלי , משונעים לפרוקסיזום ע״י רצפטור ציטוזולי אחר , גם כן פרוקסין , שנקרא pex7. פה מתלווים לקומפלקס pex7-cargo חלבוני עזר אחרים **שגם הם פרוקסינים**. התהליך עצמו ברמת העיקרון דומה ל import דרך pex5.
הטרנסלוקטור על ממברנת הפרוקסיזום הוא קומפלס חלבוני , טרנסממברנלי שמורכב מלפחות 6 פרוקסינים. הוא ייחודי בכך שהוא יכול לקבל אליו חלבוני cargo מקופלים לחלוטין (ולא רק ישרים כמו במיטוכונדריה וב ER).
כמו כן נמצא , שהוא יכול לשנות את הגודל שלו בהתאם לגודל ה cargo שהוא עושה לו טרנסלוקציה , עד כדי כך שנמצא שהוא מסוגל אפילו להכניס אוליגומרים , מבלי שתהיה דליפה של חומרים דרכו מהפרוקסיזום לציטוזול.
ניתן להבין את מידת החשיבות של טרנספורט לפרוקסוזים , מהסתכלות על תסמונת זילוויגר zellweger. זוהי מחלה תורשתית , שבה פגיעה בכל אחד מבין 12 הפרוקסימים שפועלים במסלול יכולה לגרום לטרנספורט לקוי ועל כן לקליניקה. הפתופזיולוגיה הכי נפוצה של התסמונת היא מפגיעה ב pex1.
בגלל הפגיעה במערכת הפרוקסינים , ועל כן ב import לפרוקסיזום , הפרוקסיזום נותר ריק , **וחומצות שומן ארוכות + ח.ש מסועפות** שאמורות להגיע אליו ולהתפרק בתוכו מצטברות בציטופלסמה , כמו כן ישנה פגיעה בייצור פלאסמהלוגנים. פרטים חולים סובלים מפגיעה במוח , בכליות ובכבד , ומתים זמן קצר לאחר הלידה.
אסוציאציה: פרוקסיזום אינו קיים בארתרוציטים -> sickle cell -> רצף SKL
58
פיגר 14-46
צמיחת פרוקסיזומים והיווצרות חדשים
וזיקולות פרוקסיזימליות ראשוניות precursor vesicles מנצות מה ER.
במסלול הזה פועלים לפחות שני פרוקסינים ממברנליים - כאלה שיושבים על ממברנת הוזיקולה - pex3 ו- pex15.
המנגנון דרכו הוסיקולות מנצות , ושמבטיח שרק חלבונים פרוקסיזומליים יהיו בתוכן אינו מובן עד הסוף , אך ידוע שהוא תלוי בפרוקסין pex19 ובעוד חלבונים ציטוזוליים אחרים.
הוזיקולות המנצות מה ER מביאות עימן חלבונים ושומנים ממברנליים , ובכך ממברנת הפרוקסיזום גדלה.
כמו כן , **על ממברנת הפרוקסיזום יש קולטנים וטרנסלוקטורים שיודעים לקבל חלבונים מהציטוזול** , לרבות תת יחידות של הקולטנים והטרנסלוקטורים עצמם שנחוצות לחידוש ותיקון הקיימים.
59
הרשתית האנדופלסמטית:
ER
אברון ענק , הממברנה שלו מהווה כ 10% מהנפח הכולל של התא , ובתאים אנימליים כ 50% מסך כל הממברנות בתא (כלומר אם היינו פורסים את הממברנות של התא לכדי משטח יחיד ורציף , חצי ממנו היה ממברנת ה ER.
זוהי מערכת ענפה **והמשכית** של ממברנות , דמויית רשת , לאזורים מסויימים בה יש מבנה של צינורות (SER) , ולאזורים אחרים יש צורה של שקיקים דחוסים (RER) (פיגר 12-14).
הרשתית האנדופלסמטית משתרעת על פני כל הציטוזול , כך שכל אזור בציטוזול נמצא בסמיכות לאיזשהו חלק של ה ER. הרשת גם המשכית עם הממברנה החיצונית של הגרעין. **התווך** של הרשתית האנדופלסמטית , או בשמו האחר **הלומן** , הוא גם כן המשכי עם המרווח הבין ממברנלי שקיים בין שתי הממברנות של הגרעין.
ל ER יש תפקיד מרכזי בביוסנתזה של חלבונים ולפידים רבים , חלבונים **טרנסממברנליים** וליפידים רבים שעל פני ממברנות האברונים השונים בתא , ושל הממברנה עצמה , מיוצרים **בממברנה** של ה ER. הלומן של ה ER אוגר בתוכו יוני סידן **אינטראצלולריים** שמשמשים את התא במסלולי signaling
**מלבד הגרעין , המיטוכונדריה והכלורופלסט ה ER מיצר חלבונים עבור שאר האברונים**
כמו כן , מרבית החלבונים שמיועדים להפרשה מחוץ לתא , וכן חלבוני הלומן של ה ER , חלבוני הגולג׳י והליזוזום מגיעים תחילה ללומן של ה ER וממנו לייעדם הסופי.
60
ה ER הוא בעל מבנה ותפקיד מגוונים בתאים שונים:
כל התפקידים והפעולות שה ER ממלא הם חשובים במידה כזאת או אחרת בכל סוגי התאים , אולם תכונות מסויימות שלו הן בעלות חשיבות יתרה בתאים מסויימים , יחסית לתאים אחרים.
כדי לתת מענה לצרכים השונים של סוגי התאים השונים שהוא נמצא בהם , נראה שהממברנה של ה ER עוברת סוג של **התמחות אזורית פונקציונלית** , כך שחלקים מסויימים בה משתנים ומתאימים את עצמם לפי סוג התא שבו הם נמצאים. הדבר בוחט במיוחד באבחנה שאנחנו עושים בין ה RER לבין ה SER (פיגר 12-15).
שתי המערכות הממברנליות המשכיות זו לזו , אך כל אחת מתמחה בתפקיד אחר:
- הרשתית המחוספסת , שעשירה בריבוזומים , מתמחה בסנתזה של חלבונים
- הרשתית החלקה , חסרה ריבוזומים , מתמחה בעיקר בביוסנתזה ומטבוליזם של שומנים
כל התאים מכילים גם RER וגם SER , אך הדומננטיות של סוג אחד נקבעת לפי צורכי התא. כך למשל , בתאים אקסוקריניים בלבלב , שמפרישים מדי יום כמויות אדירות של אנזימי עיכול , שוות ערך למשקל התא עצמו , ה RER מהווה דווקא 60% מסך הממברנות של התא , מצב דומה בתאי β בלבלב ובתאי פלסמה שמפרישים נוגדנים , הם מכילים מערכת RER ענפה (טבלה 12-2).
**ה SER הוא יותר דיברסבילי בתפקידיו מאשר ה RER** , ויכול לעבור התאמות רבות ושונות לפי סוג התא:
1) מה SER יוצאות הוזיקולות שמגיעות אל הגולג׳י. בעצם מדובר בסוג מסויים של SER שעבר התמחות , **הוא נמצא בכל סוג התאים** , ונקרא **transitional ER** , ווזיקולות שמכילות שומנים וחלבונים שנוצרו ב ER יוצאים ממנו אל הגולג׳י.
2) בתאים שמייצרים הורמונים סטרואידיים יש מערכת SER ענפה ומפותחת , שמכילה אנזימים רבים שמייצרים כולסטרול , או עושים בו מודיפיקציות ליצירת ההורמונים שנגזרים מכולסטרול.
3) היפטוציטים , סוג התאים העיקרי שיש בכבד , מכיל רשתית אנדופלסמטית חלקה מפותחת מאד גם כן. ה SER בהיפטוצית משרת שתי מטרות עיקריות:
- מכיל את האנזימים הרבים הנחוצים לסנתזה של הרכיב השומני של ליפופרוטאינים (כמו למשל LDL) , אנזימים אלה נמצאים **בממברנה** של ה SER.
- הממברנה של ה SER בהפטוציטים מכילה אנזימים רבים שפועלים על נטרול רעלנים , תרופות ועל דטוקסיפיקציה של פסולת מטבולית , כמו למשל משפחת האנזימים ציטוכרום P450. משפחת האנזימים האלה הופכים חומרים הידרופוביים , כמו תרופות למשל לחומרים מסיסים שניתן להפריש אותם בשתן. אחרת אותם חומרים ורעלים הידרופוביים היו מצטברים **בממברנ של התא**.
תפקיד נוסף של ה ER במרבית התאים היוקריטים הוא אגירת סידן , ובכך להוריד את הריכוז שלו בציטוזול (ולהוריד לחץ אוסמוטי). הסידן משמש כאמור במסלולי סיגנל תאיים , השחרור שלו מה ER וקליטה חוזרת שלו ב ER על כן מתרחשים לפי סיגנלים חוץ תאיים שמגיעים לתא , והוא בתורו ממשיך את הטרנסדוקציה של אותו סיגנל חוץ תאי.
על פני ממברנת ה ER יש **משאבת** סידן שמכניסה סידן מהציטוזול ללומן , בתוך ה ER יש חלבונים בעלי אפיניות גבוהה לסידן , הם קושרים אותו ובכך הסידן מתאחסן ב ER. **בסוגי תאים מסויימים , אזורים ספיציפיים של ה ER מתמחים באחסון סידן.**
4) בתאי שריר , ה ER החלק עובר סוג נוסף של התמחות , בתאים אלה ה SER הוא מאד מפותח ונקרא sarcoplasmic reticulum, שחרור הסידן ע״י הסרקופלסמיק רטיקולום וקליטתו מחדש מניעה כיווץ והרפיה של השריר בהתאמה.
5) ההתמחות נוספת של ה SER היא בממברנה שלו , אזורים מסויימים עוברים שינויים והתאמות כדי שיוכלו להתחבר (סוג של איחוי) לממברנות של אברונים אחרים , כגון מיטוכונדריה , פלסטידות , אנדוזום וממברנת הפלסמה. האתרים האלה - organelle contact sites , הם אזורים בממברנת ה SER שעשירים בחלבונים שמסייעים במעבר מטבוליטים בין שני האברונים המאוחים. (פיגר 12-16).
למשל , מעבר של לפידים מאתר הייצור שלהם בממברנת ה SER למיטוכונדריה מתרחש דרך ה contact sites , מעבר של **פוספואנוזיטידים** (לפידים שמעורב במסלולי סיגנל) לממברנת הפלסמה מתרחש גם כן באתרים האלה.
61
כדי ללמוד על התכונות **הביוכימיות** של ה ER יש צורך לבודד אותו:
תחילה יש לעשות פרגמנטציה של ה ER ולשבור אותו לחלקים , החלקים האלה במבחנה מתחברים חזרה ביחדכדי צורונים קטנים , בין 100 ל 200 ננומטר , צורונים אלה נקראים מיקרוסומים microsome (פיגר 12-17). תכונה בולטת של המיקרוסומים היא שהם ממשיכים להיות פונקציונליים ולקיים את תפקיד ה ER שממנו הם נוצרו:
- טרנסלוקציה של חלבונים
- גליקוזילציה של חלבונים
- שחרור ואגירת סידן
- וסנתזה של ליפידים
עובדה מעניינת נוספת , היא שהמיקרוזומים שומרים על תכונות הממברנה המקורית שהתפרקה , כלומר מה RER יווצרו מיקרוסומים מחוספסים שמכילים ריבוזומים **ומעט לומן** , ומה SER יווצרו מיקרוזומים חלקים , שאין עליהם ריבוזומים , את יש עליהם חתיכות של ממברנות מאברונים אחרים (הודות ל contact sites).
המיקרוסומים המחוספסים הם יותר כבדים מהחלקים , ולכן ניתן להפריד אותם דרך צינטרפוגה לשתי פאזות , כבדה שנמצא יותר למטה וקלה שצפה יותר למעלה.
ניתן לבודד מיקרוסומים חלקים על סמך החלבונים שיש עליהם.
שיטה זו אינה יעילה כדי ללמוד על התכונות המולקולריות של ה ER.
62
פיגר 12-15:
RER VS. SER
בתאים שונים יש עדיפות לסוג אחד של ER על פני האחר.
בתאים אקסוררינים בלבלב העדיפות היא ל RER הודות לכמות החלבונים הרבה שהתאים מפרישים. מעטפת הגרעין , שהממברנה החיצונית שלה המשכית ל ER גם היא מלאה בריבוזומים מבחוץ.
בתאי lydig באשכים העדיפות היא ל SER שמתמחה במטבוליזם של ליפידים. תאים אלו מפרישים טסטוסטרון , שהוא הורמון סטרואידי שמיוצר מכולסטרול.
מוצגת תמונה סכמטית של ה ER שמורכב מ rough ER ומ smooth ER.
נראה את ההבדל המורפולוגי שלהם , ה RER בנוי משקיקים דחוסים , שנקראים **ציסטרנות** , עובי כל ציסטרנה הוא בין 20 ל 30 ננומטר , בתווך נמצא הלומן. ה SER בנוי בצורת צינוריות (tubules) , עובי כל צינורית הוא 30 ל 60 ננומטר.
63
פיגר 12-17
בידוד מיקרוסומים של ה ER
כאשר תא שלם עובר **הומוגינציה** , רבים מהאברונים שלו עוברים פרגמנטציה , הפרגמנטים האלה מתאחים לאחר מכן ויוצרים מיקרוסומים.
כאשר עושים שיקוע של המיקרוסומים במבחנה , משתמשים בגרדיינט של סוכרוז (ריכוז נמוך למעלה וריכוז גבוה למטה של סוכרוז) , כך נוצרות שתי פאזות נפרדות זו מזו של מיקרוסומים על סמך הצפיפות שלהם. היותר צפוף שוקע למטה , לריכוז הגבוה של הסוכרוז.
מיקרוסומים מ SER מכילים חלקים ממברנות של אברונים אחרים , ואין עליהם ריבוזומים והם צפופים פחות , ולכן צפים למעלה.
64
הגילוי הראשון של רצפי סיגנל נעשה בעזרת חלבונים מיובאים ל RER:
חלבונים מגיעים ל ER מהציטוזול בעודם מתורגמים (טרנסלוקציה קו- טרנסלטורית).
חלקם מהם , הם חלבונים טרנסממברנליים , שעוברים טרנסלוקציה חלקית ומוטמעים בממברנה של ה ER , החלק השני , הם חלבונים מסיסים , שעוברים טרנסלוקציה מלאה , ונכנסים ללומן של ה ER.
חלק מהחלבונים שנכנסים ללומן הם חלבוני resident של ה ER ונשארים בו כל חייהם , חלק אחר מיועדים להגיע לאברונים אחרים או לממברנת הפלסמה , החלק האחרון מיועדים להיות מופרשים מחוץ לתא.
כל סוגי החלבונים הנ״ל , ללא שום קשר ליעד הסופי שלהם , כולם חייבים להכיל רצף סיגנל ל ER שמכוון אותם אליו בראש ובראשונה.
הקונספט של רצפי סיגנל התגלה לראשונה בניסוי שעשו על חלבונים מסיסים המופרשים מחוץ לתא , כאמור חלבונים אלה צריכים להגיע תחילה ל ממברנת ה ER:
**מבחנה1:** הכניסו למבחנה זו תכולה ציטוזולית , כולל mRNA שמקודד לאותם חלבונים מופרשים , ריבוזומים חופשיים אך ללא התאים עצמם cell free environment וללא ER , החלבונים שנוצרו בניסוי על הריבוזומים היו גדולים יותר מהחלבונים הרגילים שהתא מפריש.
**במבחנה2:** אותם דברים כמו מבחנה1 אך בתוספת מיקרוסומים מחוספסים , בניסוי הזה ראו שאותם חלבונים שמיועדים להפרשה , היו בגודל תקין , ונמצאו **בתוך המיקרוסום**.
**מבחנה3**: כדי לאשש את הממצאים , הם שחזרו במבחנה הזו את התנאים ממבחנה1 , אך הפעם הכניסו mRNA שמקודד לחלבון ציטוזולי , ואכן החלבון היה בגודל תקין.
כדי להסביר את הממצאים הונחה ההיפותזה שהחלבון מהמבחנה הראשונה היה גדול יותר כי הוא הכיל רצף סיגנל שמורכב מחומצות אמינו נוספות , שבנוכחות המיקרוסום המחוספס או RER מכוון אותו אליהם , בהגעת החלבון למיקרוסום או ל RER רצף הסיגנל נחתך **עוד בממברנה** ע״י signal peptidase , והחלבון ״הבשל״ מגיע ללומן.
65
פיגר 12-18
**נקודה ראשונה** בפיגר: רצף הסיגנל **ללומן** של ה ER הוא הקצה ה N-טרמינלי
**נקודה שניה**: הטרנסלוקטור על הממברנה מייצר מבנה של פורה שדרכה חלבון ה cargo נכנס לייעד שלו.
**שלש:** אנזים ה signal peptidase נמצא על הממברנה , **סמוך לטרנסלוקטור** עצמו (אולי אפילו יש בינהם אינטראקציה לפי ניסוח הספר) , הוא חותך את רצף הסיגנל **תוך כדי** תרגום החלבון , ולבסוף החלבון משתחרר ללומן ה ER.
**נקודה רביעית** ואחרונה: הטרנסלוקטור נמצא במצב סגור כל הזמן , הוא **נפתח רק כאשר ריבוזום נקשר אליו** , כך בעצם נוכחות הטרנסלוקטורים אינה משנה את חדירות הממברנה.
**לברר לגבי שאר האברונים , האם הטרנסלוקטור פתוח או סגור , ואיך זה משפיע על החדירות**.
66
רצפטור מסיס ציטוזולי , נקרא SRP , מכוון חלבוני cargo ל ER:
**SRP = signal recognition particle**
הרצפטור נמצא משייט בציטוזול , כשהוא מזהה את רצף הסיגנל שעל חלבון ה cargo , הוא נקשר אליו , ומביא אותו , ביחד עם הריבוזום , אל ממברנת ה ER לשם טרנסלוקציה.
בתהליך מעורבים שני סוגי רצפטורים. כאמור , אחד מסיס שנמצא בציטוזול הלא הוא ה SRP. הרצפטור השני , SRP receptor , הוא רצפטור ממברנלי , וכשמו כן הוא , הוא יודע לזהות ולקשור את ה SRP שמגיע מהציטוזול.
ה SRP עצמו הוא קומפלקס גדול , בבעה״ח מורכב מ **6 שרשראות פוליפפטידיות שקשורות למולקולת רנא אחת**. ה SRP וה SRP רצפטור הם מבנים מולקולריים ששמורים אבולוציונית , וכך הומולוגים של שניהם קיימים בכל האורגניזמים , אם כי בחיידקים המבנה שלהם יהיה מעט יותר קטן , ויכיל פחות תת יחידות.
ל ER יש מספר רצפי סיגנל שמכוונים אליו , הם מגוונים מאד , ונבדלים ברצף חומצות האמינו שמרכיבות אותם , אולם נמצא שלכולם יש מוטיב מבני משותף , **הם כולם מכילים כ 8 חומצות אמינו לא פולריות במרכזם**.
למרות המגוון הנ״ל בהרכב חומצות האמינו של רצפי הסיגנל ל ER , ה SRP עדיין יודע לזהות את כולם , לקשור אותם ולהביאם ל ER , כיצד?
מסתבר שהסוד הוא במבנה של ה SRP , ל SRP יש אתר מיוחד , **יחסית גדול**, שנקרא signal sequence binding site , דרכו הוא קושר את רצפי הסיגנל. באתר הזה קיים רצף של חומצות אמינו **הידרופוביות** , בעיקר **מתיונין** , שדרכה , הודות למבנה הגמיש והלא מסועף של שייר הצד שלה , ה SRP יכול לקשור מגוון רחב של רצפי סיגנל שונים , הנבדלים בגודלם ובצורתם , ולהביאם בזאת לממברנת ה ER.
**מבנה ה SRP ביוקריוטים:**
ל SRP ביוקריוטים יש מבנה דמויי ציר , שיכול להיפתח ולהיסגר , hinge rodlike structure (שקף 12-19). בשני הקצוות שלו יש שני דומיינים חשובים:
- tranlation pause domain
- signal sequence binding pocket
הודות למבנה ה hinge , ה SRP יכול להתלפף מסביב לתת היחידה הגדולה של הריבוזום , בכך הקצה של ה binding pocket מתמקם ליד האתר בריבוזום ממנו יוצאים הפפטידים החדשים (E site ?) , וזה מבטיח שה SRP יקשור את רצף הסיגנל מיד איך שהוא נוצר ויוצא מהריבוזום!
**לאחר** שה SRP קשר את רצף הסיגנל דרך ה pocket שלו , הקצה השני , שמכיל את ה pause domain , נקשר **לאזור הממשק** שבין שתי היחידות הריבוזומליות , הגדולה והקטנה , באזור זה נמצא האתר אליו נקשרים **פקטורי אלונגציית התרגום** , ובכך נחסמת הגישה שלהם , מה שגורם להאטה ועיכוב בקצב התרגום.
ההאטה בקצב התרגום נותן למערכת מספיק זמן להגיע לממברנת ה ER , כך שהחלבון שמיוצר לא משתחרר בציטוזול , דבר זה חשוב במיוחד עבור **הידרולאזות** (אנזימים שמבקעים בעזרת מים) , הרי אם אנזימים אלה ישוחררו בציטוזול הם יהרסו הכל ויפרקו הכל , ולכן חשוב שהם יסונתזו אך ורק ב ER , וממנו יגיעו לייעדם - **או הפרשה מחוץ לתא או לליזוזום**. אי לכך נמצא בתאים רבים שמייצרים הידרולאזות שהציטוזול שלהם עשיר במעכבי הידרולאזות כקו הגנה שני נגד טעויות במסלול.
בציטוזול , כאשר רצף הסיגנל שעל הפפטיד המתהווה נקשר ל SRP , נחשף על גבי ה SRP אתר קישור ל SRP רצפטור , שהוא קומפלקס חלבוני טרנסממברנלי שנמצא על ממברנת ה **RER**. וכך , הקומפלקס SRP-ribosome מגיע ל RER , וה SRP נקשר לרצפטור שלו.
הרצפטור ממוקם סמוך לטרנסלוקטור שמכניס את ה cargo ל ER. אי לכך , הקישור **הספיציפי** בין הרצפטור ל SRP , ממקם את הריבוזום על גבי הטרנסלוקטור , בשלב הזה קצה ה binding pocket זז מהמקום שלו (היכן שהפפטיד יוצא מהריבוזום), ואת מקומו לוקח הטרנסלוקטור , כך שהחלבון שמסונתז , מסונתז ישירות דרך הטרנסלוקטור אל ה ER, כעת ה SRP וה SRP רצפטור מתנתקים זה מזה (הריבוזום נשאר על הטרנסלוקטור) וקצב התרגום חוזר להיות רגיל.
67
פיגר 12-19
ה SRP
ה SRP ביונקים הוא אינו קומפלקס חלבוני אלא קומפלקס **ribonucleoprotein** , כלומר מורכב מחלבונים ומרנא , בעצם 6 שרשראות פפטידיות ומולקולת רנא אחת.
מולקולת הרנא מהווה את ה backbone שמחבר את הדומיינים החלבוניים השונים. בקצה אחד של מולקולת הרנא נמצא את הדומיין של ה signal sequence binding pocket ובקצה השני את ה translational pause domain.
אתר הקישור של ה SRP לרצף הסיגנל , בעצם ה signal sequence binding pocket עשיר בחומצות אמימו **הידרופוביות** , במיוחד מתיונין.
אופן הקישור בין ה SRP לריבוזום פוענח בעזרת טכנולוגיית cryo-electron microscopy
הקישור בין רצף הסיגנל ל SRP גורם לשינוי בקונפורמציה של ה SRP , ובכך נחשף אתר קישור ל STP רצפטור.
68
פיגר 12-20
מנגנון הטרנספורט ל ER
1) הכל מתחיל בציטוזול כאשר ה SRP קושר בו״ז גם את הריבוזום וגם רצף הסיגנל שעל הפפטיד המתהווה , וגורם לעיכוב בתהליך התרגום.
2) ה SRP רצפטור , שהוא חלבון טרנסממברנל , שבתאים אנימליים מורכב מ **שתי שרשראות פוליפפטידיות שונות** , נקשר ל SRP וממקם את הריבוזום מול הטרנסלוקטור.
3) ה SRP רצפטור , **בעודו קשור ל SRP** מתנתק מהטרנסלוקטור , ושניהם זזים הצידה , מה שמאפשר לטרנסלוקטור לקשור את הריבוזום בסמוך לאתר E , היכן שהפפטיד יוצא.
4) ה SRP משחרר כעת את רצף הסיגנל , **שנכנס אל תוך הטרנסלוקטור** , זה שמאתחל טרנסלוקציה של הפפטיד , בעודו מסונתז , דרך הממברנה. ה SRP והרצפטור שלו מתנתקים , וה SRP חוזר לציטוזול.
התהליך מונע ע״י **קישור והדרוליזה של גטפ**. **אחת** מבין 6 השרשראות הפפטידיות של ה SRP , **ושתי תת היחידות** שמרכיבות את ה SRP רצפטור מכילות אתרים לקישור גטפ. **מחזורים** של קישור והידרוליזת גטפ מבטיחים שה SRP יקשור את רצף הסיגנל בציטוזול (עקב שינוי בקונפורמציה ואפיניות גבוהה) , וישחרר אותו רק אחרי שהוא נקשר לרצפטור שלו ב RER (עקב שינוי קונפורמציה וירידה האפיניות).
**בכך האנרגיה מההידרוליזה של 3 מולקולות גטפ , מבטיחה טרנספורט כיווני מהציטוזול ל ER**.
69
טרנספר קו-טרנסלטורי ל ER
הודות למנגנון זה , נוצרים שני סוגי ריבוזומים שמופרדים מרחבית (אך זהים בכל קנה מידה אחר):
- **ריבוזומים שקשורים ל ER:** אלה נמצאים על גבי הממברנה של ה ER מצידה החיצוני שפוני לציטוזול.
- **ריבוזומים חופשיים**: שלא קשורים לשום ממברנה של שום אברון
הואיל ומספר ריבוזומים יכולים לקשור את אותה מולקולת mRNA בו״ז , נוצרים בתא מבנים שנקראים **פוליריבוזומים**. אם הפפטיד שמסונתז מכיל רצף סיגנל ל ER , הפוליריבוזום יוכוון מהציטוזול לממברנת ה ER , ההכוונה של הפוליריבוזום לממברנת ה ER נעשית ע״י מספר פפטידים שמסונתזים , כלומר כמה SRP’s נקשרים לכמה רצפי סיגנל ומכוונים את הפוליריבוזום ל ER , אני מניח שאם ריבוזום שקשור לאותו mRNA לא הספיק לקשור SRP החלבון שלו לא יכנס ל ER. הדבר הגיוני , כל ריבוזום צריך להיקשר לטרנסלוקטור משל עצמו , ולכן צריך SRP משלו.
כאשר ריבוזום כלשהו מהפוליריבוזום סיים לתרגם , הוא מתנתק מה mRNA ועוזב את הפוליריבוזום חזרה לציטוזול , שם היחידות שלו מתפרקות ונכנסות ל pool , ובמקומו מתיישב ריבוזום אחר על הטרנסלוקטור שהתפנה , כך שבמהלך התרגום ע״י הפוליריבוזום , ה mRNA נשאר על ממברנת ה ER.
70
פיגר 12-21
פוליריבוזום
במקור שלהם , ריבוזומים חופשיים וריבוזומים שקשורים ל ER שייכים לאותו מאגר ציטוזולי של **תת יחידות** ריבוזומליות. כל פוליריבוזום מתחיל את חייב בציטוזול , נוכחות רצף סיגנל בפפטיד שמיוצר גורם לחלק מהם לנטוש את הציטוזול ולהיקשר ל ER.
מולקולת ה mRNA נותרת קשורה ל ER כחלק מהפוליריבוזום , הריבוזומים עצמם מעים על גביה , וכאשר אחד מסיים לתרגם הוא מתנתק , ואחר תופס את המקום שלו.
71
השרשרת הפוליפפטידית מושחלת דרך תעלה **תלויית רצף** בטרנסלוקטור.
התעלה הזו היא חלק מהמבנה של הטרנסלוקטור!!
הכותרת בספר:
The polypeptide chain passes through a **signal sequence-gated aqueous** channel in the translicator.
הטרנספורט של חלבונים דרך ממברנת ה ER מתרחש דרך טרנסלוקטור. הטרנסלוקטור בנוי מ 10 סלילי α שבמרכזם ישנה תעלה מלאה במים (ועל כן aqueous) שנקראת sec61 complex, חלבונים חוצים את ממברנת ה ER דרך התעלה הזו , שבנויה **מ 3 תת יחידות שמורות אבולוציונית מחיידקים ועד תאים יוקריוטים** (שקף 12-22).
התעלה המרכזית של הטרנסלוקטור , sec61 complex , אינה פתוחה תמיד , **אלא שיש לה מנגנון gating**, בעצם היא נשארת סגורה ע״י מקטע פפטידי קטן , α הליקלי (נקרא לו plug) , ונפתחת רק במהלך הטרנסלוקציה. חשוב מאד לשמור את התעלה סגורה כדי למנוע בריחת סידן מה ER לציטוזול. במהלך הטרנסלוקציה ה plug זז , ומאפשר ל cargo להיכנס דרך התעלה המרכזית. ה sec61 נפתח רק בפני חלבונים שמכילים רצף נכון (ל ER) ובכך מנגנון ה gating נותן עוד רמת ביטחון שרק חלבונים שאכן מיועדים ל ER יגיעו אליו.
בפיענוח המבנה של sec61 , בטכניקת cryo electron microscope , נמצא שבטרנסלוקטור הממברנלי ב ER , מלבד התעלה המרכזית , יש גם שער לטרלי דרכו חלבון ה cargo נדחף **באמצעות רצף הסיגנל , כשהקצה ה N-טרמינלי שלו פונה לציטוזול** , ויוצא לממברנה. ההידחפות הזאת של הקצה האמיני דרך השער הלטרלי מרחיבה את **התעלה המרכזית** של הטרנסלוקטור , מה שגורם ל plug לזוז , כעת התעלה המרכזית פתוחה , הפפטיד מתארך ע״י הריבוזום , והטרנסלוקטור משחיל אותו פנימה דרך הממברנה. הטרנסלוקטור בעצם מכניס כעת את המקטע העוקב בפוליפפטיד (זה שמגיע ישר אחרי הקצה האמיני שיושב כעת בממברנה).
(פיגר 12-23).
רצף הסיגנל שהוא הידרופובי (כאמור מוטיב חוזר של 8 ח״א) ונמצא כעת בממברנה של ה ER , נחתך ע״י signal peptidase שגם הוא נמצא בממברנה , ומתנתק מהפפטיד. רצף הסיגנל החתוך מפורק מהר ע״י פרוטאזות שישנם בממברנה ובציטוזול.
ניתן לראות , אם כך , שהשער הלטרלי מהווה נתיב מעבר של חלבונים מהתעלה המרכזית בטרנסלוקטור לתוך הממברנה , ולכן אנחנו מזהים שלשער הלטרלי יש **שני תפקידים**:
- זיהוי וקישור של רצף הסיגנל בחלבון ה cargo (קשור למנגנון ה gating)
- נתיב הטמעה של חלבונים בממברנת ה ER
אנחנו אומרים שהטרנספורט ל ER הינו קו-טרנסלטורי , כי ברגע שרצף הסיגנל נדחף לשער הלטרלי , והתעלה המרכזית נפתחת , הפפטיד מתורגם ומתארך דרך הטרנסלוקטור - וכך הטרנסלוקציה והטרנסלציה מתרחשות במקביל.
במהלך האלונגציה , התעלה שנמצאת **בתת היחידה הגדולה של הריבוזום** ממנה יוצא הפוליפפטיד המתארך , מתיישרת עם התעלה המרכזית של הטרנסלוקטור , קונפיגורציה זו נותנת לפפטיד נתיב המשכי ורציף דרכו הוא עובר , החל **מאתר הפפטידיל טרנספרז במרכז הריבוזום - היכן שח״א חדשות מתווספות לפפטיד המתארך** , ועד ללומן של ה ER הנמצא במרחק של 15 ננומטר מהפפטדיל טרנספרז. במנגנון זה , **האנרגיה שמשמשת להארכת הפפטיד , משמשת בעקיפין גם לטרנסלוקציה שלו דרך הממברנה**.
**טרנספורט מהציטוזול ל ER דורש 3 מולקולות גטפ. הטרנסלוקציה ללומן עושה שימוש באנרגיה של תהליך האלונגציה!!**
בתום תהליך התרגום , בטרמנציה , הקצה הקרבוקסילי של הפפטיד משתחרר מהריבוזום , ״ומחליק״ דרך הטרנסלוקטור פנימה ללומן , כעת ה plug חוזר למקומו וסוגר את התעלה.
המשמעות של תהליך הטרנספורט ל ER , שמתרחש במקביל לתרגום , היא שחלבונים נכנסים ל ER **כשהם ישרים , ובטאם התקפלו**. בצורה כזאת , גם כשהחלבון שצריך להיכנס ל ER הוא גדול , בהיותו פתוח ערות המעבר שלו , sec61 , יכל להיות צר , ובכך נמנעת זליגה של תוכן ER החוצה.
72
פיגר 12-22
מבנה הטרנסלוקטור sec61.
בארכיאה הטרנסלוקטור נקרא secY .
כאמור הטרנסלוקטור בנוי מ 10 סלילי α , שהימהם ישנה תעלת טרנסלוקציה מרכזית :
תת יחידה α של הטרנסלוקטור היא בעלת מבנה **סודו-סמטרי** של inverted repeat (לפי פיגר 11-10 זהו המבנה של כל הטרנספורטרים?). לצידה יש שתי תת יחידות נוספות , שהן **יותר קטנות ממנה , β ו-γ (גאמא).
חלקים מסויימים של תת יחידה α שמבצבצים לציטוזול , הם אחה שקושרות את הריבוזום בזמן טרנסלוקציה.
במצב הפתוח של הטרנסלוקטור יתכנו בו שני סוגי העברה , טרנסלוקציה חוצת ממברנה (תעלה מרכזית). טרנסלוקציה לטרלית (שער לורלי).
73
פיגר 12-23
פתיחת הטרנסלוקטור מתרחשת באמצעות רצף הסיגנל
פתיחת הטרנסלוקטור היא דרך רצף הסיגנל ההידרופובי שנדחף לשער הלטרלי , כאשר הקצה האמיני של הרצף פונה לציטוזול.
הפפטיד משתחל דרך תעלה המשכית שמתחילה במרכז הריבוזום (בתת היחידה הגדולה) , דרך התעלה המרכזית של הטרנסלוקטור , ועד הלומן (במרחק 15 ננומטר).
74
טרנסלוקציה דרך ממברנת ה ER לא תמיד תהיה במקביל לאלונגציה:
ישנם חלבונים שמסונתזים במלואם בציטוזול , ורק לאחר מכן מיובאים ל ER , מה שמלמד שהטרנסלוקציה אינה תמיד מתרחשת במקביל להארכת הפפטיד (פיגר 12-24).
טרנסלוקציה פוסט טרנסלטורית שכיחה יותר ב ER של **שמר** , ובממברנה הציטופלסמטית של חיידקים (שכנראה יש בינהם קשר אבולוציוני).
הטרנסלוקטור sec61 , שבארכיאה ובחיידקים נקרא secY , מספק תעלה צרה דרכה חלבונים יכולים לעבור , מה שאומר שרק חלבונים ישרים ולא מקופלים יכולים לעבור דרכו. ואכן , גם חלבונים שמתורגמים במלואם בציטוזול ורק אז מיובאים ל ER (או לממברנה החיידקית) , נכנסים דרך קומפלקסי sec בעודם ישרים , הדבר מתאפשר הודות לחלבונים ציטוזוליים , לרוב שפרונים כללים ממשפחת hsp70 (שפרונים ציטוזוליים) , שנקשרים לחלבונים , ומונעים מהם להתקפל או ליצור אגרגטים , ומביאים אותם בעודם פתוחים ליעד שלהם. בעת שחלבון ה cargo עובר דרך התעלה הצרה של קומפלקס sec , השפרונים מתנתקים ממנו.
בהגיע החלבון הלא מקופל + השפרונים אל הטרנסלוקטור sec61 , בדומה למנגנון הקו-טרנסלטורי , רצף הסיגנל ההידרופובי בקצה האמיני נדחף לשער הלטרלי של הטרנסלוקטור , וגורם לפתיחת התעלה המרכזית , אולם השלב הבא שונה בין שני המנגנונים. אם במסלול הקו-טרנסלטורי האנרגיה של תהליך האולונגציה סיפקה גם כח מניע לתהליך הטרנסלוקציה , במסלול הפוסט טרנסלטורי ״האנרגיה היא אנרגיה צלולרית״ , שחלבונים נלווים שמלווים את הפפטיד והשפרונים משתמשים בה כדי **לדחוף** את החלבון מצד הציטוזול פנימה , או למשוך אותו מצד **מהלומן** פנימה (פיגר 12-25).
=>
בתאים יוקריוטים , משיכת הפפטיד **מהצד הלומינלי** פנימה אל תוך ה ER , מערבת קומפלקס חלבוני טרנסממברנלי שיושב בממברנת ה ER , הקומפלקס בנוי משני החלבונים sec62 ו- sec63 , הוא נקשר לטרנסלוקטור sec61 , וממקם שפרון hsp70 לומינלי (שנקרא bip) קרוב לפתח של הטרנסלוקטור שפונה ללומן. בדומה ל hsp70 הציטוזולי גם ה bip העא בעל אפיניות גבוה לחלבונים פתוחים ולא מקופלים , בהיותו ממוקם סמוך לפתח הלומינלי של הטרנסלוקטור , bip טופס את השרשרת הפפטידית ברגע שהיא נכנסת ללומן ונקשר אליה בחזקה .
הקישור של bio לשרשרת הפוליפפטידית מהצד הלומינלי , מונע ממנה להחליק החוצה מה ER חזרה לציטוזול , וגורם לה להיכנס עוד ועוד אל תוך הלומן , כך מגיעים עוד שפרוני bip ונקשרים אליה. בעצם חלבון bip מבקע מולקולת אטפ , מה שגורם לו להשתחרר מהשרשרת , ואז הוא הולך ונקשר לאתר אחר שלה , וכך היא נמשת פנימה (מחזורי bip הם לפי רצף קישו וביקוע של אטפ ושינויי קונפורמציה). ביקוע האטפ ע״י bip מספק את הכח המניע שדוחף את התהליך קדימה (וחא אנרגיית האלונגציה).
**חיידקים** שרוצים לעשות מסלול דומה דרך הממברנה הציטופלסמטית שלהם , ולהפריש חלבונים מחוץ לתא דרך הטרנסלוקטור secY , משתמשים בחלבון אקססורי ציטוזולי שנקרא secA ATPase (מחוץ לתא אין מקור אנרגיה שזמין עבור החיידק בצורת אטפ ולכן secA חייב להיות בציטוזול). secA נקשר ל secY בצד הציטוזולי שלו , ומבקע אטפ כדי לדחוף את החלבון מחוץ לתא , secA פועל במהגנון דמויי בוכנה , בכל פעם שהוא מבקע מולקולת אטפ הוא בעצמו נכנס לטרנסלוקטור (פיגר 12-25 c) ומכניס חלק מהשרשרת הפפטידית , בנוסף , הקישור שלו אליה מונע חזרתה לציטוזול (גם כן מדובר במחזורים של שינוי קונפורמציה וביקוע אטפ).
75
פיגר 12-25
קיימים 3 סוגים שונים של טרנסלוקציה דרך טרנסלוקטורים דומים:
כאמור , המשותף הוא הטרנסלוקטורים , הם כולם הומולוגים אך נמצאים באורגניזמים שונים:
1) **טרנסלוקציה קו-טרנסלטורית:** קיימת ב 3 סוגי הממלכות , יוקריוטים , ארכאה , וחיידקים. מסלול זה מערב בשלשתם את הטרנסלוקטר sec61 (או המקבילה שלו secY) , את הרצפטור הציטוזולי SRP , ו SRP רצפטור ממברנלי. אינו דורש מקור אנרגיה מלבד זו שמסופקת במהלך האלונגציה , המקום היחיד שבו השרשרת הפפטידית יכולה להתארך הוא רק אל תוך הטרנסלוקטור , ובכך להשתחל מחוץ לתא בפרוקריוטים , או להשתחל את תוך למון ה ER ביוקריוטים.
2) **טרנסלוקציה פוסט-טרנסלטורית ביוקריוטים**: מערבת את הקומפלקס הממברנלי sec62/sec63. הקומפלקס נקשר לטרנסלוקטור sec61 , וממקם חלבוני bip סמוך לפתח היציאה שלו בלומן , אלה מושכים את השרשרת פנימה ובו בזמן מבקעים אטפ.
3) **טרהסלוקציה פוס טרנסלטורית בחיידקים**: השרשרת הפפטידית מוכנסת לטרנסלוקטור secY (המקביל של sec61) מהציטוזול , ATPase בשם secA דוחף אותה החוצה כנגד ביקוע אטפ ומונע ממנה חזרה לציטוזול. ביקוע האטפ גורם לשינוי בקונפורמציה של secA.
הטרנסלוקטור sec61 (או secY) קיים בכל סוגי הארגניזמים , ובתוך כך SRP ו- SRP receptor. ה secA קיים רק בחיידקים , הקומפלקס sec62/sec63 קיים רק ביוקריוטים.
76
הטמעת חלבונים בממברנת ב ER:
חלבונים אלה מכילים סגמנטים הידרופוביים , טרנסממברנליים שמתפקדים כרצפי סיגנל:
**כל החלבונים הטרנסממברנליים בממברנת ה ER , גולג׳י , ליזוזום , אנדוזום , וזיקולות הפרשה , וממברנת הפלסמה , כולם , מוטמעים תחילה בממברנת ה ER , ורק לאחר מכן משונעים לייעד הסופי שלהם**.
חלבונים טרנסמנברנליים שמיוצרים בממברנת ה ER חייבים להכיל **סגמנט הידרופובי , α הליקלי אחד לפחות**. אי לכך , במהלך הביוסנתזה של חלבוני ממברנה , מקטעים מהחלבון יימוקמו בממברנה , חלקים אחרים ישארו בציטוזול , ולבסוף נדרשת ההטמעה של החלבון השלם בתוך הממברנה.
בדומה לטרנסלוקציה של חלבונים מסיסים ללומן של ה ER , גם בהטמעת חלבונים בממברנת ה ER השחקנים הם אותם שחקנים: sec61 , רצפטור SRP ממברנלי , ולבסוף SRP בציטוזול. הסיבה לכך היא שהרצפים הטרנסממברנליים ההידרופוביים שמשמשים כרצפי סיגנל להטמעה בממברנה דומים עד מאד לרצף הסיגנל האמיני (שגם הוא הידרופובי) שמשמש בטרנסלוקציה ללומן , ועל כן ה machinery היא אותה machinery.
אולם , **הרצפים ההידרופוביים הנ״ל נמצאים במרכז הפפטיד , ולא בקצוות!!**
כפי שכבר אמרנו , חלבון שמיועד לממברנה של ה ER (שממנה גם יתכן שהוא יגיע ליעדים אחרים) חייב להכיל רצף ״סיגנל״ הידרופובי , α הליקלי אחד לפחות. נקח כעת את הדוגמה הכי פשוטה , שבה אכן הפפטיד מכיל רצף הידרופובי אחד:
בזמן הסנתזה של חלבון ה cargo בציטוזול , ה SRP מזהה את הרצף הזה ברגע שהוא מתורגם ויוצא מהריבוזום , נקשר אליו , ומביא אותו ואת הריבוזום לטרנסלוקטור sec61 על גבי ממברנת ה ER. כעת הרצף ההידרופובי , שמשמש כרצף סיגנל , נדחף לשער הלטרלי , בדומה לרצף הסיגנל האמיני שמכוון ללומן , והטרנסלוקציה מתחילה
**פיגר 12-26**: **הכיווניות** שבה המקטע הטרנסממברנלי של ה cargo נכנס לשער הלטרלי , תקבע איך שאר החלבון יכנס. בניגוד לטרנספורט ללומן, שה SRP קושר את הפפטיד המתורגם מיד , איך שהקצה האמיני יוצא מהריבוזום , הרצפים ההידרופוביים שמכוונים לממברנה נמצאים באמצע , אי לכך הקצה האמיני מתורגם בטרם ה SRP הספיק להביא את הריבוזום לטרנסלוקטור על הממברנה:
- אם הקצה האמיני של הפפטיד (שנמצא לפני הרצף ההידרופובי) הוא קצר ולא מקופל (בגלל שפרונים למשל) , האוריינטציה בה שאר החלבון יעבור טרנסלוקציה תקבע לפי **המטען של חומצות האמינו בסמוך לרצף ההידרופובי + אורך המקטע הטרנסממברנלי.**
- אם הקצה האמיני של הפפטיד **ארוך ומקופל** , כך שהוא לא יכול לעבור בתעלה המרכזית של sec61 , הוא ישאר בציטוזול , הפפטיד יהיה קשור לטרנסלוקטור בשער הלטרלי דרך הרצף ההידרופובי , ומי שיכנס ראשון ללומן יהיה הקצה ה C-טרמינלי שמתורגם תוך כדי הטרנסלוקציה ולכן בהכרח יהיה פתוח וישר.
77
פיגר 12-26
הטמעת חלבונים טרנסממברנליים בממברנת ה ER:
נדון במקרה הכי קל: single-pass
כאמור חלבונים טרנסממברנליים בממברנת ה ER , גולג’י , אנדוזום , ליזוזום ווזיקולות טרנספורט חייבים להכיל סגמנט הידרופובי אלפא הליקלי אחד לפחות , סגמנט זה הוא הוא שהולך להיות הדומיין הטרנסממברנלי , וכן משמש כרצף סיגנל עבור הבאת חלבונים לממברנת ה ER. הרצף מזוהה ע״י SRP בציטוזול , וזה מכוון את הריבוזום עם הפפטיד לטרנסלוקטור הממברנלי sec61.
איזה צד של הפפטיד יהיה בלומן ואיזה צד יהיה בציטוזול נקבע לפי מספר פקטורים:
1) אם הקצה האמיני שנמצא לפני הרצף ההידרופובי הוא ארוך ומקופל , **וחומצות האמינו שמאגפות את הרצף הטרנסממברנלי מהצד האמיני שלו הינן חיוביות נטו** הקצה ה N-טרמינלי של הפפטיד ישאר בציטוזול , והקצה ה C- טרמינלי יכנס ללומן.
2) אם הקצה ה N-טרמינלי של הפפטיד הינו קצר ולא מקופל , והרצף הטרנס ממברנלי מאוגף מהצד האמיני שלו בחומצות אמינו נטו שליליות , הקצה ה N-טרמינלי יכנס ללומן , והקצה ה C-טרמינלי ישאר בציטוזול.
78
פיגר 12-27
מה קורה כאשר לחלבון טרנסממברנלי ב ER יש קצה N גדול , אך זהו הקצה שצריך להיכנס ללומן?
מקודם אמרנו , שבחלבוני single pass , רצף הסיגנל להטמעה בממברנה אינו נמצא בקצה ה N טרמינלי , אלא שהוא אנטראלי , כמו כן הוא הידרופובי ואלפא הליקלי. אם לחלבון ה single pass הזה יש קצה אמיני ארוך ומקופל שלא יכול לעבור בתעלת הטרנסלוקציה של sec61 אז בהכרח הקצה הזה ישאר בצד הציטוזולי של ממברנת ה ER , והקצה הקרבוקסילי הוא זה שיכנס ללומן. אך לעיתים , יש חלבוני single pass שמכילים קצה אמיני ארוך וגדול ודווקא הוא זה שצריך להיות בצד הלומינלי , אז כיצד נפטרת הבעיה ?
במצב כזה החלבון יכיל שני רצפי סיגנל , רצף הידרופובי בקצה ה N טרמינלי ורצף נוסף אינטרלי. הכל מתרחש כרגיל ודורש SRP , רצפטור ממברנלי ל SRP וכן טרנסלוקטור sec61. הרצף בקצה האמיני ישמש תחילה לכניסת החלבון אל הטרנסלוקטור , הוא ידחף לטרלית אל הממברנה , יזיז את הplug וכך תתאפשר התארכות וטרנסלוקציה של השרשרת הפפטידית דרך הטרנסלוקטור , עד שמגיעים לרצף הסיגנל השני , האנטרלי!! פה signal peptidase חותך את רצף הסיגנל האמיני , וכך הקצה ה N טרמינלי של החלבון משתלשל פנימה ללומן , והרצף האנטרלי משמש להטמעת החלבון בממברנה.
79
חלבונים טרנס ממברנליים מסוג multipass:
בחלבונים כאלה , השרשרת הפוליפפטידית חוצה את הממברנה הלוך ושוב מספר פעמים דרך דומיינים הידרופוביים , α הליקליים.
החלק ההידרופובי הראשון נכנס כאילו מדובר בחלבון single pass. הכל מתחיל בציטוזול כאשר ריבוזום מתרגם mRNA , ברגע **שבמרכז** הפפטיד מופיע רצף הידרופובי , הוא ישמש כסוג של רצף סיגנל בכך שיקשר אליו SRP ויביא אותו ואת הריבוזום לטרנסלוקטור על ממברנת ה ER. הרצף הטרנס ממברנלי יקשר לשער הלטרלי , והאוריינטציה הראשונית שבה ייקבע איזה טרמינל של החלבון יהיה בציטוזול ואיזה בלומן תקבע לפי תכונות הקצה ה N-טרמינלי , וחומצות האמינו שמאגפות את הרצף ההידרופובי.
מה שכן , האוריינטציה של הסגמנט הטראנס ממברנלי הראשון תקבע עבור שאר הסגמנטים איזה אוריינטציה תהיה להם. כעיקרון , האטריינטציה של כל סגמנט משפיעה על אופן הטרנסלוקציה של הסגמנט שבא אחרי , ולכן ברגע שהסגמנט הראשון התקבע , הוא משפיע על זה שבא אחריו , שמשפיע על זה שבא אחריו וכן הלאה.
הודות לקרבה הפיזית בין הריבוזום ל sec61 , ברגע שסגמנט הידרופובי מתורגם , איך שהוא רק יוצא מהריבוזום , הוא ישר מוצא את עצמו ליד השער הלטרלי. במקרים הפשוטים , **כל סגמנט הידרופובי חדש שנוצר נקשר לשער הלטרלי באוריינטציה הופכית לסגמנט שקדם לו** (פיגר 12-28).
במקרים מעט יותר מורכבים , הסגמנטים הטרנס ממברנליים של חלבון multi pass הם הידרופובים חלשים , או הידרופוביים באופן חלקי (מכילים גם ח״א הידרופיליות). במקרים כאלה , כל סגמנט בפני עצמו אינו מצליח לייצר אינטראקציות יציבות מספיק עם הממברנה , ועל כן הוא צריך לקשור את הסגמנט שקדם לו , זה שנמצא כעת בשער הלטרלי כדי שההטמעה בממברנה תהיה יציבה מספיק. הקישור בין שני הסגמנטים מייצב אותם , וביחד הם נכנסים לליבה השומנית של הממברנה , ומשתכנים בה , חרף נוכחות אלמנטים הידרופיליים. בצורה כזאת שבה סגמנטים הידרופוביים למחצה מייצבים אחד את השני בתוך הממברנה , **חלבוני multi pass מסוגלים ליצור אזורים הידרופיליים שחוצים את הממברנה** , דבר שהוא קריטי בעבור טרנספורטרים מסויימים כגון תעלות יונים.
בין המקטעים הטרנסממברנליים בחלבוני multi pass יש מין הסתם מקטעים הידרופיליים , אלה מסונתזים בשני אופנים:
- או שהם מסונתזים לציטוזול , ורק החלקים ההידרופוביים נכנסים לטרנסלוקטור ומוטמעים בממברנה דרך השער הלטרלי.
- מוכנסים גם כן לטרנסלוקטור
ניתן לנסות לדמיין זאת בפיגר 12-28. מה שקובע איזהבאיזה אופן יסונתזו המקטעים ההידרופיליים זה האוריינטציה של הסגמנט ההידרופובי שקדם להם.
בכל אופן , **המקטעים ההדרופוביים שחוצים את הממברנה , מוטמעים בה בכיווניות הפוכה אחד לשני , תמיד**
**בגלל שחלבוני ממברנת ה ER תמיד מוטמעים בה מהצד הציטוזולי** (בניגוד לממברנה הפנימית במיטוכונדריה למשל שחל מהחלבונים מוטמעים בה דרך קומפלקס OXA מהצד של המטריקס) , כל העותקים של שרשרת פוליפפטידית נתונה יהיו בעלי אותה אוריינטציה בממברנה , הדבר מייצר אבימטריה בממברנת ה ER כך שמצד אחד שלה יבלטו אך ורק קצוות N-טרמינליים , ומהצד השני יבלטו אך ורך קצוות C-טרמינליים.
האוריינטציה של החלבון בממברנת ה ER תישמר גם כאשר הוא עובר לממברנה של אברון אחר דרך וזיקולה.
80
פיגר 12-28
החדרת חלבון multi pass לממברנה של ה ER
רואים בפיגר כיצד יש שתי אופציות לסנתזת המקטעים ההידרופיליים שמפרידים בין המקטעים ההידרופוביים , או לציטוזול או לטרנסלוקטור.
רואים גם שצד אחד תמיד יהיה או אמיני או קרבוקסילי , והצד השני יהיה הפוך , בפיגר כל הקצוות האמיניים פונים לציטוזול , וכל הקרבוקסיליים ללומן.
81
חלק מהחלבונים הטרנסממברנליים ב ER מוחדרים במנגנון פוסט טרנסלטורי.
לדוגמה חלבוני SNARE
במנגנון זה השחקנים שונים מהשחקנים במסלול הקו טרנסלטורי. החלבון מתורגם במלואו תחילה ולכן אין ריבוזום , SRP וכו׳.
מנגנון זה נפוץ בחלבונים ממברנליים רבים **שפונים לצד הציטוזולי** של הממברנה. חלבונים אלה יהיו מעוגנים בממברנה באמצעות **מקטע טרנסממברנלי , α הליקלי יחיד , שנמצא קרוב לקצה הקרבוקסילי** (פיגר 12-29).
חלבונים אלה נקראים ״חלבונים מעוגני זנב״ , דוגמה לכך היא חלבוני ה **SNARE** שמשתתפים בעיגון ואיחוי בין ממברנות.
במקרים כאלה , רצף הסיגנל הוא סגמנט α הליקלי , שעתיד להיות מעוגן בממברנה. הרצף נמצא בקצה הקרבוקסילי של הפפטיד כאמור , זאת אומרת הוא האחרון לעבור תרגום , ואכן , כשחלבון מעוגן זנב מתורגם בריבוזום חופשי, קודון הטרמנציה מתורגם וגורם לעצירת התרגום ,**בעוד המקטע הטרנסממברנלי עדיין נמצא בתוך הריבוזום** , אי לכך , מנגנון טרנספורט דרך SRP אינו אפשרי , כי ״רצף הסיגנל״ אינו נגיש , ועל כן הפפטיד **נפלט לציטוזול**.
פה נכנס לתמונה שפרון ציטוזולי נוסף שנקשר לפפטיד ומעביר אותו ל targeting factor שנקרא GET3. פקטור זה , למרות שאינו קשור ל SRP הוא חולק איתו תכונה משותפת , בזה שגם לו יש pocket הידרופובי שעשיר **במתיונין** , דרכו הוא יכול לזהות ולקשור רצפים הידרופוביים רבים. GET3 נקשר לפפטיד ומביא אותו לממברנת ה ER , שם מחכה להם קומפלקס GET1/GET2 , שמתפקד גם כרצפטור ל GET3 וגם כטרנסלוקטור **שמעגן את הקצה הקרבוקסילי של הפפטיד לממברה**.
מלבד ה ER , יש חלבונים מעוגני זנב שמיובאים למיטוכונדריה ולפרוקסיזום , אך במנגנון לא ידוע.
82
פיגר 12-29
מנגנון עיגון של חלבונים מעוגני זנב
1) הפפטיד מתורגם במלואו בציטוזול
2) הקצה הקרבוקסילי , טרנסממברנלי , הידרופובי , α הליקלי מזוהה ע״י שפרון מסיס , בפיגר נקרא pre targeting complex.
3) השפרון מוסר את הפפטיד ל GET3 שהוא ה targeting factor.
4) הקומפלקס פפטיד-GET3 מגיעים לממברנת ה ER , שם יש את הרצפטור/טרנסלוקטור GET2/GET1
5) הקצה הקרבוקסיחי של הפפטיד מעוגן בממברנה , והפקטור GET3 ממוחזר לציטוזול.
מספר נקודות:
- אני רואה ש GET3 הוא **הומודימר** והוא ATPase
- אני אואה שבציטוזול שתי תת היחידות של GET3 נפרדות זו מזו ומתחברות רק כשהן נקשרות ל cargo
- גם GET3 וגם SRP משתמשים באנרגיה של נוקליאוזיד טרי-פוספט לשם ביצוע טרנספורט כיווני. SRP מבקע גטפ (ועל כן GTPase) , GET3 מבקע אטפ.
83
חלק מחלבוני הממברנה **מעוגנים** אליה דרך GPI:
GPI = glycosyl-phosphatidyl-inositol
הדרך הראשונה שבה ראינו עיגון חלבונים לממברנה הוא המנגנון של GET3 , שלפיו חלבוני SNARE למשל מתעגנים בממברנה. מנגנון נוסף לעיגון חלבונים לממברנה הוא דרך עוגן של GPI.
מנגנון זה משמש לעיגון חלבונים **דרך הקצה הקרבוקסילי שלהם לממברנת הפלסמה** , העוגן , ה GPI , נקשר אם כן באופן **קוולנטי** , לקצה **הקרבוקסילי של הפפטיד**.
הפפטיד מיוצר על גבי ריבוזום בציטוזול , ויש עליו שני רצפים חשובים. רצף אחד הוא **רצף סיגנל** , שנמצא **בקצה ה N-טרמינלי** שלו , ומשמש לייבוא הפפטיד ל ER דרך SRP. רצף נוסף , אינו רצף סיגנל , הוא הידרופובי ונמצא סמוך לקצה הקרבוקסילי.
הריבוזום נקשר לטרנסלוקטור , והפפטיד מתורגם תוך כדי , **במנגנון דומה לחלבוני single pass**. הוא אינו נכנס במלואו ללומן , אלא נשאר מעוגן למנברנה דרך הקצה הקרבוקסילי שלו.
בממברנה ישנו אנזים שנקרא **טראנסאמידאז** transamidase שמבקע את הסגמנט הקרבוקסילי הידרופובי שיושב בממברנה , ומנתק אותו מהפפטיד , ובמקביל מחבר במקומו עוגן GPI. **לציין , העוגן מוכן מבעוד מועד והטראנסאמידאז רק מחבר אותו** (פיגר 12-30).
לשים לב , הקצה האמיני של החלבון משתלשל אל תוך הלומן , ז״א , ברגע שהחלבון מגיע לממברנה הציטופלסמטית , הקצה האמיני הזה יפנה אל מחוץ לתא!! ואכן חלבונים רבים שמופרשים מהתא , הם חלבונים מעוגני GPI. חלבונים אלו הם **מסיסים** , והם מופרשים החוצה מהתא בתגובה לסיגנל כלשהו. הסיגנל מפעיל **פוספוליפאז** שנמצא בממברנה , שחותך את הפפטיד ומשחרר אותו.
מנגנון זה משמש פרזיט בשם trypanosome , ששל מעליו את מעטפת החלבונים מעוגני ה GPI כאשר מותקף ע״י מערכת החיסון.
חלק מהחלבונים מעוגני GPI הם בעלי תפקיד בהכוונה אל lipid rafts בממברנה , כך שהחלבונים שמכילים אותם יהיו חחק מה raft.
84
פיגר 12-30
מנגנון הכנסת חלבונים מעוגני GPI לממברנת ה ER הינו זהה למנגנון הטמעת חלבוני single pass שהקצה האמיני שלהם נכנס ללומן (פיגר 12-27). החלבון תחילה נכנס לטרנסלוקטור דרך רצף סיגנל בקצה האמיני , שנקשר לממברנה עד להגעת הרצף האנטרלי (שבמקרה של עוגן GPI הוא אינו אינטרלי אלא בקצה ה C טרמינלי). ברגע שהרצף השני נכנס לטרנסלוקטור , רצף הסיגנל האמיני נחתכת , והקצה האמיני משתלשל אל תוך הלומן , והקצה הקרבוקסילי מוטמע בממברנה.
כעת הפפטיד מעוגן לממברנת ה ER דרך רצף סיגנל הידרופובי של בין 15-20 חומצות אמינו שנמצא בקצה הקרבוקסילי שלו , כאשר שאר החלבון מתדלדל אל תוך הלומן.
**תוך פחות מדקה** מסיום התרגום , מגיע האנזים transamidase ובמקביל , מנתק את הפפטיד מהקצה הקרבוקסילי שנמצא בממברנה , ומחבר אותו לעוגן ה GPI דרך קבוצת אמין NH2 בקשר **אמידי**.
מבנה עוגן ה GPI:
- שני זנבות שומניים שיושבים הממברנה
- אליהם בלומן מחוברת קבוצת פוספט
- לפוספט מחובר הפטאסכריד שבנוי מ 5 מונוסכרידים: אנוזיטול (חלק מהשם) + גלוקוזאמין + 3 מנוזות
- למנוז האחרון מחובר **פוספואתנול אמין** שזה קבוצת זרחן + ה NH2 שיוצר את הקשר האמידי.
**עוגן: שני זרחנים , שני פחמימנים ו- 5 סוכרים ואמין.**
כאשר הפפטיד מתחבר לעוגן ה GPI הוא מתחבר לפוספט (השני) , והאמין נותר עם הסגמנט הקרבוקסילי שנותר בממברנה , ראה פיגר.
מודיפיקציה זו מתרחשת הודות לסיגנל מסויים שהוא בעצם **רצף חומצות האמינו שבקצה הקרבוקסילי** , לצד מספר קטן של חומצות אמינו נוספות במקטע העוקב שנמצא בלומן. אם נחבר את הרצף הזה לכל חלבון אחר , הוא יעבור מודיפיקציה דומה.
הודות לעוגן הקוולנטי של ה GPI , החלבון נחשב membrane bound , כל חלבון שנמצא בלומן של ה ER , כשיגיע לממברנת התא הוא יהיה מחוץ לתא (כלומר חלבונים מעוגני GPI ממצאים בעלעל החיצוני של הממברנה).
85
חלבונים מתקפלים בלומן של ה ER ועוברים בו אסימבלי:
חלבונים כידוע לנו נכנסים ללומן של ה ER כשהם פתוחים ולא מקופלים. ועל כן , הם צריכים להתקפל בלומן , כפי שחלבונים ציטוזוליים מתקפלים בציטוזול.
הלומן של ה ER מכיל ריכוז גבוה של שפרונים , ועוד חלבונים נלווים. חלבונים אלה נחשבים כרזידנטים של ה ER.
ER resident proteins
כדי שחלבונים יהיו רזדנטים ב ER , הם צריכים להכיל סיגנל מיוחד שנקרא ER retention signal. רצף זה הוא למעשה **רצף קצר , של 4 חומצות אמינו , בקצה הקרבוקסילי של החלבון**.
השפרון BIP הוא רזידנט בלומן של ה ER , והוא שייך למשפחת שפרוני ה hsp70. הוא בעל תפקיד חשוב מאד בקיפול חלבונים ב ER , בנוסף לתפקידו במשיכת פפטידים אל הלומן דרך הטרנסלוקטור sec61 בנסלולי טרנסלוקציה **פוסט טרנסלטורית**. בדומה לשפרונים אחרים , BIP יודע לזהות חלבונים **לא מקופלים ולהיקשר אליהם באפיניות גבוהה** , וכן יודע לזהות תת יחידות חלבוניות של אוליגומרים שטרם עברו אסימבלי ולהיקשר אליהם. העיקרון שמנחה את BIP להיקשר לחלבונים ולתת יחידות האלה הוא פשוט: ללמנוע מהם לצאת מה ER + למנוע מהם ליצר אגרגטים.
כיצד bip יודע היכן להיקשר על החלבון הלא מקופל / תת יחידה ?
הוא מזהה רצפים הידרופוביים במבנה שלהם , רצפים אלה יוטמנו בליבת החלבון כאשר הוא מתקפל נכונה הרחק מהתווך המימי , ולכן זה שהם חשופים , מהווה סימן עבור bip שהחלבון לא התקפל כמו שצריך.
ביפ bip הוא ATPase , דרך מחזורים של קישור וביקוע אטפ הוא עובר ממצב של אפיניות גבוהה לקשור שרשראות פלטידיות ישרות למצב של אפיניות נמוכה , כך הוא נקשר לפפטיד ושומר עליו פתוח , אך לאחר מכן מתנתק ממנו כדי לתת לו הזדמנות להתקפל נכון , אם החלבון התקפל נכון , bip לא יקשר אליו שוב , אם הוא לא התקפל נכון , bip יקשר אליו שוב ואז יתנתק , וחוזר חליליה , עד שהחלבון מתקפל או התת יחידה מצטרפת לחברותיה ליצירת האוליגומר.
86
דוגמה נוספת לקיפול חלבונים בלומן של ה ER מלבד bip:
מנגנון קיפול נוסף בלומן של ה ER מתבצע ע״י רזידנט לומינלי שנקרא PDI , או בשמו המלא **protein disulfide isomerase** , מה שהוא יודע לעשות זה **לחמצן ולחזר** קשרים דיסולפידיים.
כאשר PDI נתקל בקבוצות סולפהידריל SH על גבי שני צסטאינים סמוכים בפפטיד נתון , הוא יודע לחמצן אותם וליצור גדרים דיסולפידיים בתוך הפפטיד (פיגר 12-31) , כך הוא מסייע לחלבון לא מקופל בלומן של ה ER להתקפל למבנה השלישוני שלו.
מנגד , אם BPI נתקל בגשר דיסולפידי SS שנוצר בצורה לא נכונה בתוך פפטיד הוא יודע לחזר ולפתוח אותו , ואז שוב לסגור אותו בצורה נכונה.
כמעט כל הצסטאינים שנמצאים על גבי חלבונים שחשופים לתווך החוץ תאי ECM , או שנמצאים בלומן של אברונים המשתתפים המסלול האקסוציטוזה/אנדוציטוזה יהיו במצב מחומצן , כלומר בצורת SS. ההיגיון הוא כזה , הסביבה החוץ תאית היא קשוחה ואינה מכילה שפרונים , גשרים גיסולפידים במבנה החלבון אי לכך מייצבים את מבנה החלבון ומסייעים לו להתמודד עם התנאים הקשים.
הלומן של ה ER מכיל מספר חברים במשפחת ה PDI , חלקם יודעים לפתוח חלבונים באופן חלקי , וחלקם יודעים לפתוח חלבונים באופן מלא במידה **וצריך להחזיר את החלבון לציטוזול או לשלוח אותו לדגרדציה**.
יצירת קשרים דיסולפידיים צריכה סביבה מחמצנת , ואכן הסביבה בלומן של ה ER ומחוץ לתא הינה כזאת , בציטוזול מנגד , הסביבה היא מחזרת (מכילה המון H) ולכן גדרים דיבולפידיים כמעט ולא נוצרים בציטוזול
87
פיגר 12-31:
מנגנון פעולה של PDI
יצירת גשרים דיסולפידיים הינה חיונית לקיפול החלבון וייצוב מבנהו המרחבי. חלבון שנמצא בלומן של ה ER עם שתי קבוצות סולפהידריל SH פוגש את PDI. במבנה של PDI עצמו יש אתר שמכיל קשר דיסולפידי אנטראמולקולרי שיודע לקלוט אלקטרונים מקבוצות ה SH שעל הסובסטרט , ולגרום להם להתחבר יחדיו לכדי גשר דיסולפידי.
88
מרבית החלבונים המסונתזים ב RER יעברו מודיפיקציה מסוג N-גליקוזילציה:
בעצם , אחרי שהחלבון נוצר , הוא מקבל שייר **אוליגוסכרידי** שנקשר אליו בקשר קוולנטי N-גליקוזידי.
פעולה זו , היא מבין הדברים העיקריים שה ER עושה , כך **שמחצית** מהחלבונים שמעובדים ב ER , **בין אם הם קשורים לממברנה ובין אם מסיסים בלומן** , יעברו מודיפיקציה N-גליקוזידית ויהפכו להיות גליקופרוטאינים. המודיפיקציה מתרחשת גם כשמדובר בחלבונים שמיועדים למדורים אחרים כגון גולג׳י , ליזוזום , ממברנת הפלסמה, או מחוץ לתא , ולא רק לחלבונים רזידנטים ב ER.
בנוסף , חלק קטן מהחלבונים בציטוזול והגרעין עוברים N-גליקוזילציה , רק שבמקרים אלו השייר אינו אוליגוסכרידי , אלא שמדובר בקבוצה בודדת של **N-אציטילגלוקאמין** שנקשרת אליהם על גבי **סרין , או תריאונין**.
פעולת הגליקוזילציה הכי שכיחה שמתרחשת על חלבונים ב RER היא של הוספת אוליגוסכריד שמורכב מ 14 חד-סוכרים (פיגר 12-32):
- שני N-אציטיל-גלוקוז-אמין
- 9 מנוזות
- 3 גלוקוז
השייר מיוצר תחילה במלואו בממברנת ה ER על גבי ליפיד ממברנלי שנקרא **דוליכול** , ואז מועבר **כיחידה אחת** ,לחלבון שעובר את המודיפיקציה. האליגוסכריד מתחבר לקבוצת NH2 בשייר הצד של **אספרגין** Asn בחלבון , ולכן הקשר הוא N-גליקוזידי.
העברת האוליגוסכריד מהדוליכול לחלבון המטרה מתרחשת **בריאקציה אנזימטית בודדת** ע״י האנזים **אוליגוסכריל טרנספראז**. זהו אנזים **טרנס ממברנלי , שקשור לטרנסלוקטור sec61 , ושהאתר הפעיל שלו פונה לצד הלומינלי**. ברגע שחלבון ה cargo נכנס דרך הטרנסלוקטור , אוליגוסכריל טרנספרז מזהה את האספרג׳ין הרלוונטי שעל גביו ומעביר אליה את האוליגוסכריד **תוך כדי הטרנסלוקציה** , הכל קורה כאמור בצד הלומינלי של הממברנה.
השייר האוליגוסכרידי נבנה סוכר אחר סוכר , תחילה בצד הציטוזולי של הממברנה , ולאחר מכן בצד הלומן. בציטוזול **סוכרים משופעלים** נמסרים **תחילה** לדוליכול ע״י נוקליאוטידים מסוג UDP או GDP (עצם החיבור של הסוכרים לנוקליאוטידים משפעל אותם) ולאט לאט מתחיל להיבנות ״עץ״ סוכרי , באמצע הדרך , כשעל הדוליכול יש 7 סוכרים , הוא משנה צד לעלעל הלומינלי של הממברנה ע״י טרנספורטר , והמשך האסימבלי מתרחש בצד בזה.
גליקוזילציית N מהווה כ 90% מהגליקוזילציות שיש על חלבונים (גליקופרוטאינים) , שאר ה 10% הם מסוג O-גליקוזילציה. בגליקוזילציה מסוג O , שייר גליקוזידי מתחבר לקבוצת ה OH שעל שיירי הצד של סרין , תריאונין , הידרוקסיליזין , והידרוקסיפרולין. בגליקוזילציית O הסוכר הראשון מתווסף ב ER עצמו. שני סוגי הגליקופרוטאינים , ה N-glycosylated וה O-glycosylated יצאו בהמשך מה ER לגולג׳י , שם יעברו עיבוד נוסף לסוכרים , מה שמסביר את הרב כוניות בגליקופרוטאינים.
האנזים glycosyl transferase הוא שם כולל למשפחת אנזימים שמעבירים שיירים סוכריים לחלבונים , אוליגוסכריל טרנספרז הם חברים במשפחה הזאת.
89
פיגר 12-32
גליקוזילציית N ב ER
איך ששרשרת פוליפפטידית עוברת דרך הטרנסלוקטור sec61 אל תוך הלומן ב ER , **באופן כמעט מיידי** היא עוברת גליקוזילציה.
הגליקוזילציה מתרחשת על גבי חומצת הטמינו אספרג׳ין , שהיא חלק מהרצפים:
• Asn-X-Ser
• Asn-X-Thr
**לציין ששני הרצפים האלה , חרף חשיבותם במודיפיקציה שמתרחשת ב ER , הם יותר שכיחים בחלבונים ציטוזוליים שלא עוברים גליקוזילציה , מאשר גליקופרוטאינים**. כמו כן , **X יכול להיות כל חומצת אמינו מלבד פרולין**.
לאוליגוסכריד ישנם 5 סוכרים שמהווים את הליבה שלו , בהגיע הגליקופרוטאין מה ER לגולג׳י , במרבית המקרים כל שאר הסוכרים בשייר מורגים ורק ה 5 הללו נשארים.
אוליגוסכריל טרנספראז , האנזים שמשתתף בריאציה הגליקוזילציה הינו חלבון טרנס ממברנלי שיושב בממברנת ה ER ומחובר ל sec61. האנזים חוצה את הממברנה 13 פעמים דרך 13 דומיינים α הליקליים.
האתר הפעיל שלו פונה ללומן ,ברגע שהוא מזהה את האספרג׳ין שברצפים למעלה , הוא ישר מעביר לה את השייר הסוכרי ממולקולת דוליכול שנמצאת בעלעל הפנימי של הממברנה.
היחס הסטוכיומטרי בין האנזים לטרנסלוקטור בממברנת ה ER הוא 1:1 , האתר הפעיל של האנזים יודע גם לקשור את השרשרת הפפטידית בעודה יוצאת מהטרנסלוקטור , וגם את הדוליכול עם הסוכר.
האספרגין נקשרת על האנזים בתוך תעלה פנימית , בתוך התעלה , קבוצת האמין של האספרג׳ין , שעליה יווצר הקשר ה N-גליקוזידי , עוברת טוויסט כלפי חוץ , וכך היא **משופעלת** (היא קשורה לחומצה בקשר אמידי שאינו ריאקטיבי במיוחד) , ובכך נקשרת אליה השרשרת האוליגוסכרידית.
90
פיגר 12-33
שלבי יצירת האוליגוסכריד:
דוליכול הוא נשא ליפידי גדול מימדים , הוא מאד מאד הידרופובי , היחידה המבנית הבסיסית שלו מורכבת מ 5 פחמנים שחוזרים על עצמם 22 פעם , הוא כל כל כדול שהוא חוצה את הממברנה יותר משלש פעמים , מה שמבטיח שהאוליגוסכרית שנבנה עליו יהיה מוחזק חזק על גבי הממברנה.
תחילה נקשר לדוליכול זרחן מ CTP בציטוזול , אל הזרחן הזה מצטרפים בשלב השני זרחן נוסף ושני GlcNac , שמקורם משתי מולקולות UDP , אחת מוסרת גם זרחן וגם סוכר , והשניה רק סוכר.
שני ה GlcNac’s האלה קשורים ל UDP , הקשר הזה משפעל אותם ומאפשר את החיבור שלהם לדוליכול.
הקשר בין ה GlcNac הראשון , לשני הזרחנים (הפירופוספט) הוא עתיר אנרגיה ומספק את הכח המניע הנדרש בהמשך להעברת האוליגוסכריד מהדוליכול לאספרג׳ין על פפטיד המטרה.
בשלב השלישי מגיעים 5 מולקולות GDP , שעל כל אחת קשור מנוז (משופעל) , והמנוז מועבר לדוליכול ואז לשרשרת ההולכת ומתארכת. בנקודה הזאת שעל הדוליכול יש 7 סוכרים (2 גלקנקים ו 5 מנוזות) הוא עושה flip דרך טרנספורטר ונכנס לעלעל הלומינלי בממברנת ה ER.
הארכת האוליגוסכריד עכשיו נמשכת בצד של הלומן , תחילה מתווספים לשרשרת 4 מנוזות נוספות , ולבסוף 3 גלוקוז.
4 המנוזות ו 3 הגלוקוז נתרמים לשרשרת ממבנה של dolichole-P- glucose וממבנה של dolichole-P-mannose , העצם מדובר במולקולות **דוליכול-פוספט** שנמצאות בצד הציטוזולי של הממברנה , פה מגיעים אליהם GDP-mannose ו- UDP-Glucose ותורמים להם את הסוכרים המשופעלים שלהם , במצב הזה הדוליכולים עם הזרחן והסוכר עושים flip לעלעל הפנימי , שם הם תורמים את המנוזות ואת הגלוקוז לשרשרת האוליגוסכריד המתארכת.
91
אוליגוסכרידים מסמנים חלבונים לא מקופלים בתוך ה ER:
לפי תצפיות שערכו , מצאו כי לעיתים מיקום חומצת האמינו שעליה נקשר האוליגוסכריד בפפטיד אינו משנה , העיקר שעל החלבון יהיה תג N-גליקוזידי , וזה כבר יבטיח שהקיפול שלו ב ER יתבצע כמו שצריך.
פה נדון בשני שפרונים שנמצאים ב ER , ונחוצים לקיפול נכון של חלבונים: calnexin ו- calreticulin. אלו הם שני לקטינים (חלבונים קושרי סוכר) , **והם קיבלו את השמות שלהם משום שהם דורשים סידן לשם פעולתם** שני השפרונים האלה עושים מספר פעולות בתא:
- נקשרים לשרשראות אוליגוסכרידיות (לקטינים) על גבי חלבונים לא מקופלים , ובכך שומרים אותם בלומן של ה ER ומונעים מהם להתקדם לגולג׳י
- מונעים מחלבונים לא מקופלים לייצר אגרגטים בלתי הפיכים בחומן של ה ER
- מקשרים בין החלבונים הלא מקופלים לשפרונים נוספים שמזהים קבוצות סולפהדריל SH (סימן שהחלבון לא מקופל כמו שצריך)
קלנקסין (שפרון ממברנלי) וקלריתיקולין (מסיס בלומן) יודעים לזהות חלבונים לא מקופלים לפי השייר האוליגוסכרידי שלהם. כאמור האנזים אוליגוסכריל טרנספרז מחבר את השרשרת האוליגוסכרידית לאספרגין על חלבונים חדשים שנוצרו. מהסתכלות על מבנה השייר האוליגוסכרידי אנו רואים שבקצה שלו יש 3 גלוקוזים שמתווספים אחרונים. זמן קצר לאחר הוספת השייר ע״י האוליגוסכריל טרנספרז , מגיע אנזים אחר , **גלוקוזידאז** וחותך שניים מהגלוקוזים האלה ומשאיר רק אחד (פיגר 12-33). הגלוקוז הבודד הזה מזוהה על ידי קלנקסין וקלריתיקולין ומסמל בעבורם שיש פה חלבון חדש שסונתז לאחרונה (ועל כן סיכוי טוב שהוא לא מקופל נכון) , ושיש לשמור אותו ב ER לצורך קיפול.
לאחר זמן , הגלוקוז הטרמינלי הזה גם הוא נחתך , ומותיר את הגליקופרוטאין עם שרשרת אוליגוסכרידית חסרה גלוקוזים. אם הגליקופרוטאין הספיק בזמן הזה להתקפל כמו שצריך , הוא משונע מה ER ליעדו הסופי , אם הוא לא מקופל , הוא מקבל הזדמנות נוספת. מגיע אנזים **גלוקוזיל טרנספרז** ומחבר אליו מונומר יחיד של גלוקוז - המונומר הזה מזוהה ע״י שני השפרונים , והגליקופרוטאין נלקח לעוד סיבוב של קיפול.
כך הגליקופרוטאין עובר מספר ניסיונות קיפול הודות לפעולה של גלוקוזידאז (שמוריד גלוקוז) וגלוקוזיל טרנספרז (שמחבר גלוקוז).
92
פיגר 12-34
תפקיד גליקוזילציית N בקיפול חלבונים ב ER
בשקף רואים את הריבוזום מתרגם את הפפטיד , שתוך כדי מושחל דרך הטרנסלוקטור sec61 , וכבר יש עליו שייר אוליגוסכרידי , למרות שלו רואים את האוליגוסכריל טרנספרז עצמו.
אמרנו שאם על השייר האוליגוסכרידי שעל הגליקופרוטאין יש גלוקוז טרמינלי בודד - זה סימן שהחלבון צריך עוד סבב של קיפול. מי שמוסיף את הגלוקוז הזה הוא האנזים גלוקוזיל טרנספרז , ומי שמוריד אותו הוא האנזים גלוקוזידאז.
גלוקוזיל טרנספרז מסמן את הגלוקופרוטאין בעזרת גלוקוז משופעל שמגיע מ UDP-glucose , מוכחות הגלוקוז מעלה את האפיניות של הגלוקופרוטאין לקלנקסין וקלרתיקולין.
שפרון נוסף , נקרא ERp57 פועל בשיתוף פעולה עם שני השפרונים האחרים , הוא יודע לזהות קבוצות סולפהידריל חופשיות SH , סימן לחלבונים לא מקופלים ב ER.
אם אחרי מספר ניסיונות קיפול הגליקופרוטאין לא מתקפל נכונה , גורלו נחרץ והוא נשלח לפירוק. בעצם בלומן של ה ER ישנו חלבון רזידנט שנקרא **מנוזידאז** mannosidase שיודע להוריד חלק מהמנוזות מהשייר האוליגוסכרידי , גליקופרוטאין עם שייר אוליגוסכרידי חסר מנוזות , הוא סימן לכך שהחלבון לא טוב ושיש להיפטר ממנו , הוא נקשר ללקטינים מסויימים ששולחים אותו לדגרדציה.
אסוציאציה: קלנקסין - קלונקס רגוע על החוף (ממברנה)
קלרתיקולין - רזידנט של הלומן.
93
חלבונים שלא התקפלו נכון , יוצאים מה ER ונשלחים לדגרדציה בציטוזול.
חלבונים שלא מצליחים להתקפל , או תת יחידות של אוליגומר שלא הצליחו לעבור אסימבלי , נשלחים חזרה לציטוזול שם הם מפורקים **בפרוטאוזום**.
תהליך הייצוא מה ER חזרה לציטוזול דומה בעיקרון לתהליך הייבוא הפוסט טרנסלטורי מהציטוזול ל ER. בשני המקרים שפרונים צריכים לקשור את הפפטיד כדי לשמור אותו מלהתקפל , בשני המקרים נדרשת השקעת אנרגיה כדי לבצע טרנספורט כיווני , ובשני המקרים נדרשת אנרגיה כדי למשוך את הפפטיד אל המקום אליו הוא צריך להגיע.
הלומן של ה ER צריך להבדיל בין חלבונים שלא מקופלים נכון ושיש לפרק אותם , לבין חלבונים שהם עדיין בתהליך קיפול ולכן צריך לשמור אותם. ההבדלה נעשית הודות לשייר האוליגוסכרידי שמלמד (את המערכת התאית) כמה זמן החלבון הבלתי מקופל נמצא כבר בלומן - חלבון שנמצא זמן ממושך , כבר לא יתקפל ולכן צריך להרוס אותו בפרוטאוזום.
בשייר האוליגוסכרידי כאמור יש 9 מנוזות, הורדה של אחד מהם ספיציפית (עי מנוזידאז) תגרום לאוליגוסכריד לקבל מבנה קצת שונה שמזוהה ע״י לקטינים לומינליים ב ER שהם חלק מהמערך של הרטרו-טרנסלוקציה שדולח לפירוק , ועל כן , חלבון שהספיק להתקפל ולצאת מה ER יחמוק בכך מהמנוזידאז , לא יזוהה ע״י הלקטינים , ולכן לא יעבור פירוק.
החלבונים שיוצאים לדגרדציה בפרוטאוזום יוצאים כשרשרת פתוחה , ופה חשיבותם של השפרונים ושל דיסולפיד איזומראזות , השפרונים מונעים יצירת אגרגטים , והדיסולפיד איזומיראזות פותחים גשרים דיסולפידיים לא רצויים.
ישנם רטרו-טרנסלוקטורים רבים שמוציאים את הפפטיד חזרה לציטוזול (הם גם יכולים להוציא חלבונים מהממברנה לציטוזול) , המשותף לכולם הוא שכולם מכילים אנזים E3 , שהוא יוביקוויטין ליגאז , שמחבר שרשרת פוליוביקוויטין לחלבון ומסמן אותו להשמדה. בציטוזול , ישנו חלבון הקסמרי שנקרא **AAA-ATPsse** , הוא מבקע אטפ ומושך את הפפטיד החוצה מה ER דרך הרטרו-טרנסלוקטור (מזכיר bip). משהפםטיד נמצא כולו בציטוזול , מגיע **N-glycanase** ומוריד בבת אחת את השייר האוליגוסכרידי (או מה שנשאר ממנו) , ולבסוף החלבון מגיע לפרוטאוזום.
94
פיגר 12-35
רטרו טרנסלוקציה של חלבונים לא מקופלים
חלבונים מסיסים בלומן של ER שמיועדים להשמדה נקשרים ללקטינים , שפרונים , ולדיסולפיד אזומראזות.
-השפרונים מונעים היווצרות אגרגטים
- הלקטינים מזהים חלבונים שנמצאים יותר מדי זמן בלומן
- הדיסופלפיד איזומראזות מחזרים קשרים דיסולפידיים
ללקטינים יש אתרי קישור על הטרנסלוקטור הממברנלי שבתוכו עש את ה E3 יוביקוויטין ליגאז. היוביקוויטין ליגאז מסמן את החלקים של הפפטיד שהגיעו לצד הציטוזולי בעודו יוצא מהטרנסלוקטור , שרשרת הפוליוביקויטין מונעת מהפפטיד להחליק חזרה ללומן , וגם מהווה מין ״ידית אחיזה״ עבור AAAATPase שמושך את הפפטיד לציטוזול.
חלבונים ממברנליים יוצאים באופן דומה , אך הם נכנסים לטרנסלוקטור מהצד , כלומר מהשער הלטרלי.
סוגים שונים של טרנסלוקטורים , מכילים סוגים שונים של E3 כדי להתאים לסוגי חלבונים שונים.
95
חלבונים שלא מקופלים נכון ב ER מפעילים תגובת UPR
Unfolded protein response
תאים חייבים לנטר את כמות החלבונים הלא מקופלים שהם מכילים כחלק ממערך הפרוטאוסטזיס , ולכן הצטברות של חלבונים לא מקופלים במדור כלשהו תגרור תגובה תאית בהתאם.
הצטברות חלבונים לא מקופלים בציטוזול תגרור תגובת heat shock , שתגרום להגברה בשעתוק שפרונים ציטוזוליים שמסייעים בקיפול החלבונים. הצטברות של חלבונים לא מקופלים ב ER תגרור תגובת UPR שגורמת להגברה בשעתוק של גנים שמקודדים למרכיבים רבים , הפועלים ב ER , ותורמים לקיפול חלבונים נכון כגון:
שפרוני ER , רטרוטרנסלוקטורים , **פקטורים להגדלת ה ER** ועוד.
אם כך, אנחנו מבינים שיש צימוד בין דטקציה של חלבונים לא מקופלים ב ER לבין רגולציה על שעתוק של גנים בגרעין , מה שאומר שחייבת להיות מידת מה של תקשורת בין שני האברונים. ואכן קיימים 3 מסלולים מקבילים שמוציאים לפועל את תגובת ה UPR (פיגר 12-36):
1) **מסלול IRE1:** שמור אבולוציונית בכל התאים היוקריוטים. במסלול זה הצטברות של חלבונים לא מקופלים בלומן ה ER משפעלת אנזים בשם IRE1 , שהוא **קינאז טרנס ממברנלי**. ברגע שהוא משופעל , האנזים עובר תגובת אוליגומריזציה ואוטו-פוספורילציה (כלומר מזרחן את עצמו והופך לאוליגומר). ל IRE1 יש דומיין ציטוזולי שהוא **אנדוריבונוקליאז** , בצורתו האולגומרית והמזורחנת הקינאז גורם לדומיין הציטוזולי הזה לחתוך מולקולת mRNA ספיציפית בשני אתרים ולהוציא ממנה אנטרון (פעולת splicing). אחרי שהאנטרון יוצא , ה mRNA מתחברת מחדש ע״י האנזים RNA ligase. בצורתה החדשה , ה mRNA מתורגמת לכדי פקטור שעתוק אקטיבי שנכנס לגרעין ומגביר ביטוי של חלבוני UPR. הייחודיות של המסלול היא שפעולת ה splicing מתרחשת בציטוזול , כשבד״כ splicing מתרחש בגרעין ע״י הספליצוזום.
2) **מסלול PERK**: הצטברות של חלבונים לא מקופלים ב ER גורמת להפעלה של עוד קינאז טרנסממברנלי , נקרא PERK. ברגע ש perk מופעל הוא מזרחן **פקטור אניציאציית תרגום** בציטוזול , וזה מביא לשני דברים:
- ירידה בתרגום ויצירה של חלבונים חדשים **בכל התא**. דרך כך , פחות חלבונים חדשים מגיעים ל ER , זאת אומרת שלאברון יש פחות חלבונים חדשים שצריך לקפל , וכך הוא מתפנה לקפל את מה שכבר יש לו.
- **יש חלבונים שמתורגמים ביתר שאת דווקא כשיש מעט פקטורי אניציאציית תרגום** בציטוזול. אחד מהחלבונים האלה הוא בקר שעתוק , שגורם להגברה בשעתוק גנים שמקודדים לחלבוני UPR.
3) **מסלול ATF6**: זהו למעשה בקר שעתוק שמתחיל את חייו כחלבון **טרנס ממברנלי** בממברנת ה ER. ברגע שמצטברים חלבונים לא מקופלים ב ER , הוא משונע לגולג׳י , בתוך הגולג׳י ישנו פרוטאז רזידנט שחותך את הדומיין הציטוזולי שלו , במצבו החדש הוא יכול להיכנס לגרעין ולגרום להגברת ביטוי חלבוני UPR.
המסלול הזה שעושה אקטיבציה של פקטור שעתוק רדום בממברנה דומה לרגולציה על ביוסנתזה של כולסטרול , גם במסלול האקטיבציה של סנתזת כולסטרול ישנו פקטור ממברנלי רדום שעובר שפעול.
בסוגי תאים שונים , משתנה החשיבות של כל אחד מהמסלולים הנ״ל בהתאם לסוג וצורכי התא.
בתאים רבים , במצבים פיזיולוגיים רגילים מסלולי הסיגנל של ה UPR יכולים להתקיים. אנסולין הוא הורמון שמופרש לדם מתאי β בלבלב. לאחר ארוחה , הצורך באנסולין עולה. הקיפול הסופי של אנסולין מתרחש ב ER , אי לכך אחרי ארוחה יש עליה חדה בכמות האנסולים שמגיע ל ER לצורך קיפול , עליה זו מפעילה מסלול PERK וגורמת לתאים לתרגם פחות אנסולין כדי שה ER יוכל לעמוד בקצב.
דוגמה נוספת היא בתאי B של מערכת החיסון , כאשר תאים אלה מתחילים להתמחות ולהפוך לתאי פלסמה מפרישי נוגדנים , מופעל בהם מסלול IRE1 , מה שגורם להגדלה והתרחבות ה ER כהכנה לכמויות הנוגדנים שעומדים להגיע אליו.
הפעלת שלשת המסלולים הנ״ל תגרום בסופו של דבר להגברה בייצור החלבונים שפועלים ב ER בקיפול חלבונים אחרים. כשהתא חוזר למצב הומיאוסטטי , הפעילות של IRE1 , PERK , ATF6 יורדת , במידה ולא , התא יפעיל , בעיקר דרך PERK , תגובת אפופטוזיס.
96
פיגר 12-36:
3 מסלולים להפעלת UPR
שחשת המסלולים הינם **מקבילים** (יכולים להתרחש במקביל אחד לשני ולא משפיעים אחד על השני).
למרות שהמנגנונים שונים , ל 3 המסלולים יש דברים משותפים:
- הם גורמים ליצירה של פקטורי שעתוק אקטיביים , שגורמים להגברת השעתוק של חלבוני UPR בגרעין
- כולם משופעלים ע״י **סנסור רזידנטי** ב ER שחש הצטברות של חלבונים לא מקופלים
- התוצר הסופי של כולם הואהגברת יכולת עיבוד החלבונים ב ER , והגברת יכולת דגרדציית החלבונים של התא
כשהחיישנים מופעלים הם מאתחלים
**downstrea** signaling pathway
97
פיגר 12-37
מסלול IRE1
הקומפלקס IRE1 הוא חלבון טרנסממברנלי אוליגומרי.
1) **בתנאים רגילים:** הדומיינים הלומינליים של IRE1 קשורים לשפרוני bip מה שמשאיר אותו במצב לא פעיל.
2) **עליה בכמות החלבונים הלא מקופלים בלומן**: גורם תחילה ל bip להתנתק , ולאחר מכן לחלבונים הלא מקופלים להיקשר במקומם.
קישור החלבונים הלא מקופלים -> גורר **אוליגומיריזציה** של IRE1
3) במצבו האוליגומרי , IRE1 מבצע על עצמו פעולת זרחון (אוטופוספורילציה) -> גורר הפעלת דומיין ציטוזולי של ריבונוקליאז.
4) הדומיין הציטוזולי עושה splicing למולקולת pre-mRNA בציטוזול , ה mRNA שנוצר מתורגם לפקטור שעתוק שנכנס לגרעין , הוא מפעיל **מספר** גנים לרבות של שפרונים.
5) עליה בשפרונים מעלה את יכולת קיפול החלבונים של ה ER , מה שגורם לירידה בכמותם בלומן ולכיבוי המסלול.
98
המצגת עוברת לפרק 6
ילמד מהמצגת ומהספר
99
הגולג׳י
פרק 13
תאים חשים את הסביבה החיצונית ומתאימים את עצמם לשינויים בה , בתוך כך הם נדרשים כל הזמן לחדש את סוגי הטרנספורטרים השונים שיש להם על הממברנה הציטופלסמטית.
דרך אקסוטציטוזה , וזיקולות שמכילות חלבונים מגיעות לממברנה , החלבונים עוברים בה אנקורפורציה , וכך הממברנה מקבלת סטים חדשים של טרנספורטרים , זהו גם מסלול שבו תאים יכולים להפריש חלבונים (אנסולין נוגדנים) לסביבה החיצונית שלהם.
באנדוציטוזה , חלבונים , נוטריינטים , ליפידים וכו׳ , נכנסים לתא , גם כן דרך וזיקולות. הוזיקולות האלה מגיעות לאנדוזום , פה מתרחש תהליך sorting שלפיו הדברים שנכנסו לתא משונעים ליעדים הסופיים שלהם: או שהם ממוחזרים לממברנה הציטופלסמטית , או שהם משונעים לליזוזום בו הם מפורקים לאבני הבניין שלהם ואז יוצאים ממנו לציטוזול , ומשתתפים במסלולים מטבוליים שונים. הליזוזם גם מפרק מרכיבים תוך תאיים במסלול האוטופאגיה.
הבפנים של כל האברונים שמשתתפים בתהליכי ה secretory and endocytic pathways הם אקוויולנטים טופולוגיים להחוץ של התא , ואחד של השני.
הוזיקולות שנוצרות מכילות גם מרכיבים ממברנליים של האברון ממנו הניצו , וגם מרכיבים מסיסים לומינחיים שלו.
המסלול האקסוציטי: חלבונים מגיעים ל ER (קו/פוסט טרנסלטורי) מה ER -> גולג׳י -> הממברנה הציטופלסמטית. יתכן מסלול פנימי מהצד שמגיע לאנדוזום.
המסלול האנדוציטי הינו הפוך ומתחיל ממברנת התא
מסלולי retrieval מחזירים את הוזיקולה לאברון האם שלה.
כדי שמערך הטרנספורט הוזיקולרי יהיה יעיל ומדוייק , הוזיקולות חייבות סלקטיביות :
- חייבות לקחת רק את החלבונים הנכונים (לא לקחת חלבונים רזידנטים מאברון לאברון)
- להשתלב רק באברון המטרה הנכון
100
שקף 13-3
מפת הדרכים:
בין הציטוזול לליזוזם ישנו מסלול ישיר , **בעצם מסלול אוטופאגיה** , כל מיני קומפוננטים ציטוזוליים מוקפים בממברנה - נוצר אוטופאגוזום - וזה מגיע לליזוזום.
במסלול ההפרשה , וזיקולות יוצאו מה ER לממברנת התא או לליזוזום , **בשני המקרים המסלול איננו ישיר , והוזיקולות מגיעות תחילה לגולג׳י**.
מכאן **שהאברון היחיד שה ER מקיים איתו טרנספורט וזיקולרי (דו כיווני) הוא רק הגולג׳י**.
101
הגולג׳י בנוי מרצף של ממברנות שנערמות אחת מעל השניה:
ניתן לראות גולג׳י באופן סלקטיבי דרך silver stains , **ועל כן ניתן לראות אותו במיקרוסקופ אור**.
הגולג׳י הוא מערך של ממברנות **שטחות** שנערמות אחת מעל השניה , בדומה לפיתות , כל ערמה או כל שכבה כזאת נקראת ציסטרנה , וברבים ציסטרנות. מערך גולג׳י טיפוסי מורכבת מ 4 - 6 ציסטרנות (שכבות) , אם כי ביצורים חד תאיים מסויימים ניתן למצוא גולג׳י שמורכב מ כ 20 (פיגר 13-27).
**בתאים אנימליים** , בין הציסטרנות מחברים לעיתים מבנים ממברנליים בצורת **צינורות** , וכך נוצר מערך שלם והמשכי של גולג׳י (ה apparatus) , שבד״כ יהיה ממוקם קרוב לגרעין התא ולצנטרוזום. אולם , המיקום המדוייק של הגולג׳י תלוי **במיקרוטובולים** , **אם המיקרוטובולים נמצאים במצב של דהפולימיריזציה** , נראה שהגולג׳י לא יהיה בצורת מערך אחיד ושלם , אלא שיהיה מפורק לכדי יחידות בדידות , שמפוזרות בכל מיני מקומות בתא **סמוך לנקודות היציאה (של וזיקולות) מה ER**.
**בצמחים** ובעוד ייצורים , הגולג׳י בכל מקרה נמצא בצורתו הבדידה והמפוזרת , שכל חלק ממוקם סמוך לאזור יציאת הוזיקולות מה ER.
מולקולות רבות מגיעות לגולג׳י, ובזמן שהותם בתוכו הן עוברות הרבה מודיפיקציות קוולנטיות. מולקולות אלה צריכות להיכנס לגולג׳י ולצאת ממנו. לכל מערך גולג׳י יש שני צדדים , הצד דרכו מולקולות נכנסות , **נקרא cis face** , והצד שממנו הן יוצאות , **נקרא trans face.** (שקף 13-27).
כל צד מבין השניים נמצא באסוציאציה עם אברון מסויים בתא (אני משער שה cis face למשל נמצא באסוציאציה עם ה ER) , כל צד גם כן בנוי מרשת של ציסטרנות שמחוברות בינהם (דרך מבנים צינוריים). הציסטרנות שמרכיבות את ה cis face נקראות CGN , כנגד cis golgi network , והציסטרנות שמרכיבות את ה trans face נקראות TGN.
ה CGN הם למעשה קלסטרים ממברנליים שמקורם ב ER שהתחברו והתאחו יחדיו.
אל ה CGN מגיעות וזיקולות מה ER וכעת יש להם שתי אפשרויות , או להתקדם הלאה במערך לכיוון היציאה , או לחזור ל ER. מולקולות שיוצאות מה TGN מתקדמות הלאה לאברון היעד שלהם: אנדוזום או מופרשות לממברנת התא. כמו כן יתכן שוזיקולות מה TGN יחזרו אחורה למדור הקודם.
לא כל חלבון שמגיע לגולג׳י משונע הלאה , חלק **מהחלבונים הממברנליים** (ורק הם) נשארים בגולג׳י , וזהו המקום הסופי שלהם (כנראה רזידנטים שמוציאים לפועל כל מיני מודיפיקציות).
102
שקף 13-27
הצד הקרוב ל ER הוא הציס
בתאים צמחיים הגולג׳י יותר מובגל מאברונים אחרים , בגלל המבנה הבדיד שלו , מאשר בתאים אנימליים.
103
פיגר 13-28
בתא אנימלי מובילי , הגולג׳י יהיה פולרי , והוא יפנה (צד הטרנס) לכיוון תנועת התא.
104
מודיפיקציות בגולג׳י:
אמרנו מקודם , ששייר אוליגוסכרידי מתווסף לחלבונים עלב ER בקשר N-גליקוזידי ליצירת גליקופרוטאינים. השייר הזה עובר מספר חיתוכים ו- trimming , בעודו ב ER , ה trimming עוזר לחלבון שלא התקפל להתקפל (הורדת שני גלוקוז) , או לחילופין שולח אותו לדגרדציה בפרוטאוזום (הורדת מנוז).
ברגע שחלבון , **עם מה שנותר מהשייר האוליגוסכרידי שלו** , מגיעים לגולג׳י , הגולג׳י חותך את השייר עוד יותר , ויוצר ממנו מבנים **מגוונים** ורבים , **שמאפיינים חלבונים בוגרים**.
חלבונים מגיעים לגולג׳י , נכנסים אליו מצד הציס , ומתקדמים הלאה עד שמגיעים לצד הטרנס. העיבוד של השייר הסוכרי מתרחש בשלבים , כשבעל ציסטרנה ישנו מערך אנזימים אופייני ויחודי לה שעושה סוג מסויים של ריאקציות. **בצד הטרנס מתרחשת פעולת הגליקוזילציה האחרונה והסופית**. הלומן של הציסטרנה הזאת , הכי מרוחקת (יחסית ל ER) הינו המשכי עם ה TGN , שממנו מנצות הוזיקולות.
105
פיגר 13-29
קומפרטמנטיזציה של הגולג׳י
החלקים השונים של הגולג׳י , ה cis ,ה middle , וה trans נבדלים זה מזה **פונקציונלית**. ועלכן כן עיבוד N- גליקופרוטאינים מתרחש בשלבים , כשבעל שלב יש אנזימים שונים.
הניסוי מערך דרך פרגמנטציה של הגולג׳י + שימוש בצבעים. הצבעים יחודיים לאנזימים מסויימים , וכך ראו חלוקה לא שווה בצבעים , ועל כן באנזימים. osmium למשל יחודי לציסטרנות ציס.
לפי הצבעים ראו גם שיותר מציסטרנה אחת נצבעת , משמע , חחק מהציבטרנות הסמוכות מכילות אותם אנזימים.
106
פיגר 13-30
סוגי מודיפיקציות + שקף 170/171
גילו שבאזורים שונים בגולג׳י מתרחשות מודיפיקציות שונות בטכניקה שמערבת שבירה של הגולג׳י ושימוש בנוגדנים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.
הנוגדנים הינם ספיציפיים לאנזימים של אזור מסויים , וחכן ניתן דרכם לדעת איזה אנזימים קיימים באיזה אזור , ועל כן , איזה מודיפיקציות מתרחשות בו.
סוגי אנזימים שונים אינם מוגבלים לציסטרנה יחידה , אלא שהם נמצאים בעיקר בה , אך כמויות הולכות ומתמעטות שלהם ימצאו בשלבים יותר מרוחקים של המערך.
אנזימים שעושים מודיפיקציות מוקדמות על גליקופרוטאינים , ימצאו בעיקר בציסטרנות ציס , ואנזימים שמבצעים מודיפיקציות מאוחרות , ימצאו בעיקר על ציסטרנות טרנס.
107
שרשראות אוליגוסכרידיות מעובדות בגולג׳י:
בעוד **הלומן** של ה ER מלא בחלבונים ואנזימים רזדנטים , בגולג׳י , **כל החלבונים הרזדנטים קשורים לממברנה**.
כך **שכל הגליקוזידאזות (הורדת סוכרים) וה glycosyl טרנספרזות (הוספת סוכרים) בממברנת הגולג׳י הם חלבוני single pass** , שבד״כ קיימים בממברנה בצורת קומפלקסים מולטיאינזימטיים.
בתאים של יונקים , ישנם שני סוגים עיקריים של גליקופרוטאינים עם קשר N-גליקוזידי:
- complex oligosaccharides
- high mannose oligosaccharides
בחלק מהמקרים , ניתן למצוא את שני הסוגים על אותו גליקופרוטאין , אך קשורים בשני מקומות שונים.
**הקומפלקס אוליגוסכריד** , נוצר כאשר לשייר האוליגוסכרידי שעבר trimming ב ER מתווספים עוד יחידות של סוכר בהגעת הגליקופרוטאין לגולג׳י. החשוב מבינהם הוא **חומצר סיאלית** , בגלל מטענה השלילי.
מנגד, ה high mannose נוצר כאשר ב ER יש trimming של השייר האוליגוסכרידי , ללא הוספה של שום סוכרים לגליקופרוטאין בהגיעו לגולג׳י (פיגר 13-31).
(האם כל הסוכרים יוצאים מה ER כשהם high mannose?)
כעת נשאלת השאלה , כיצד נקבע איזה משתי האופציות תתרחש?
העניין תלוי במיקום האוליגוסכריד על הגליקופרוטאין , אם השייר חשוף - נגיש לאנזימים בגולג׳י - יתווספו אליו עוד סוכרים ונקבל אוליגוסכריד מסוג complex. אם השייר אינו נגיש לאנזימים בגולג׳י , הוא ישאר high mannose.
בגנום אנושי יש מאות גנים שמקודדים ל glycosyl טרנספרזות שונים , כל סוג פועל בתאים שונים , או בשלבים התפתחותיים שונים , וזה נכון לא רק ל N-אוליגוסכרידים אלא גם ל O-אוליגוסכרידים.
108
פיגר 13-31
שני הסוגים העיקריים של N-linked oligosaccharides בתאים יונקים:
Complex vs. high mannose
כאמור , גליקוזילציה מסוג N , מתרחשת כאשר האנזים אוליגוסכריל טרנספרז קושר את השייר הסוכרי **על חומצת אמינו מסוג אספרג׳ין Asn** ב ER.
בהגיע הגליקופרוטאין לגולג׳י , יתכנו שני מסלולים עיקריים להמשך עיבוד החלבון.
בכל מקרה , החלבון יוצא מה ER כשיש עליו ליבה סוכרית של 5 סוכרים: שני GlcNac + שלש מנוזות. (בעצם הורדנו מהאוליגוסכריד המקורי 9 סוכרים - 3 גלוקוז ו- 6 מנוז).
גליקופרוטאינים עם שייר אוליגוסכרידי מסוג complex , הם כאלה שכאמור התווספו לליבה הסוכרית שלהם עוד סוכרים בגולג׳י. מסתבר שלאופן ההוספה יש חוקיות:
**אוליגוסכריד מסוג complex יכיל את יחידת הליבה + יחידה טרמינלית שבנויה ממספר משתנה של **טריסכרידים** זהים (B).
בנוסף , תתכן הוספה של יחידת fucose על ה GlcNac של יחידת הליבה.
בגליקופרוטאינים מסוג high מנוז , זה לא שרק יחידת הליבה נותרת בשייר האוליגוסכרידי , אלא שמתווספים אליה עוד מספר קטן של **מנוזות**.
כאמור , על חלבון נתון יתכנו , בשני מקומות שונים , גם שיירי complex וגם שיירי high.
109
פיגר 13-32
יצירת שייר מסוג complex oligosaccharide
תהליך עיבוד הגליקופרוטאין , הינו תהליך מסוגר ומאורגן , בו כל שלב מסתמך על השלב שקדם לו.
1) **זהו השלב היחיד שמתרחש ב ER**: שני סוגי גלוקוזידאזות שונים מורידים את כל הגלוקוז מהאוליגוסכריד גלוקוזידאז1 מוריד את הגלוקוז הראשון , ומיד אחריו גלוקוזידאז2 מוריד את השניים הנותרים. לאחר מכן **מנוזידאז ממברנלי** מוריד מנוז אחד ספיציפי.
2) **מעכשיו הכל מתרחש בגולג׳י**: האנזים **גולג׳י מנוזידאז1** מוריד 3 מנוזות
3) האנזים N-אציטיל גלוקוז אמין1 מוסיף מולקולת GlcNac , שבמקור קשורה למולקולת UDP ועל משופעלת.
4) גולג׳י מנוזידאז2 מוריד עוד שני מנוזות, בכך מתקבלת אצלנו יחידת הליבה: 2 GlcNac ו- 3 מנוזות.
בסוף שלב 4 , והלאה , הקשר בין שני ה N-אציטיל גלוקוז אמינים (GlcNac) ביחידת הליבה נהיה עמיד בפני האנזים EndoH , כנראה שאוליגוסכריד מסוג high מנוז אינו עמיד , ולכן האנזים משמש כדי שנוכל לזהות ולהבדיל בין שני סוגי האוליגוסכרידים complex ו- high.
5) מתווספים הסוכרים השונים על יחידת הליבה לפי החוקיות (מספר חזרות שונה של אותם טריוזות).
כל הסוכרים שמתווספים במסלול מתווספים בעודם קשורים לנוקליאוטיד כלשהו כדי שהם יהיו משופעלים. הוספת הסוכרים מתרחשת בציסטרנות השונות , ע״י שלשה סוגים שונים של glycosyl טרנספרזות. בעצם בממברנה של הציסטרנות ישנם חלבונים נשאים שעושים exchange **מכניסים את הקומפלקס נוקליאוטיד-סוכר , ובמקומו מוציאים נוקליאוזיד פוספט**.
הבדל חשוב בין הגולג׳י ל ER: כל הסוכרים בגולג׳י מתווספים בלומן!! והמקור שלהם הוא סוכר-נוקליאוטיד. ב ER N-גלקוזילציה תחילה בציטוזול ואז עוברת לצד הלומינלי , כאשר הסוכרים מתווספים ממולקולת דוליכול.
שקף 175
110
עמוד 811 בספר יצירת פרטאוגליקנים בכוחג׳י , משום מה זה אינו מופיע במצגת
111
שקף 174 במצגת המורחבת.
112
למה גליקוזילציה כה חשובה ?
הבדל עיקרי בין סנתזה ובניה של אוליגוסכרידים לבין יצירה של מאקרומולקולות אחרות כגון דנא , רנא וחלבונים , היא שבשלשת האחרונים , התהליך מתרחש על סמך גדיל תבנית , השלבים הם זהים ורפטטיהיים , ואנזים העיקרי שמבצע את הפעולה הוא אותו אנזים לאורך כל התהליך. הסוכרים התמונה שונה , אין תבנית , וכל שלה בבניית האוליגוסכריד מאונזם ע”י אנזים אחר , שרק הוא יודע לעשות את הפעולה הספיציפית.
גליקוזילציות על חלבונים הם כה חשובות , עד שיש משפחת מחלות גנטיות שנגרמת בגלל פגמים במסלולים הביוסנטתיים של יצירת אוליגוסכרידים , ונקראת congenital disorders of glycosylation.
**גליקוזילציות N- הן יותר שכיחות בכל היוקריוטים** , נמצא שיש גם גליקוזילציות N בארכאה , מה שמלמד שהתהליך שמור אבולוציונית עקב חשיבותו הרבה.
1) גליקוזילציה על חלבונים תורמת לקיפול נכון של חלבונים בשני אופנים:
- הופכת את החלבון המקופל ליותר מסיס ומונעת היווצרות אגרגטים
- מהווה קוד עבור שפרונים ולקטינים לפיו הם מנטרים את מצב החלבון ומחליטים מה יעלה בגורלו.
2) שיירים אוליגוסכרידים על חלבונים הם מבנים לא גמישים , אי לכך , הנוכחות שלהם מגבילה גישה אליהם ע״י מאקרומולקולות אחרות , כמו למשל אנזימים פרוטאוליטים , ולכן חלבונים מסוכרים יהיו יותר עמידים בפני פרוטאוליזה.
נוכחות אוליגוסכרידים על חלבונים בממברנה הציטופלסמטית של התא יוצרת שכבת הגנה , כזאת שבניגוד לדופן התא של חיידקים , מאפשרת לתא לשנות את צורתו ולזוז.
3) שכבת המוקוזה שעוטפת סוגי תאים מסויימים כגון תאים בריאות ובדרכי העיכול מספקת הגנה לתא מפני פתוגנים , שכבה זו עשירה בסוכרים.
4) שכבת הסוכרים מסביב לתא חיונית בתהליכים התפתחויים רבים , מאפשרת לתאים לזהות אחד את השני , ופועלת במסלולי מיגרציה תאית. למשל סלקטינים selectins הם לקטינים טרנסממברנליים שפועלים באדהזיה בין תאים במהלך מיגרציה של תאי דם אדומים.
השכבה הסוכרית גם משפיעה על האופן בו תרופות משפיעות על תאים.
5) בקרה במעבר סיגנלים , כמו למשל ברצפטור הממברנלי NOTCH (שקף 177).
113
Golgi matrix proteins help organize the stacks:
הארכטקטורה המיוחדת של הגולג׳י נוצרת הודות למיקרוטובולים ולחלבוני מטריקס.
דוגמה ראשונה לחלבוני מטריקס כאלה הם החלבונים הציטופלזמטיים שנקראים GRASP , חלבוני grasp יוצרים פיגומים מולקולריים בין ציסטרנות סמוכות , ונותנים למערך את הintegrity המבנית שלו.
חחבוני מטריקס נוספים הם גולג׳ינים golgins , אלה חלבוני tethering , בעלי מבנה מעניין , הם בוניים מאזורים קשיחים של coild coil , שמפרידים בינהם אזורי hinge , הם נמצאים על הממברנה של הגולג׳י ובולטים החוצה לציטופלסמה , עד כדי מרחק של 100 - 400 ננומטר. סוגים שונים של גולג׳ינים נמצאים באזורים שונים על הגולג׳י , על וזיקולות שמגיעות לגולג׳י יש חלבוני Rab , לכל סוג וזיקולה יש Rab שיחודי להן , הגולג׳ינים מזהים את הRab הנכון ומכוונים את הוזיקולה לאזור הנכון שלה על הגולג׳י (פיגר 13-37).
בעת חלוקה תאית , קינאז מיטוטית מזרחנת את חלבוני המטריקס ומשביתה אותם , אי לכך , מערך הגולג׳י מתפרק ומתפזר בכל בציטוזול , כך כשהתא מתחלק , כל תא בת מקבל מספר חתיכות של גולג׳י. בתאי הבת חלבוני המטריקס הם דה-מזורחנים , ולכן הם שווים ומרכיבים את הגולג׳י בחזרה.
באפפטוזיס , קספזות caspases חותכים את חלבוני המטריקס , מה שגורם לפרגמנטציה של הגולג׳י בזמן שהתא מתאבד.
114
סיכום עמ׳ 815 בספר
115
דגרדציה ומחזור של מאקרומולקולות בליזוזום:
הליזוזום הוא היעד הסופי עבור הרבה חלבונים , מיקרואורגניזמים , תאים מתים , ועוד חומרים אחרים שצריכים לעבור דגרדציה (או מחזור). חומרים מגיעים לליזוזום דרך אנדוציטוזה , פאגוציטוזה , או דרך **אוטופאגיה** , שבה **מרכיבים ציטוזוליים** כגון אברונים וחלבונים עוברים דגרדציה.
116
הליזוזום הוא האתר העיקרי לדגרדציה **אינטראצלולרית**:
הליזוזום מכיל כ 40 סוגי שונים של אנזימים **מסיסים** (פועלים בלומן) **הידרוליטיים** (שוברים קשרים בעזרת מים) , **כשכולם הם acid hydrolases** (פועלים הכי טוב בתנאים חומציים).
והם בעצמם מופעלות ע״י אנזים פרוטיאוליטי , שגם הוא צריך תנאים חומציים. ואכן , הליזוזום מספק את הסביבה החומצית הנחוצה , שכן ה pH שלו נע הין 4.5 ל 5.
החומציות של הלומן של הליזוזום נוצרת הודות למשאבת פרוטונים vacuolar H ATPase (כלומר v type) ששואבת פרוטונים מהציטוזול אל תוך הליזוזום (נגד כיוון המפל) , בתמורה לביקוע אטפ.
(פיגר 13-62).
המשאבה הזו דומה בארכיטקטורה שלה ל אטפ סנתאז synthase שבמיטוכונגריה והכלורופלסט שהו מסוג f type ATPase , האטפ סנתאז יודע **ליצור** אטפ כנגד גרדיינט פרוטונים , המשאבה הליזוזומלית יודעת מנגד אק לבקע , ולכן חרף הדמיון המבני , התפקיד שונה מאד.
ה pH בציטוזול הוא קרוב לניטרלי , ועומד על כ 7.2 , לפי כך החלבונים מציטוזול מוגנים מההידרולאזות הליזוזומיות בשני אופנים:
- הממברנה של הליזוזום ששומרת אותם בפנים
- ה pH הניטרלי שאינו טוב עבורם
מלבד הלומן היחודי של הליזוזום שמכיל אנזימים הידרוליטיים רבים , הממברנה שלו היא גם כן יחודית , שכן , מרבית החלבונים הממברנליים בליזוזם נמצאים במצב מסוכר (גליקוזילציה) , נוכחות השייר הסכרידי מגנה עליהם מפני הפרוטאזות של האברון עצמו.
לאחר סיום תהליך הפירוק והדגרדציה של מאקרומולקולות בליזוזום , טרנספורטרים על הממברנה שלו לוקחים את תוצרי הפירוק: ח״א , סוכרים , נוקליאוטידים , ומוציאים אותם לציטוזול , פה התא יכול להשתמש בהם במסלולים מטבוליים כאלה ואחרים , או להפריש אותם החוצה.
אברונים רבים במסלול ההפרשה או האנדוציטוזה כגון וזיקולות , אנדוזומים חלק מהמדורים של הגולג׳י (למדורים שונים בגולג׳י רמת חומציות שונה) מכיל עלנגבי הממברנות שלהם משאבות פרוטונים דומות או זהות לאלו הנמצאות על הליזוזום , ותפקידם לשמור על סביבה אברונית פנימית חומצית.
מלבד סביבה חומצית פנימית , גרדיינט הפרוטונים גם מספק אנרגיה לחציה של מטבוליטים את הממברנה
פרוטאוזום מפרק חלבונים ציטוזוליים ואינו אברון.
117
הליזוזומים הם הטרוגניים:
ליזוזומים נמצאים בכל התאים היוקריוטים , והם התגלו לראשונה בשיטות fractionation של תאים.
בהסתכלות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים , ליזוזומים נראים מאד שונים אחד מהשני , אולם בצביעה בנוגדנים התגלה שלמרות השוני המורפולוגי הרב , כל הליזוזומים שייכים לאותה משפחה.
המגוון במופע הליזוזוים נחשב מעט חריג בהתחשב בכך שמרבית האברונים הם בעלי מופע די קבוע. מסתבר , שהמגוון הרחב במופע הליזוזם משקף את מגוון פעולות הדגרדציה הרבות שהוא מסוגל לבצע: דגרדציה של מרכיבים פנים וחוץ צלולריים , עיכול מיקרואורגניזמים , יצירת נוטריינטים עבור התא.
המגוון המורפולוגי כמו כן מלמד על האופן בו הליזוזום נוצר. בשלבים שונים בתהליך יצירת הליזוזום , המופע שלו יהיה שונה. late endosomes שמכילים חומרים שהגיעו ממברנת התא באנדוציטוזה , וכן **הידרולאזות ליזוזומאליות חדשות** מתאחים עם ליזוזומים שכבר קיימים ליצירת מבנה שנקרא אנדוליזוזום. לאחר זמן מה , אחרי שכל החומרים שהגיעו אליהם מהממברנה התעכלו (מלבד חלבונים עיקשים שדורשים יותר זמן) , האנדוליזוזומים הופכים לליזוזומים רגילים בעלי מראה ליזוזומלי קלאסי: אברונים קטנים , עגולים , ודחוסים , שעכשיו בתורם יכולים להתאחות עם late endosome ליצירת אנדוליזוזום וכן הלאה.
לפי האמור מעלה אם כך ניתן להגיד שאין הבדל משמעוצי בין ליזוזומים ואנדוליזוזומים , כך ש **ליזוזומים ואנדוליזוזומים הם אותו דבר , רק מייצגים שלבים שונים בהבשלת האברון**.
118
פיגר 13-36
האנזים acid phosphatase הינו מרקר עבור ליזוזומים.
המורפולוגיה השונה של הליזוזומים מעידה על חומרים שונים שמעוכלים.
119
פיגר 23-64
מטורציה ליזוזומלית , kate endosome מתאחה עם ליזוזום קיים או עם אנדוליזוזם , בתום תהליך העיכול , הם יהפכו לליזוזם רגיל.
120
הואקוולה בצמחים משמשת כליזוזום ורסטילי:
בתאי צמחים ופטריות , לרבות שמר , ישנה ואקוולה אחת או יותר.
הואקוולה הינה נפחית , ומהווה בין 30% ל 90% מנפח התא , תלוי בסוג התא.
הואקוולה מקבילה לליזוזום האנימלי בזה שהיא מכילה אנזימים הידרוליטיים רבים , אולם מבחינה פונקציונלית היא מקיימת מספר תפקידים מאד מגוון (לזכור שבתא אנימלי האנדוליזוזום והליזוזם הם אותו אברון בגדול) , מבין תפקידי הואקוולה:
- מרכז אחסון של ניטריינטים ופסולת
- מדור לדגרדציה
- ויסות נפח התא (מגדילה את נפח התא כשצריך)
- שליטה בלחץ טורגור שמונע קריסה של התא
כמו כן , ניתן **באותו תא** למצוא מספר ואקוולות במקביל , כשכל אחת עושה משהו אחר.
הואקוולה גם מסייעת בשמירה על הומיאוסטזיס בתא, כגון חומציות הציטופלסמה. כאשר החומציות בסביבת התא יורדת (ריכוז הפרוטונים עולה) , נוצר כח מניע שמכניס פרוטונים מחוץ לתא אל תוכו , הודות ל influx של פרטונים אל תוך הואקוולה (לצד מנגנונים נוספים) נמנעת הצטברות של פרוטונים בציטופלסמה ועל כן החומציות בה נשמרת. כמו כן היא שומרת על לחץ טורגור בתא , ע״י טרנספורט של מומסים בין הלומן שלה והציטופלסמה , פנימה והחוצה , כד להתאים את הלחץ האוסמוטי בתא לסביבה.
חלבונים יכולים להתאחסן בואקוולה בתאים של זרעי הצמחים במשך שנים , כשהזרע נובט , האנזימים ההידרוליטיים בואקוולה שוברים את החלבונים ומייצרים חומצות אמינו שהזרע משתמש בהם כמזון לגדילתו
121
פיגר 13-65
מוצג תא צמח שמייצר ראווהפורין מסוג YFP
הגודל של הואקוולה
122
פיגר 13-36
התא יכול להגדיל את הנפח שלו ללא צורך בהגדלת נפח הציטוזול , זאת הוא עושה באמצעות הואקוולה.
123
ישנם 4 מסלולים שדרכם חומרים מגיעים לליזוזום:
שקף 183
הליזוזום הוא נקודת המפגש של המון וזיקולות שנעות בתא כחלק ממסלולי התובלה התאית.
וזיקולות מה ER שמכילות אנזימי עיכול ליזוזומליים מנצות ממנו , מגיעות לגולג׳י , ולבסוף לליזוזום.
חומרים מחוץ לתא או ממברנת התא עצמה מגיעים , **באנדוציטוזה** , לליזוזום בשלשה מסלולים שונים.
אברונים ומאקרומולקולות מהציטוזול מגיעים לליזוזום לאחר אוטופאגיה.
באנדוציטוזה , חלקי ממברנת התא (פוספוליפידים) , חלבונים ממברנליים , ונוזל חוץ תאי נכנסים אל תוך הציטוזול , בוזיקולה , שמתאחה עם האנדוזום , שבסוף יבשיל ויהפוך להיות ליזוזום. במסלול דומה , שנקרא **מאקרופינוציטוזה** , אותם חומרים - ממברנה , נוזל חוץ תאי וחלבונים - מגיעים לאנדוזום בטופן דומה לאנדוציטוזה , אולם מאקרופינוציטוזה **אינה ספיציפית**.
מסלול נוסף, קיים בתאים פאגוציטיים , כמו תאי מערכת החיסון , נוטרופילים ומאקרופאגים , הם בולעים מיקרואורגניזמים שנקראים בדרכם ליצירת פאגוזום , המיקרואורגניזמים מגיעים לליזוזום של התאים הללו ומתפרקים.
אוטופאגיה , זהו מסלול שבו צורונים **מהציטוזול עצמו** כמו חלקי אברונים שצריכים החלפה , מיקרובים שפלשו לציטוזול , מגיעים לליזוזום ומתפרקים.
פאגוציטוזה , מאקרופינוציטוזה , ואוטופאגיה הם מסלולים שמיועדים בלעדית לדגרדציה. אנדוציטוזה לא , היא יכולה להיגמר בדגרדציה בליזוזום , ויכולה פשוט לשמש לתובלת חומרים מחוץ לתא , שאינם מיועדים לדגרדציה , פנימה.
פיגר 13-67: אוטופאגוזום מכיל ממברנה כפולה.
124
אוטופאגיה , אכילה עצמית של חלבונים ואורגנלות:
אוטופאגיה הינו מנגנון שקיים בכל התאים **היוקריוטים**. במהלכו , חלק מהציטופלסמה (ותכולתה בין אם אברון ובין אם מאקרומולקולה) מוקפים ביריעה ממברנלית **ממקור לא ידוע** , ליצירת מבנה שנקרא *^אוטופאגוזום** , שבסוף מתאחה עם הליזוזם ושופך את תכולתו אל תוכו , שם הם יעברו דגרדציה (פיגר 13-71).
ישנם שני סוגי אוטופאגיה , סלקטיבית ולא סלקטיבית.
**אוטופאגיה לא סלקטיבית**: באופן לא בררני , נפח גדול של הציטופלסמה , עם תכולתה , נסגר בתוך הממברנה ליצירת האוטופאגוזום.
**אוטופאגיה סלקטיבית**: הממברנה נסגרת באופן סלקטיבי על חומרים ספיציפיים , עם **מעט** ציטוזול.
לאוטופאגיה יש מספר תפקידים חשובים:
1) **התפתחות:** חלק ממנגנוני ההבשלה וההתפתחות התאית דורשים מהתא להיפטר מכל מיני אברונים בתוכו , הדבר נעשה ע״י אוטופאגיה.
2) **בתנאי עקה**: כאשר התא חווה סטרס או רעב , הוא עושה אוטופאגיה **לא סלקטיבית** , מפרק חלבונים ומאקרומולקולות שהוא גרף באוטופאגוזום לאבני בניין , ובונה מהם חומרים חדשים יותר דחופים.
3) אוטופאגיה סלקטיבית משמשת את התא להילחם בפתוגנים שפלשו לציטופלסמה שלו , הוא עוטף אותם בממברנה ומפרק אותם בליזוזום. כמו כן אגרגטים חלבוניים (שלא התקפלו) , ואברונים **שלמים** מקולקלים מפורקים באוטופאגיה סלקטיבית.
אוטופאגיה היא כל כך חשובה , שפגיעה במנגנון גורם למנעד רחב מאד של מחלות , החל ממחלות זיהומיות , דרך מחלות נוירודגנירטיביות , וכלה בסרטן.
האוטופאגוזום נוצר כשמספר וזיקולות מתאחות יחדיו. תחילת התהליך היא כאשר **קומפלקס קינאז ממברנלי** בשם **פוספואנוזיטיד ליפיד קינאז** או ATG1 , מייצר בצורה מקומית באתר בו הוא יושב בממברנה PI3P , יצירת ה PI3P מסמנת את אתר הנ״ל כאתר פוטנציאלי שאליו , יגוייסו פקטורי אוטופאגיה.
בהגעת פקטורי האוטופאגיה למקום הרלוונטי בממברנה , הם מחברים פוספוליפיד בשם **פוספטידיל אתנול אמין** , בצורה קוולנטית , לחלבון דמויי יוביקוויטין בשם ATG8
הוזיקולות עם ה ATG8 עוברות איחוי הומוטיפי זו עם זו , והטרוטיפי עם וזיקולות שמכילות ATG9 , ליצירת מבנה ממברנלי , כאשר המרכיב ה ATG8 הוא זה שקובע את זהות הממברנה שנוצרה.
הממברנה שנוצרת (שבהמשך תהפוך להיות הממברנה של האוטופאגוזום) אינה ספרית , אלא בעלת צורה של דיסקית דחוסה , שאז מקבלת צורה של כוס (שתיה). כאשר הממברנה דמויית הכוס עוטפת את ה cargo שלה ונסגרת עליו , היא יוצרת מסביבו שכבה כפולה (שתי ממברנות דו שכבתיות) , הממברנה החיצונית מתאחה , בתיווך חלבוני SNARE עם הממברנה של הליזוזם , הממברנה הפנימית והתכולההציטופלסמטית בתוכה נשפכים אל תוך הליזוזום , שם הם מלורקים ע״י ה acid hydrolase.
125
פיגר 13-71
בפיגר מודגש , הוזיקולות שנוצרות ובונות את ממברנת האוטופאגוזום הם ממקור לא ידוע.
יצירת הממברנה נקראת בפיגר nucleation , והתהליך יוצר לפועל עקב קליטת סיגנל בתא.
126
קצב היארעות אוטופאגיה לא סלקטיבית מבוקר לפי זמינות של נוטריינטים:
כמו בכל דבר , גם פעילות הקינאז ATG1 , שמאתחל יצירת אוטופאגוזום , נתונה לבקרה.
רוב הזמן , ATG1 נמצא במצב לא פעיל , הודות לפעילות קינאז אחר בממברנה שנקרא mTOR complex 1. הפעיחות של שומפלקס mTOR תלויה בזמינות של מספר חומצות אימנו שנוצרות בליזוזום (בתהליכי פירוק ומחזור של חלבונים ציטוזוליים) , כאשר רמת חומצאת האמינו הנ״ל גבוהה , ה mTOR יהיה פעיל , יזרחן את קומפלקס ATG1 וישבית אותו. כאשר כמות חומצות האמינו האלה יורדת , תרד גם פעילות הקונאז mTOR , מה שאומר שהעיכוב על ATG1 ירד. כעת , משהו פעיל , ATG1 יכול לאתחל יצירת **אוטופאגוזום לא סלקטיבי** , שעוטף ציטופלסמה + תכולה ציטופלסמטית , לרבות חלבונים , בממברנה כפולה ושופך את תכולתה בליזוזום. התוצר של פירוק האוטופאגוזום הוא , בין היתר , גם חומצות האמינו שמארטבות את mTOR complex 1 , וכשזה חוזר להיות פעיל , הוא חוזר להשבית את ATG1 , וקצב יצירת אוטופאגוזומים לא סלקטיביים יורד בחזרה. לפי ה loop הזה , זמינות הנוטריינטים בתא מבקרת את קצב היווצרות אוטופאגוזומים לא סלקטיביים.
אוטופאגיה תלויית רעב (לא סלקטיבית) הינה בעלת חשיבות מירבית בתאי יונקים בשעות הראשונות אחרי הלידה. בשלב הזה אספקת המזון לעובר (ילוד) דרך ברחם נפסקת , והוא עודנו לא אוכל בעצמו , ולכן פירוק של חלבונים ציטוזוליים בחיזוזום באוטופאגיה לא סלקטיבית נותן פתרון יעיל ומספק חומצות אמינו חיוניות למסלולים מטבוליים קריטיים , עד שהילוד מתחיל לאכול בכוחות עצמו.
אוטופאגיה לא סלקטיבית מבוקרת , לצד מנגנון mTOR , גם ע״י סיגנלים חוץ תאיים ותוך תאיים , לרבות , רמת אטפ ו- ופקטורי גדילה.
127
אוטופאגיה סלקטיבית מתווכת ע״י משפחה של רצפטורים:
אוטופאגיה סלקטיבית עוסקת בדגרדציה והשמדה בליזוזום של מיקרובים שפלשו לתא , אברונים שהתא לא צריך , אגרגטים וקומפלקסים חלבוניים שגדולים מדי כדי שיתפרקו בפרוטאוזום.
השלבים בהם נוצר אוטופאגוזום סלקטיבי הם אותם שלבים שבהם נוצר אוטופאגוזום לא סלקטיבי , ההבדל הוא רק בשלבים המוקדמים של התהליך , **שבו ה cargo שמיועד לדגרדציה מובא לממברנה , לאתר היווצרות הפאגוזום**.
הבאת ה cargo אל אזור היווצרות האוטופאגוזום בממברנה , מתווכת ע״י קולטנים , שמצד אחד מזהים את מולקולת ה cargo , ומצד שני יודעים להיקשר לחלבוני ATG8 שעל ממברנת האוטופאגוזום , בכך הם מקשרים בין השניים.
התהליך כאמור הינו סלקטיבי , וכדי שהתא יוכל לתת מענה לסוגי ה cargo הרבים שמפורקים בליזוזום במסלול הזה , היה עליו לפתח מספיק סוגי קולטנים שידעו לזהות את סוגי ה cargo השונים , שאז יודעים לקשור בינם לבין ה ATG8 על ממברנת האוטופאגוזום. במרבית המקרים , הזיהוי של ה cargo ע״י הקולטנים מתרחש לפי מרקרים מיוחדים שמופיעים עליו רק כאשר הוא מיועד לדגרדציה , כאשר המרקר הנפוץ ביותר הוא יוביקוויטין.
**דוגמה:**
חיידקים שהצליחו לחמוק מפאגוציטים ופלשו לציטופלסמה של תאים כאלה ואחרים , מזוהים ע״י חלבונים ציטוזוליים בתוך התא המותקף. החלבונים האלה מסמנים את ממברנת החיידק , על גבי חלבונים טרנסממברנליים בקטריאליים בתג של יוביקוויטין , ועוד כל מיני חלבונים אחרים , הקולטנים מזהים את ה cargo , וזיקולות עם ATG8 מגיעות לאזור , מתאחות יחידו ליצירת אוטופאגוזום , שבולע את הפולש , ללא ציטוזול כי זה סלקטיבי. דבר מעניין , בגלל שאין ציטוזול באוטופאגוזום סלקטיבי , צורת האוטופאגוזום היא כצורת הדבר שנבלע 🙂
**מיטופאגיה:** זהו תהליך אוטופאגיה סלקטיבי של בליעת המיטוכונדריה. במצב תקין , הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה הינה בעלת פוטנציאל אלקטרוכימי הודות לגרדיינט הפרוטונים , גרדיינט זה משרת מספר פונקציות כגון יצירת אטפ , ו import של חלבונים. במיטוכונדריה חולות , הפוטנציאל על הממברנה הפנימית נעלם , והתפקודים שתלויים בו גם כן , בייחוד ה import של חלבונים. קינאז בשם pink1 שבד״כ נכנס למיטוכונדריה , נשאר כעת על הממברנה החיצונית שלה , בגלל העדר הפוטנציאל , pink1 מגייס יוביקוויטין ליגאז **מהציטוזול** שנקרא parkin , שמסמן את חלבוני הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה עם יוביקוויטין , תג היוביקוויטין משמש כמרקר עבור אחד הקולטנים שמתווכים אוטופאגיה , שנקשר למיטוכונדריה ומגייס וזיקולות של ATG8.
מוטציה ב pink1 או ב parkin גורמת לפרקינסון
128
פיגר 13-72
הקולטנים שדיברנו עליהם בכרטיס הקודם אינם ציטוזוליים , אלא נמצאים על ממברנת הוזיקולה , הם מזהים את ה cargo , לרוב , לפי מרקר.
129
ליזוזומים מסוגלים לעשות אקסוציטוזה:
הגעת החומרים השונים אל הליזוזום אינה בהכרח התחנה הסופית בעבורם. חלק מהליזוזומים יודעים גם להפריש דברים.
פסולת בלתי ניתנת לעיכול לצורך העניין , או חומרים אחרים שהתא לא מעכל אותם , בחלק מהתאים הליזוזום עבר סוג של התמחות , שהוא **יודע להתאחות עם הממברנה הפלסמטית** ולהפריש את הדברים החוצה מהתא.
**לדוגמה**: תאים מילנוציטים בעור, שהליזוזום שלהם מייצר ומאחסן מלנין (נקרא בשל כך melanosome) יודע להתאחות עם ממברנת התא ולהפריש את הפיגמנט החוצה אל האפידרמיס , שאז הוא נקלט בתאים קרטינוציטים , וזה מה שנותן לתא העור את צבעו.
במחלת הלבקנות , פגם בתהליך האקסוציטוזה של המילאנוזום מונע הפרשת הפגמנט לעור , ולכן הצבע הלבן שלהם.
תהליך דומה מתרחש גם עם vasicular bodies. בגוף יש וזיקולות קטנות שנקראות exosome , הם מסתובבות בסרום הדם ומעבירות חומרים בין תאים.
130
המסלול של האנזימים ההידרוליטיים אל הליזוזום:
האנזימים ההידרוליטיים של הליזוזום מיוצרים ב ER , ממנו הם יוצאים אל הגולג׳י , לאחר מכן וזיקולות בגולג׳י מנצות מאזור ה TGN , **מגיעות קודם כל לאנדוזום** , ורק לאחר מכן לאנדוליזוזום ולליזוזום (פיגר 13-64).
בתאים אנימליים , החלבונים ההידרוליטיים האלה מגיעים מה ER אל הגולג׳י עם שייר אוליגוסכרידי N-גליקוזידי. בגולג׳י הם מקבלים תג סוכרי מיוחד של מנוז-6-פוסםט , **שהוא ייחודי רק בעבורם** (פיגר 13-39). בממברנת ה TGN , ישנו רצפטור **טרנסממברנלי** למנוז -6- פוספט , שמזהה את השייר , ולפיו נקרשר אל ההידרולאזות בצד הלומינלי , ואל חלבוני אדפטור בצד הציטוזולי , שמייצרים מעיל קלתרין. השייר מנוז-6-פוספט כאמור הינו יחודי אך ורק להידרולאזות ליזוזומאליית , לפיו הרצפטור בממברנת ה THN יודע לזהות אותם מבין חלבונים אחרים שמיועדים למקומות אחרים , אורז אותם על גבי וזיקולות לאנדוזום ומשלח אותם הלאה (לאחר מכן האנדוזום מתאחה עם ליזוזום).
האפיניות של הרצפטור ל מנוז-6-פוספט הינה גבוה ב pH שבין 6.5 ל 6.7 , וזוהי אכן החומציות בלומן של ה TGN , ולכן הרצפטור קושר את השייר ועימו את החלבונים. בהגיע הוזיקולה אל האנדוזום , שבלומן של ה pH הוא בסביבות 6 , האפיניות של הרצפטור למנוז-6-פוספט יורדת , ולכן הוא משחרר את החלבונים באנדוזום. הרצפטור חוזר ל TGN על גבי וזיקולה עם מעיל של retromer , שהוא חלבון מעטפת יחודי רק לוזיקולות מהאנדוזום ל TGN (פיגר 13-40).
פיגר 13-40: החומציות של האנדוזום נוצרת הודות למשאבת פרוטונים.
131
לא כל ההידרולאזות עם תג מנוז-6-פוספט יגיעו לליזוזום:
חלקם יחמקו מהמהסלול שתיארונו בכרטיס 130 , וילכו במקום למסלול סקרטורי קונסטיטוטיבי , שבו הם יגיעו לבסוף לממברנת התא ויופרשו החוצה אל הנוזל החוץ תאי. במקביל , חלק מהרצפטורים ל מנוז-6-פוספט גם כן מגיעים לממברנת הפלסמה , במקום ללכת במסלול הרגיל לאנדוזום. בממברנה , הרצפטורים למנוז-6-פוספט תופסים את החלבונים שברחו ומחזירים אותם **באנדוציטוזה מתווכת קולטן** לליזוזום דרך **אנדוזום מוקדם ואינדוזום מאוחר**.
גם כאשר הם מופרשים לנוזל החוץ תאי , הידרולאזות ליזוזומאליות לא עושות הרבה נזק , החומציות ב ECF היא ניטרלית , והם הרי צריכים סביבה חומצית בשביל לעבוד.
קבוצת מנוז-6-פוספט חייבת להתווסף אך ורק לשייר האוליגוסכרידי של הידרולאזות ליזוזומליות ולא לאף גליקופרוטאין אחר , **אך למעשה כל הגליקופרוטאינים , ובכללותם ההידרולאזות הליזוזומאליות , שעוזבים את ה ER , עוזבים אותו עם שייר אוליגוסכרידי זהה** , ועל כן , הסיגנל להוספת שייר המנוז-6-פוספט לגליקופרוטאין חייב להיות בגוף החלבון עצמו ולא באוליגוסכריד , כך שהגולג׳י ידע על איזה מהגליקופרוטאינים צריך להוסיף את המנוז-6-פוספט. ואכן נמצא שעל החלבונים עצמם יש רצף חומצות אמינו שנקרא signal patch , שלפיו מוסיפים את המנוז6פוספט
מרבית ההידרולאזות הליזוזומאליות מכילים יותר משייר אוליגוסכרידי אחד , אי לכך , צריך לסמן אותם עם יותר ממנוז-6-פוספט אחד , מה שמעלה את האפיניות בין הגליקופרוטאין לבין הרצפטור למנוז-6-פוספט.
132
פיגר 13-41
ההידרולאזות הליזוזומאליות שמגיעות מה ER מגיעות עם signal patch , אותו מזה האנזים GlcNac phosphotransferase ב CGN. האנזים שם על מנוז טרמינלי בשייר האוליגוסכרידי של הגליקופרוטאין קבוצת פוספט לקבלת מנוז-6-פוספט.
לאנזים יש שני אתרים חשובים , אתר recognition דרכו הוא מזה את ה patch , ואתר קטליטי. ויש לו שני סובסטרטים , אחד זה הגליקופרוטאין , והשני הוא UDP-GlcNac שממנו הוא מוסיף את הפוספט.
133
פגם באנזים GlcNac phosphotransferase גורם למחלות אגירה ליזוזומליות:
מדובר במחלות גנטיות רציסיביות , שבהם יש פגיעה בגן מבני **יחיד** שמקודד להידרולאזה ליזוזומית , איך לכך , בהעדר האנזים , חומרים שמגיעים לליזוזום אינם מפורקים אלא מצטברים בו , ומכאן השם , מחלות אגירה ליזוזומליות.
המחלה כורמת לפגיעות נרחבות באיברים ומערכות רבים , אך בעיקר במערכת העצבים , רוב החולים לא ישרדו מעבר לגיל 7.
הסוג הכי חמור של מחלות אגירה ליזוזומליות נקרא inclusion cell disease , במחלה הזו כמעט כל ההידרולאזות הליזוזומליות לא מגיעות לליזוזום בסוגי תאים רבים (מלבד בכבד) , ולכן יש הצטברות רבה של חומרים בליזוזום.
במחלת ה inclusion , כל ההידרולאזות שלא מגיעות לליזוזום מופרשות אל זרם הדם , עקב כשל במנגנוני ה sorting בגולג׳י. בעצם ב CGN חסר האנזים GlcNac phosphotransferase , אנזים זה מוסיף קבוצת פוספט לשייר האוליגוסכרידי של גליקופרוטאינים , ליצירת מנוז-6-פוספט (פיגר 13-40) , בהעדר האנזים מנוז-6-פוספט לא נוצר והרצפטורים ב TGN לא יודעים לקשור את ההידרולאזות הליזוזומליות ולקחת אותם לליזוזום (כפי שתיארנו בכרטיס הקודם) , אלא שהם מופרשים לדם , כאמור בכבד זה לא קורה כי יש מסלול חליפי.
כמו כן , חלבוני ממברנת הליזוזם , שגם הם עוברים sorting ב TGN , אינם מושפעים. כי הם אינם תלויים ברצפטורי מנוז-6-פוספט .
134
יוביקוויטין:
שקף 203
יוביקוויטין הוא חלבון קטן , 76 חומצות אמינו , שנקשר קוולנטית לחלבונים אחרים ומסמן אותם למטרות שונות בתא.
היוביקוויטין נקשר קוולנטית **דרך הקצה הקרבוקסילי שלו** לשייר הצד של לזין על חלבון המטרה , בקשר איזופפטידי (פיגר 3-65).
יוביקוויטין יכול להיקשר לחלבוני המטרה שלו במספר דרכים , כל דרך היא בעלת משמעות אחרת מבחינת התא. האופן הכי נפוץ שבו יוביקוויטין נקשר לחלבוני המטרה הוא בצורת שרשרת פוליוביקוויטינית polyuniquitin. ברגע שמולקולת היוביקוויטין הראשונה נקשרה לשייר הצד שעל הליזין בחלבון המטרה , יוביקוויטין נוסף נקשר אליה בעמדה Lys48 , וכך כל יוביקוויטין שיתווסף לשרשרת , יקשר בעמדה Lys48 על היוביקוויטין שלפניו. שרשרת מסוג זה תוביל את חלבון המטרה **לחלק הפנימי**של הפרוטאוזם , שם הוא מפורק לפפטידים קטנים (פיגר 6-87).
צורות אחרות של שרשראות פוליוביקוויטיניות משמשות למטרות אחרות מלבד דגרדציה בפרוטאוזום. במקרים אחרים יתכן שרק יוביקוויטין אחד יקשר לחלבון המטרה , וגם לזה יש משמעות משל עצמה.
מבנים דומים יכולים להיווצר ע״י חבר נוסף במשפחת היוביקוויטינן , SUMO , שגם הוא נקשר לליזין על חחבון המטרה.
כל המודיפיקציות הללו הן הפיכות
135
פיגר 3-65
רואים את המבנה של חלבון היוביקוויטין ,
רואים שני ליזין חשובים במיוחד Lys48 ו- Lys63. בהיווצרות שרשרת פוליוביקוויטינת , כל יחידה עוקבת נקשרת על Lys48 של היחידה שקדמה לה , ליצירת סימן לדגרדציה , או שנקשרת על Lys63 ליצירת סימן בעל משמעות אחרת.
מובאים כמונכן 3 מצבים ייחודיים והמשמעויות שלהם של יוביטוקווינציה.
136
כיצד היוביקוויטין מתווסף לחלבון המטרה:
אמרנו שיוביקוויטין נקשר למטרה שלו דרך הקצה הקרבוקסילי שלו , כדי שזה יקרה , צריך תחילה שהקצה הקרבוקסילי ישופעל. ואכן , תהליך השפעול מתרחש ע״י אנזים שנקרא ubiquitin activating enzyme או בקיצור E1. E1 מבקע מולקולת אטפ , ומשתמש באנרגיה שלה כדי להצמיד מולקולת היוביקוויטין לעצמו בקשר קוולנטי תיואסתרי **עתיר אנרגיה.** כעת , E1 מעביר את מולקולת היוביקוויטין המשופעלת לאנזים אחר , ubiquitin conjugating enzyme , או E2. מהאנזים E2 יש מספר חברים , איזה מהם ספיציפית יקח את היובקוויטין המשופעל מ E1 נקבע לפי סוג ה E3 שצריך לקבל ממנו (מ E2) את היוביקוויטין . E3 הוא החוליה האחרונה בשרשרת , והוא זה שמחבר את היוביקוויטין לחלבון המטרה, E3 הוא יוביקוויטין ליגאז , יש ממנו מספר סוגים , וכל סוג יודע לקבל יוביקוויטים מ E2 ספיציפי.
ביונקים , יש כ 30 סוגים של E2 , **שדומים מבנית אך נבדלים תפקודית**, ומאות E3. כל סוג E3 יודע להתחבר עם סוגי E2 ספיציפיים
**פיגר 3-66:** מציג את המנגנון לסימון חלבונים לדגרדציה , מנגנון דומה מתרחש גם עם SUMO , אך על חלבוני מטרה שונים.
בשקף , E3 נקשר לחלבון המטרה על רצף מסויים שנקרא degron , זהו בגדר degredation signals , כך שנוצר קומפלקס E2-E3-חלבון מטרה , מה שמייעל את תהליך הסימון של חלבון המטרה. סוגי E3 שונים מזהים סוגי degradation signals שונים , ועל כן , סוגי חלבוני מטרה שונים.
השרשרת הפוליוביקוויטינית מזוהה ע״י רצפטור מיוחד בפרוטאוזום שנקשר אליה , מה שגורם לפירוק מהיר של החלבון.
137
פיגר 3-66:
1) **קישור בין יוביקוויטין ל E1**:
האנזים E1 מבקע מולקולת אטפ , האנרגיה משמשת לשפעול קצה C של היוביקוויטין. היוביקוויטין נקשר דרך הקצה C לשייר של צסטאין ב E1 בקשר תיואסטרי עתיר אנרגיה , וכך הוא משופעל.
2) אל E1 נקשר E2 באופן ספיציפי , היוביקוויטין המשופעל עובר מ E1 ל E2 , שגם אצלו הוא יושב על צסטאין. כעת E1 מתנתק מהקומפלקס , והיוביקוויטין נשאר אצל E2.
3) נוצר קומפלקס E2-E3 (שעליו יש יוביקוויטין משופעל). הקומפלקס הזה הינו ספיציפ - לא כל E2 יכול להיקשר לכל E3.
4) מגיע חלבון המטרה שעליו יש שני דברים חשובים: רצף **degrons** (רצף דגרדציה) שאותו מזהה ה E3 ונקשר אליו , וחומצת האמינו ליזין שעל שייר הצד שלה יקשר היוביקוויטין.
5) היוביקוויטין עובר מ **E2** לחלבון המטרה.
138
הפרוטאוזום הוא אינו אברון:
מדובר **בצורון** שכיח מאד בתאים , בעצם כ 1% מסך כל החלבונים בתא הם של הפרוטאוזום (חלבונים מבניים וקטליטים).
פיזית הוא נמצא בני מדורים: **מפוזר בכל רחבי הציטוזול , ובתוך הגרעין**. בתוך ה ER יש מערכת surveillance שמאתרת חלבונים פגומים , כאלה שלא התקפלו כמו שצריך , ושולחת אותם **ברטרוטרנסלוקציה** חזרה לציטוזל , שם הם מפורקים בפרוטאוזום.
**מבנה הפרוטאוזום**:
**לפרוטאוזום יש מבנה של צילינדר חלול במרכז עם שתי טבעות חלבוניות בכל אחד מקצותיו**. הצילינדר מהווה את יחידת הליבה **שנקראת 20s proteasome core** , היא בנויה **מ 4 תת יחידות** שיושבות אחת מעל השניה (פיגר 6-86). **חלק מהיחידות** (מתוך ה 4) הם יחידות קטליטיות **שפונות אל תוך הצילינדר** , כדי שלא יהרסו דברים בתוך התא.
שתי הטבעות בקצוות הן כאמור יחידות חלבוניות גדולות , נקראות ה **19S cap** , כל אחת בנויה מ **6 תת יחידות** , ודרכן חלבונים מושחלים אל תוך יחידת הליבה , שם הם עוברים דגרדציה.
פעולת הכנסת החלבון אל תוך הפרוטאוזום הינה **פעולה אקטיבית שדורשת אנרגיית אטפ** , במהלכה החלבון נפרם ונפתח (תוך כדי כניסתו דרך ה cap) , כך שכעת , **כשהו פתוח** , הפרוטאזות ב 20s יוכלו לדגרד אותו (פיגר 5-87).
החלבונים שבונים את הטבעת של ה cap , שייכים למשפחת חלבוני ה unfoldase , פה ספיציפית הם חלבוני AAA. חלק גדול מהם פועלים כהקסמרים (גם פה) , והם בעלי תכונות מכניות שדומות ל ATP-dependent DNA helicase , שפותח דנא המהלך השכפול / שעתוק (פיגר 6-88).
תכונה בולטת של הפרוטאוזום היא **הפרוססיביות הגבוהה שלו** , בניגוד ״לסתם״ פרוטאזה , שחותכת את החלבון שלה במקום אחד ואז מתנתקת ממנו , הפרוטאוזום לא משחרר את חלבון המטרה שלו עד שהוא לא מבקע את כולו לכדי חתיכות פפטידיות קטנות מאד , ועל כן הפרוטאוזום נתון **לרגולציה גבוהה**. התכונות הרגולטוריות של הפרוטאוזום הן נחלתן של שתיי יחידות ה 19s שמתפקדות כשערים סלקטיביים ומאפשרים רק עבור חלבונים שצריכים לעבור דגרדציה להיכנס אל תוך הליבה הפרוטאוליטית. הרגולציה נעשית בשני אופנים:
- ביחידות ה 19S ישנו **רצפטור** שמזהה ונקשר לשרשרת הפוליוביקוויטינית שמסמנת חלבונים לדגרדציה (Lys48).
- נוכחות מקטע לא מקופל (הידרופובי?) בגוף החלבון שגם כן מזוהה ונקשר ע״י יחידות ה 19S
**רק קיום שני הסממנים ביחד יביא לדגרדציה של החלבון**.
ברגע ש 19s מזהה את השרשרת הפוליוביקוויטינית , היא תופסת החלבון המסומן , ובכל מקרה מורידה ממנו את השרשרת (פעילות אנזימטית של דה-יוביקוויטינציה?) , נוכחות המקטע הלא מקופל קובעת האם החלבון יכנס ליחידה הפרוטאוליטית ב 20S , או שמה ישוחרר יזרה לתמיסה במידה והמקטע לא קיים.
בתא קיימת תחרות בין הפרוטאוזום לשפרונים , אם החלבון מתקפל מהר הוא חומק מדגרדציה (לפחות בהתחלה עד שהוא צובר פגמים במהלך חייו ואז מפורק) , חלבונים שדורשים מספר סבבים של קיפול וסיוע ע״י שפרונים ייתכן בסבירות גבוהה יותר שהם יפורקו מהר בפרוטאוזום. לעיתים השפרונים עצמם הם אלה שמוסרים את החלבונים הלא מקופלים למערכת הפרוטאוליטית בעצמם.
ההערכה היא שבין 1% ל 5% מסך כל החלבונים **החדשים שמיוצרים בתא** לא מצליחים להתקפל נכון , ועל כן מושמדים בפרוטאוזום.
139
פיגר 6-86
מבנה הפרוטאוזום:
יחידת 19S היא זו שפותחת ופורמת את החלבון לכדי שרשרת פוליפפטידית ישרה , כנגד ביקוע אטפ.
החלבון לא מפורק לחומצות אמינו , אל לשרשראות פפטידיות קטנות.
140
פיגר 6-87
הפרוססיביות הגבוהה של הפרוטאוזום
רואים את מבנה הפרוטאוזום , יחידות 19s מהוות את ה unfoldase (AAA) שפותח את החלבון , ביחידת הליבה 20S יש את האתר הפרוטאוליטי הפעיל.
יחידות ה 19S cap מזהות את השרשרת הפוליוביקוויטינית שעל החלבון , **מרבית** החלבונים הללו גם יכילו מקטע לא מקופל. בזמן שהחלבון מושחל דרך ה cap , יחידות היוביקוויטין מורדות ממנו , ע״י יחידהות 19s , וממוחזרות לצורך שימוש חוזר.
בנוסף , בזמן החדרתו דרך שני ה caps , החלבון עובר פרימה ופתיחה. פעולת הפתיחה של החלבון והכנסתו אך תוך הליבה **מבוצעת ע״י יחידת ATPase שיש בטבעת של ה 19S** שמבקע אטפ ומשתמשת באנרגיה שלו לשם כך.
מוצג המבנה של טבעות ה 19s:
- רצפטור ליוביקוויטין שמזהה את החלבונים הפגומים , נקשר ליוביקוויטין ומחזיק את החלבון במקום (כדי שלא יברח) בזמן שהוא מוכנס אל תוך הליבה.
- uniquitin hydrolase שמבקע יוביקוויטינים מהשרשרת
141
פיגר 6-88
היחידה ההקסמרית unfoldase
יחידות 19S cap של הפרוטאוזום הן מבנה חלבוני **הקסאמרי** , טבעתי , שנקרא גם unfoldase ring. כל יחידה מהין השש שייכת למשפחת חלבוני AAA
הטבעת קושרת אופ ואת חלבון המטרה , ביקוע האטפ גורם לשינוי מבני שמהדק את הטבעת סביב החלבון , פה יתכנו שני דברים:
- או שהחלבון יפתח מעט ויכנס אל תוך הפרוטאוזום
- או שהחלבון ישאר מקופל ויחזור מעט אחורנית
לעיתים נדרשים מאות סבבים של קשירת וביקוע אטפ כדי שחלבון נתון יוכנס לפרוטאוזום , ולעיתים כךגם לאחר הסבהים האלה החלבון עדיין לא נכנס , הוא פשוט עובר דהיוביקוויטינציה ומשתחרר.
מוצג השינוי בקונפורמציה שהחלבון עובר הודות לביקוע אטפ , ברגע שהחלבון נפתח **הוא נכנס יחסית מהר לתוך הליבה**.
142
בקרה על חלבונים דרך הריסה שלהם:
דינו של כל חלבון בתא , בסופו של דבר , להיות מושמד בפרוטאוזום לאחר שמצטברים עליו פגמים עם הזמן.
מלבד תפקיד חשוב זה , לפרוטאוזום תפקיד נוסף , הוא שולט בכמות של חלבונים מסויימים **ומבטיח שלחלבונים אלו יהיה זמן מחצית חיים קצר.** ריכוזם של החלבונים המדוברים צריך להשתנות באופ מיידי כתלות בשינויים במצב התא. אלו הם חלבונים תקינים לכל דבר ועניין , הדגרדציה שלהם אינה נובעת מפגמים שהם צברו , אלה מתוך צורך להתאים את התכולה החלבונית של התא לצרכים המטבוליים / התפתחותיים שלו.
**לדוגמה:** ציקלינים מיטוטיים , ציקלינים הם משפחה של חלבונים רגולטוריים שחברים במשפחה נמצאים בתא לאורך כל מחזור חייו , עד שהתא חייב להיפטר מהם בסוף המיטוזה , והם עוברים דגרדציה מהירה.
חלבונים רבים כאלה (שמפורקים בזמנים מסויימים לפי צורכי התא) **מכילים במבנה שלהם מקטעים קצרים ולא מקופלים** , ההרס שלהם מתבצע ע״י סימונם בשרשרת יוביקוויטין , כשהסימון עצמו מבוצע במספר מנגנונים:
1) הפעלה של יוביקוויטין ליגאז (E3) ע״י זרחונו , שאז הוא מסמן את חלבון המטרה.
2) הפעלת ה E3 ע״י **שינוי אלוסטרי** , פה היוביקוויטין ליגאז נקשר למולקולה ספיציפית (ליגנד) , שמשרה את השינוי , ומפעילה אותו
3) קישור לתת יחידה שמקנה ליוביקוויטין ליגאז את הפעילות שלו
**דוגמה:** הקומפלקס APC/C , זהו anaphase promoting complex , והוא יוביקוויטין ליגאז שמורכב מהמון **תת יחידות**. **תפקיד הקומפלקס להכניס את התא לאנאפאזה** , והוא עושה זאת דרך סימון ציקלינים ביוביקוויטין ושליחתם לדגרדציה. הקומפלקס מופעל ע״י תת יחידה שנקשרת אליו בתזמון הנכון במהלך מחזור התא , ובכך הוא מופעל , מזהה רצפים ספיציפי של ח״א על הציקלין ועוד כל מיני חלבוני בקרה אחרים , ומסמן את אותם לדגרדציה בפרוטאוזום בסוף שלב המטאפאזה.
4) דרך נוספת לסמן חלבונים לפירוק היא ע״י **יצירת אתרי יוביקוויטינציה על גביהם** בתגובה לסיגנל חוץ תאי או תוך תאי. אחת השיטות לעשות זאת היא דרך זרחון על רצף חומצות אמינו ספיציפי בחלבון המטרה , מה שיוצר ״אתר זיהוי עבור יוביקוויטין ליגאז״
5) מנגנון אחר הוא כאשר על החלבון קיים מראש רצף זיהוי ליוביקוויטין ליגאז , אולם הרצף מוחבא ע״י תת יחידה כלשהי , הורדת היחידה הזאת תחשוף אותו בפני יוביקוויטין ליגאז לסימון.
6) ולבסוף , שבירה של **קשר פפטידי אחד** בחלבון המטרה , יוצר **קצה אמיני** בפפטיד שמזוהה ע״י E3 כאתר לא תקין , הקצה צריך להכיל רצף ח״א ספיציפי , שיזוהה ע״י E3 , ולא כל קצה כזה עובר סימון. בפועל כ 70% מהחלבונים הציטוזוליים עוברים אציטילציה בקצה האמיני שלהם , האציטיל הזה מזוהה ע״י E3 , שמסמן את החלבונים ביוביקוויטין ושולח אותם לדגרדציה. **כך שמרבית החלבונים האנושיים כבר מראש נושאים על גביהם את הסיגנל לדגרדציה של עצמם**. הסברה היא שהחלבון בתחילת חייו מקופל באופן כזה שהאציטיל בקצה האמיני מוסתר , כשהחלבון מזדקן (או אם הוא לא מתקפל נכון) הקצה נחשף והוא מזוהה כחלבון שצריך להרוס.
143
פיגר 6-89
השיטות השונות להשריית הרס על חלבונים באפן ספיציפי:
קיימות שתי דרכים עיקריות להשריית הרס ספיציפי של חלבונים:
1) הפעלה של מוחקולת E3 ספיציפית , יוצר יוביקוויטין ליגאז חדש , שמזהה את חלבוני המטרה. היורריוטים ישנם מספר חלבוני E3 , כל אחד מזהה רצף אחר.
2) יצירה דל אתר סימון ביוביקוויטין עבור היוביקוויטין ליגאז , בחלבון המטרה עצמו.
144
דוגמה ליוביקוויטין ליגאז נוסף:
SCF
שקף 217
מדובר פה גם כן בתהליך יוביקוויטינציה ספיציפי שמכוון לחלבונים ספיציפיים.
לחלבון SCF ubiquitin ligase (שנוא סוג של E3) יש מבנה מעניין , יש לו מבנה של האות c , והוא בנוי מ 5 תת יחידות , במרכזו יש יחידת cullin , **היא תת היחידה הכי גדולה** , ומהווה את הפיגום שעליו הכל נבנה. בקצה אחד של ה c יש את חלבון ה E2 שהוא ubiquitine conjugating enzyme , ובקצה השני יש את ה F-box.
בין שני החלבונים שבקצוות יש מרווח של כ 5 ננומטר , כשה SCF משופעל , קצה ה F-box נקשר לאזור ספיציפי בחלבון המטרה , וממקם אותו בתוך המרווח , בצורה ששירי הצד של חלק מהליזינים בחלבון באים במגע עם E2 , שבתורו כעת מוסיף מספר יחידות של יוביקוויטין לחלבון.
כאמור זהו מנגנון ספיציפי עבור חלבונים שעולה צורך לדגרד אותם במהירות בתגובה לסיגנל כלשהו.
התזמון לפיו ה SCF מסמן את החלבון שלו לדגרדציה תלוי בדפוס זרחון שנוצר על חלבון המטרה ומסוהה ע״י ה F- box.
בתא יש המון סוגים של יחידות Fbox , כל סוג יודע לזהות חלבון מטרה אחר , אי לכך , יחידת ה Fbox אינה קבועה ומשתנה. ישנו חלבון נוסף , SCF -like ubiquitin ligase שנושא עימו יחידות שונות של Fbox , הוא מופעל גם כן בזמן הנכון לפי הסיגנלים התאיים ומביא ל SCF עצמו את יחידת ה fbox הרלוונטית. בתא אנודי קיימים כ 70 גנים שמקודדים לחלבוני ה Fbox השונים.
גם ליחידת cullin יש המון גנים שמקודדים לסוגיה השונים , עיקרון זה , שבו מגן אחד מתפתחים גנים נוספים מעט שונים הוא פתרון יעיל וטוב , במקום ליצור קומפלקס ידש לכל סוג פעולה , ניתן ליצור את אותו קומפלקס , ורק לשנות תת יחידות.
145
פיגר 3-67
מבנה של יוביקוויטין ליגאז מסוג SCF:
החלבון בנוי מ 5 תת יחידות:
- יחידת E2
- 4 יחידות שביחד מהוות את E3
היחידות של ה E3 הן:
- cullin
- Fbox
- adaptor protein 1
- adaptor protein 2
קולין הוא הפיגום, אדפטור1 קושר את E2 , אדפטור 2 קושר את Fbox , Fbox קושר את חלבון המטרה.
לשים לב בשקף מציגים סוגים שונים של היחידות השונות.
באיור (C) מוצג מצב של **פוליוביקוויטינציה על אותו ליזין** בחלבון המטרה , מצב זה מסמל דגרדציה מהירה של חלבון המטרה.
ב (D) מוצגת השוואה בין יוביקוויטין ליגאז מסוג SCF ליוביקוויטין ליגאז מסוג APC/C. שני הקומפלקסים מדמים מעט אחד את השני , האחרון יותר גדול ומורכב מ 15 תת יחידות , אך גם הוא מכיל יחידת cullin
146
אנדוציטוזה ואקסוציטוזה:
פיגר 13-1
**באקסוציטוזה**: וזיקולה מתוך התא מתאחה עם ממברנת התא , התוכן שלה נשפך החוצה , והממברנה שלה הופכת להיות חלק ממברנת התא.
**באנדוציטוזה**: ממברנת התא עוברת אינבגינציה , חתיכה ממנה נפרדת והופכת להיות וזיקולת טרנספורט. התוכן של הוזיקולה הוא מהנוזל החוץ תאי.
בשני המקרים גם באנדו וגם בארסו , התווך של הוזיקולי הינו קוויולנט טופולוגי של חוץ התא.
147
אנדוציטוזה: טרנספורט אל תוך התא מממברנת הפלסמה:
באנדוציטוזה התא מכניס אל תוכו חומרים מהסביבה החיצונית שלו כגון נוזל חוץ תאי ומרכיביו , מאקרומולקולות , נוטריינטים וירוסים וחיידקים (מאקרופאגים ונוטרופילים). הדבר מבוצע דרך וזיקולה שנוצרת בממברנת התא , שעושה pinch ואז נכנסת לציטוזול , ועל כן היא מכילה מרכיבי ממברנה פלסמטית (חלבונים / שומנים).
כמו כן , התא יכול לשלוט בהרכב הממברנה שלו (קולטנים למשל) דרך אנדוציטוזה , ולהתאים אותה לסביבה החיצונית.
התהליך מתרחש בשלבים , תחילה יש **אינבגינציה** של אזור מסויים בממברנת התא , האזור הזה לאחר מכן נצבט פנימה ליצירת וזיקולה אינדוציטית.
במרבית התאים היוקריוטים מתרחשת פעולת אינדוציטוזה באופן מתמשך , פעולה שנקראת **פינוציטוזה** pinocytosis , וזה מדמה תהליך ״שתיה״ של התא. במקביל , בתאים מסויימים , יש פעולה אינדוציטית יותר ספיציפית , שבה יש הכנסה של חומרים מסויימים לפי צורך , נקרא פאגוציטוזה phagocytosis , תהליך שמדמה ״אכילה״ של תאים.
יש כמה מנגנונים אנדוציטים , הם נבדלים זה מזה ב macheniry שמבצעת את התהליך וברגולציה על התהליך.
רוב הוזיקולות האנדוציטיות שמנצות מהממברנה הפלסמטית יגיעו תחילה למדור שנקרא early endosome , ה cargo פה עובר מיון , חלקו יוחזר חזרה לממברנה ישירות , חלקו יעבור דרך recycling endosome , וחלקו האחר ישאר בתוך ה early endosome בזמן שהוא מבשיל והופך להיות late endosome בתהליך שנקרא endosome maturation (פיגר 13-50).
ה recycling endosome אינו חייב לשלוח חזרה לממברנה את מה שהוא קיבל מה early ישירות , אלא יתכן שהוא יחזיק אותם אצלו קצת , ואז לפי הצורך ימחזר אותם לממברנה.
**מטורציה של האנדוזום:** שני דברים עיקריים מתרחשים לאנדוזום במהלך הבשלתו:
- הרכב החלבונים של ממברנת האנדוזום משתנה. חלקים מהמנברנה (ועמם ביחד החלבונים שיש שם) עושים אינבגינציה אל תוך התווך של האנדוזום , והופכים להיות וזיקולות אנדוזומליות אינטראלומינליות intralumenal vesicles.
- האנדוזום נודד מהפריפריה של התא (סמוך לממברנה) , לאזור הגרעין.
**במהלך הבשלתו , האנדוזום מפסיק לשלוח וזיקולות חזרה לממברנה, הן במישרין והן בעקיפין דרך recycling endosome.** (כלומר רק early endosome שולח לממברנה) , אלא שמספר late endosomes מתאחים יחדיו , ועם הליזוזום ליצירת אנדוליזוזום , שבו תכולת האנדוזומים מעוכלת.
בכל שלב משלבי המטורציה שלו , החל מה early endosome וכלה באנדוליזוזום , האנדוזום נמצא בתקשורת עם ה TGN דרך וזיקולות **דו כיווניות** , מה TGN האנדוזום מקבל אנזימים , ומה אנדוזום ה TGN מקבל חזרה חומרים שלו כמו הרצפטור למנוז-6-פוספט.
148
פיגר 13-50:
מטורציה של האנדוזום: מממברנת הפלסמה עד הליזוזם.
ה early endosome נמצא סמוך לממברנת התא , שם הוא מקבל ממנה וזיקולות. ה early endosome הוא סוג של אתר מיון מוקדם שבו החומרים שהגיעו אליו בוזיקולה או שמוחזרים חזרה לממברנה באופן ישיר , או דרך recycling endosome , או שנשארות בתוכו בזמן שהוא מבשיל. הוזיקולות שמוחזרות מהאנדוזום מנצות ממנו מאזורים **טובולריים**.
ה recycling rndosome יכול או להחזיר את החלבונים שהוא קיבל מה early לממברנה ישר , או שהוא יכול לשמור אותם אצלו עד שיהיה בהם צורך.
בתהליך ההבשלה , ה early endosome מאבד את החלקים הטובולריים שלו , מה שמסביר למה הוא מאבד את יכולתו להחזיר וזיקולות לממברנה.
חלבוני ממברנה שמיועדים לדגרדציה (למשל רצפטור של EGF) יכנסו בוזיקולות אל הלומן של האנדוזום , בהמשך כשהאנדוזום יתאחה עם הליזוזם , הם יעברו עיכול ביחד עם הממברנה שעוטפת אותם.
במהלך הבשלת האנדוזום , הוא הופך לצורון ביניים שנקרא multivesiculsar body ואז ל late endosome , בזמן הזה הוא נע על גבי סיבי מיקרוטובול הרחק מהפריפריה אל עבר מרכז התא סמוך לגרעין.
ה late endosome שסיים להבשיל כבר לא שולח וזיקולות לממברנה , מספר late endosomes מתאחים יחדיו , ועם ליזוזומים ואנדוליזוזומים אחרים , וכך התוכן שלהם מעוכל.
בכל שלב יש תקשורת בין האירלי אנדוזום/ מולטיויזיקולאר בודי/ ולייט אינדוזום עם ה TGN.
149
וזיקולות פינוציטיות:
Pinocytic vesicles
תהליך אנדוציטוזה מסוג pinocytosis מתרחש כל הסמן בתא , ללא הרף וללא הפסקה , בקצב גבוה מאד.
מאקרופאג׳ למשל מכניס אלתוך עצמו בכל שעה כמות נוזלים מהסביבה השווה ל 25% מהנפח שלו , זאת אומרת שבכל דקה הוא מכניס 3% מממברנת הפלסמה שלו , **ו 100% ממנה בכשעה**!.
פיברוסלסטים עושים זאת הקצב מעט יותר נמוך , 1% לדקה.
**ידוע לנו שנפח ממברנת התא אינו משתנה**, משמע , שקצב האנדוציטוזה חייב להיות שווה לקצב האקסוציטוזה , כך שהם מקזזים אחד את השני , ונפח הממברנה נשמר , או מה שנקרא endocytic-exocytic cycle.
החלק האנדוציטי של המעגל מערב היווצרות וזיקולות בתיווך החלבון קלתרין באתרים מסויימים בממברנת התא. אזורי היווצרות הקלתרין מהווים כ 2% מסך כל השטח של ממברנת הפלסמה.
אורך החים של clathrin coated pit הוא קצר מאד , **כדקה** מרגע תחילת ההיווצרות שלה בממברנה ועד ההנצה אל תוך הציטופלסמה. בתא פיברובלסט , כ 2500 וסיקולות עטופות קלתרין נוצרות בדקה , **ותוך שניות** בודדות מרגע היווצרותה , הוזיקולה שלה מעליה את מעטפת הקלתרין ומתאחה עם ה early endosome.
150
פיגר 13-51
מוצגת וזיקולה עטופת קלתרין בביצית תרנגולת , היא מעט יותר גדולה מוזיקולות בתאים אחרים כי צריכה לייצר את החלמון , בשל כל היא מכניסה אל תוכה כמויות גדולות מאד של ליפופרוטאינים.
151
לא כל הוזיקולות מממברנת התא עטופות בקלתרין:
יש כמה סוגים של פינוציטוזה שאינה מתווכת קלתרין:
1) קאוויאולה caveolae: סוג זה של פינוציטוזה **נפוץ מאד בתאי אנדותל של כלי דם** , אך הוא קיים במגוון רחב של סוגי תאים חולייתניים.
המבנה של הקאויאולה יוצר מין lipid raft בממברנת הפלסמה של התאים שהוא נמצא בהם , ומעניק להם חוזק מכני , ויכולת להימתח.
החלבון המבני הכי נפוץ בוזיקולות של קאויאולה הוא החלבון caveolin , זהו חלבון **אינטגרלי** , שיושב בממברנה **מהצד הציטוזולי** (אך לא חומה אותה). הוא קשור , מהצד הציטוזולי , לקומפלקס חלבוני גדול שנקרא cavin , תפקיד ה cavin הוא לייצב את ה curvature של הממברנה.
קאלויאולות כאמור מייצרות lipid rafts , ועל כן הן עשירות מאד בכולסטרול , גליקוספינגוליפידים ,וחלבונים מעוגני GPI.
קאוויאולות הן מבנים סטטיים , אינם יוצרים COP1 ו COP2 , והם מהווים reservoirs לממברנה , שמאפשר לה להימתח מבלי להיקרע , דבר שהוא חשוב בתאי אנדותל בעורקים שצריכים לעמוד בלחצי הדם , ברגע שלחץ הדם עולה על הדפנות חלבוני ה cavin מתפרקים ומאפשרים לממברנה להימתח.
2) **מאקרופינוציטוזה:** זהו מנגנון שבעיקר מהותו דגרטיבי , במנגנון זה ממברנת התא מתארכת , מאגפת את **הנוזל החוץ תאי** ונסגרת עליו ליצירת מאקרופינוזום macropinosome שאז מוכנס לציטופלסמה ומגיע לליזוזום , שם תכולתו מעוכלת. זהו מנגנון **לא סלקטיבי להכנסת נוזלים** מהחוץ אל תוך התא. בניגוד לפינוציטוזה שמתרחשת באופן קבוע ומתמשך , מאקרופינוציטוזה לא , היא מתרחשת כאשר יש איזשהו **סיגנל מחוץ לתא שנקשר לקולטן** על פני הממברנה , ומשפעל את המנגנון. המאקרופינוזום שנוצר , תחילה מעלה את רמת החומציות בתוכו כדי שתתאים לליזוזום (משאבות פרוטונים?) ואז מתאחה עם ה early endosome או עם האנדוליזוזם , **מבלי שיהיה recycling לממברנה.** מנגנון מאקרופינוציטוזה משופעל ע״י האונקוגן Ras , כאשר מופעל מנגנון מאקרופינוציטוזה ה uptake של נוזלים מסביבת התא אל תוכו עולה פי 10 , מנגנון זה נפוץ מאד בתאים סרטניים , כי מתחלקים ללא הפסקה , וכך הם יכולים לעמוד בדרישות המטבוליות הגבוהות של החלוקה הבלתי פוסקת.
3) **פאגוציטוזה**: הממברנה מתארכת ומקיפה חלקיק כלשהו במדיום ונסגרת עליו ליצירת פאגוזום.
שני התהליכים 2 + 3 דורשים פולימיריזציה של אקטין מתחת לממברנת התא כדי שהשלוחות וההתבלטויותמיוכלו להיווצר (פיגר 13-68).
שני הצורונים , המאקרופינוזום והפאגוזום מתאחים בהמשך עם הליזוזום , שם תכולתם מפורקת.
152
פיגר 13-68
מאקרופינוציטוזה:
ליגנד כלשהו מגיע מה ECF ונקשר לרצפטור על פני ממברנת התא. זה מטגרר ארגון מחדש של סיבי האקטין כדי שממברנת התא תוכל ליצור בליטות שיאגפו את הנוזל החוץ תאי , הבליטות עצמן נקראות ruffles.
המנגנון עאמור אינו ספיציפי , המאקרופינוזום מגיע בסוף לליזוזום.
153
פיגר 13-55
+
עמ׳ 119 + 120 מצ״מ
154
תאים משתמשים באנדוציטוזה מתווכת רצפטור להכנסת מולקולות אקסטרא צלולריות נבחרות:
הרצפטורים שמשתתפים בתהליך הינם טרנסממברנליים , הם מקובצים יחדיו באזור מסויים של הממברנה שמבפנים יש עליו קלתרין. בחלק האקסטראצלולרי שלהם נקשר הליגנד , שהוא בד״כ **מאקרומולקולה** ולא חומר קטן.
הואיל והתהליך הינו מתווך רצפטור , התא יכול דרך כך להגדיל את ה uptake של חומר **ספיציפי** פי 100 , מאם היה נגיד מסתמך רק על פינוציטוזה.
**נקח את הדוגמה של כולסטרול:**
תאים אנימליים צריכים לקלוט את **מרבית** הכולסטרול שהם צריכים מהדם (למרות שיש תאים שמסוגלים ליצר אותו בעצמם) באנדוציטוזה מתווכת קולטן. הכולסטרול משמש בין היתר את התאים לבניית הממברנה שלהם. אם תהליך קליטת הכולסטרול היה נחסם , הוא יצטבר בדם ויגרום לטרשת.
רוב הכולסטרול נישא בדם בצורת **כולסטרול אסתר** , בתוך גופפים של LDL , שמורכבים ממעטפת של חלבוני אפוליפופרוטאין B ושומנים , ובליבה שלהם נושאים טריגליצרול , כולסטרול אסתר , וכולסטרול חופשי (פיגר 13-53).
ברגע שהתא צריך לבנות ממברנה , הוא מסנתז ב ER רצפטורים ל LDL , ושולח אותם ללממברנה עצמה. בתוך הממברנה , הרצפטורים נעים לטרלית בדיפוזיה , בחלק הציטוזולוי שלהם (מדובר ברצפטורים טרנסממברנליים) ישנו רצף ח״א **שמהווה סיגנל לאנדוציטוזה** , הרצף נקשר לחלבון אדפטור שנקרא AP2 , האדפטור נקשר ל PI(4,5)P2 בממברנה , מה שגורם לקיבוע הקונפורמציה שלו , וגורם לו לגייס לאזור חלבוני קלתרין , וכך מתרחשת אנדוציטוזה של LDL.
הוזיקולה עטופת הקלתרין שמכילה את ה LDL ואת הרצפטור מנצה מהממברנה , תחילה שלה מעליה את הקלתרין , ואז מתאחה עם ה early endosome , ושופכת אל תוכו את תכולתה. באנדוזום יש רמת חומציות גבוהה (pH נמוך) , וזה גורם לניתוק בין ה LDL לרצפטור שלו. כעת ה LDL נשלח לליזוזום והכולסטרול אסתר הופך לכולסטרול חופשי שזמין לתא.
פגם ביצירת הרצפטורים ל LDL פוגע ב intake שלהם אל תוך התאים ולמחלות קורונריות , ניתן לטפל בזה בעזרת סטטינים. יתכן שהפרט לא ייצר את הרצפטור בכלל , ויתכן שהוא מייצר אותו אך החלק הפנימי שלו אינו קושר AP2 , במצב כזה ה LDL קושר את הרצפטור אך לא נוצרות וזיקולות.
**ישנם כ 25 סוגי רצפטורים שמשתתפים במנגנוני אנדוציטוזה מתווכת קולטן , בכולם יש היווצרות של וזיקולות עטופות קלתרין , ובכולם יש סיגנל בחלק הפלסמטי שלהם שדרך קישור לחלבון אדפטור , גורם להם להיכנס לתוך האתר הנכון בממברנה שבו תיווצר הוזיקולה**. הרצפטור ל LDL , ועוד סוגים אחרים , יודע להיכנס לאתרים האלה , גם אם לא קשר את הליגנד שלו עדיין , אחרים נכנסים לאתר רק לאחר קישור הליגנד הודות לשינוי בקונפורמציה שמאפשר זאת.
**מרבית חלבוני הממברנה אינם יכולים להיכנס לאתרי היווצרות הוזיקולה היכן שיש קלתרין** , מה שהופך את המנגנון לעוד יותר סלקטיבי עבור הליגנד הרצוי והרצפטור שלו.
- יתכן מספר סוגי רצפטורים באותו pit
- ב pit נתון ניתן למצוא עד כ 100 רצפטורים מסוגים שונים
155
פיגר 13-53
LDL
מבנה ה LDL
מעטפת אמפילית שמורכבת מהחלבון אפוליפופרוטאין B + שכבה בודדת של פוספוליפידים וכולסטרול חופשי.
ליבה הידרופובית שמכילה כולסטרול אסתר (הכי הרבה) , כולסטרול חופשי וטרינגליצרידים.
156
אנדוציטוזה מתווכת קולטן:
חלבונים מסויימים ממוחזרים מהאנדוזום חזרה לממברנה:
ה early endosome הינו תחנת ה sorting של המסלול האנדוציטי , בדיוק כמו שה CGN וה TGN הם תחנות ה sorting של המסלול הסקרטורי.
כאשר וזיקולה מהממברנה מגיעה לליזוזום , הסביבה החומצית משהו של ה early endosome גורמת לליגנד להשתחרר מנהרצפטור שלו (לרוב , יש מקרים שהם נותרים קשורים). כאשר הליגנד מתנתק מהרצפטור , בסופו של דבר הוא יגיע לליזוזום , פה הוא יעבור עיכול (לאבני הבניין שלו) ומחזור (לשימוש חוזר ע״י התא) , או לחילופין , כמו במקרה של הכולסטרול , הוא לא מעוכל , אלא מנוצל ישר ע״י התא.
ב early endosome הרצפטור וה LDL מתנתקים זה מזה (בגלל החומציות) , ה LDL ממשיך לליזוזום והרצפטור ממוחזר לממברנת התא (פיגר 13-54). המחזור של הרצפטור לממברנה מתרחש דרך וזיקולות שמנצות מאתרים **טובולריים** ב early endosome (פיגר 13-55). המאפיין של מבנים טובולריים , ובכללותן הוזיקולות הללו הוא ששטח הפנים שלהם גדול יותר מהמפח הכלוא בתוכם , ולכן הם מכילות יותר חלבונים ממברנליים מאשר חלבונים מסיסים.
**טרנספרין:** טרנספרין הינו רצפטור מסיס שנושא ברזל בדם , היא נקדר לרצפטור לטרנספרין על ממברנת התא , ונכנס באנדוציטוזה ל early endosome , החומציות שבאברון גורמת לטרנספרין לנתק את הברזל , אולם הוא עצמו לא מצנתק מהרצפטור שלו , בממב הזה שהוא אינו קושר ברזך , טרנספרין נקרא אפוטרנספרין. לאחר ניתוק הברזל , אפוטרנספרין והרצפטור לטרנספרין נכנסים לחלקים הטובולריים של ה early endosome , וממוחזרים יחדיו לממברנה הפלסמטית. ה pH הניטרלי של ה ECF גורם להם להתנתק , וכעת אפוטרנספרין זמין לקשור ברזל נוסף בדם.
כלומר הטרנספרין (הליגנד) לא מגיע לליזוזום , במקרה של LDL (שהוא הליגנד) הוא כן מגיע לליזוזום , ולכן לא כל ליגנד באנדוציטוזה מתווכת קולטן חייב לעבור בליזוזום.
157
ה recycling endosome מבקר את הרכב ממברנת הפלסמה:
באנדוציטוזה מתווכת קולטן , הליגנד , לרוב , הולך לליזוזום (טרנספרין יוצא דופן) , והרצפטור ממוחזר לממברנה הפלסמטית , **לאותו דומיין מקורי שממנו הוא הגיע**.
אולם לכל מקרה יש יוצא מן הכלל , חלק מהרצפטורים לא חוזרים לאותו דומיין ממברנלי ממנו הם הנצו עם הוזיקולה , אלא מגיעים לדומיינים אחרים בממברנה , במנגנון **טרנסציטוזיס** , חלק אחר מהרצפטורים נעים בעצמם לליזוזום ומעוכלים בו.
**במסלול הטרנסציטי הנ״ל , הרצפטור אינו נע לממברנה בצד השני ישירות מה early endosome , אלא דרך תחנת ביניים , ה recycling endosome**.
מכאן , אנחנו מבינים **שהרצפטור** באנדוציטוזה מתווכת מכיל 3 אלמנטים חשובים:
- אתר קישור לליגנד אליו הוא נקשר ,
- אתר קישור לחלבון אדפטור (למשל AP2) שמכוון אותו ל coated pit בממברנה
- רצף סיגנל שקובע את המסלול בוא הוא ימשיך לאחר הגעתו לאנדוזום (ימוחזר לממברנה מהחלקים הטובולריים של ה early , יגיע ל recycling במסלול טרנסציטי , או ילך לליזוזום) .
התא יכול לשלוט בקצב הטרנסציטוזה של חומרים מסויימים ע״י רגולציה על החזרת הקולטנים מה recycling endosome לממברנה (בפיגר 13-50 אמרנו שה recycling endozome לא חייב לשלוח מיידית את ה cargo שלו חזרה לממברנה, וזה מסתדר כאן).
**דוגמה** לרגולציה כזו קיימת בתאי שריר ושומן , תאים אלה מכילים מאגרים גדולים של recycling endosome שמכיל טרנספורטרים לגלוקוז. בעליית האנסולין בדם (עקב עליה בגלוקוז) , התאים חשים זאת (כנראה ע״י רצפטורים) , מה שגורם להם לשלוח יותר ויותר טרנספורטרים לגלוקוז מה recycling endome לממברנה , ובכך להגביר את ה uptake של גלוקוז מהדם (פיגר 13-57).
באופן דומה , תאי כליה מווסתים את כמות האקווהפורנים ומשאבות V type ATPase כדי לבקר את כמות המים שנספגים בהם , ואת כמות החומצה שהם מפרישים.
158
רצפטורים במסלולי סיגנל על ממברנת התא עוברים down regulation ע״י דגרדציה בליזוזום:
אמרנו בכרטיס הקודם שיש 3 גורלות לרצפטורים שמגיעים ל early endosome מהממברנה במסלולי אנדוציטוזה מתווכת קולטן (פיגר 13-56):
- להתקבץ בחלקים הטובולריים של ה early endosome ומשם לחזור לאותו דומיין בממברנה
- להגיע ל recycling endosome , ומשם להגיע לדומיין אחר בממברנה
- להישאר ב early אנדוזום בזמן הבשלתו ולהגיע לליזוזום
המון רצפטורים של מסלולי סיגנל , כמו למשל רצפטורים לאופיואידים , ורצפטורים לפקטור הגדילה EGF פועלים בסמלול השלישי , כלומר נשארים באנדוזום , ולבסוף מגיעים לליזוזם.
בשונה מהרצפטור ל LDL שיכול להיכנס ל clathrin coated pit בממברנה עוד בטרם קשר את הליגנד שלו , הרצפטור ל EGF נכנס ל pit רק אחרי שהוא קשר את הליגנד (EGF). לאחר ההגעה לאנדוזום (אני משער שהם מתנתקים זה מזה בגלל החומציות) , שניהם , ה EGF והרצפטור , נשארים בתוכו בזמן הבשלתו , ועל כן מעוכלים בליזוזום.
מנגנון פעולת ה EGF הינו דוגמה ל receptor down regulation , כי קישורו לרצפטור שלו בממברנה , מלבד הוצאה לפועל של מסלול הסיגנל הרלוונטי , גורם לדגרדציה של הרצפטור בליזוזום כאמור , כך קישורו מביא לפחות רצפטורים בממברנה , ולרגישות מופחתת בתא למולקולות EGF נוספות. מנגנון זה הגיוני , התא רוצה לבקר את השפעת פקטורי הגדילה שמא יהיה שגשוג תאים.
מנגנון receptor down regulation מבוקר מאד. **מיד אחרי שהליגנד נקשר לרצפטור בממברנה , הרצפטור עובר מודיפיקציה קוולנטית** מסוג **יוביטיקווינציה** על הצד הציטוזולוי שלו , כעת חלבונים מסויימים בתא , מזהים את הרצפטור עם היוביקוויטין ומכוונים אותו ל clathrin coated pit בממברנה לקראת האנדוציטוזה. לציין , בשונה משרשרת ה polyubiquitin הארוכה שמסמנת חלבונים לדגרדציה בפרוטאוזום , פה מדובר **או ביחידת יוביקוויטין אחת ויחידה שנקשרת לרצפטור , או בכמה יחידות מועטות** , ולכן קוראים למודיפקציות אלו monoubiquitylation ו multiubiquitylation בהתאמה. התג היוביקוויטיני שעל הרצפטור מסמן אותו ככזה שאינו צריך לעבור מחזור לממברנה , אלא שעליו לעבור לליזוזום. בעצם , **הרצפטור המסומן ביוביקוויטין ביחד עם הליגנד שלו** נכנסים אל תוך הלומן האנדוזומלי בתוך וזיקולות אנדוזומליות אינטראלומינליות intralumenal vesicles במהלך הבשלת האנדוזום , כך נוצר ה multi-vesicular body , ולבסוף הליזוזום היכן שהרצפטור מעוכל.
159
פיגר 13-56
3 גורלות שונים של הרצפטורים במסלולי אנדוציטוזה מתווכת קולטן:
1) **מחזור**: הרצפטור חוזר לאותו דומיין ממברנלי ממנו הוא נכנס , או באופן ישיר דרך החלקים הטובולרים של ה early endisome , או באופן עקיף דרך ה recycling endosome.
2) **טרנסציטוזה**: הרצפטור מגיע ל early endosome מדומיין אחד של הממברנה , ממנו ל recycling endosome , ויוצא לדומיין האחר של הממברנה.
3) **דגרדציה**: הרצפטור מגיע מה early endosome לליזוזום ומעוכל שם.
גורלו של הליגנד שקשור לרצפטור נקבע באנדוזום , אם הסביבה החומצית שבאנדוזום אינה מספיקה כדי להפריד בין השניים , הליגנד ילך עם הרצפטור שלו לאן שזה ילך (מחזור לאותו דומיין / טרנסציטוזה לדומיין אחר). אם חומציות האנדוזום מספיקה כדי להפריד בינהם , הוא בהכרח יגיע לליזוזום.
נדגיש: מחזור הרצפטור לאותו דומיין ממברנלי יכול לקרות ישירות מה early או בעקיפין מה recycling. מה recycling יתכן בנוסף לכך מסלול טרנסציטי.
160
פיגר 13-57:
אחסון של טרנספורטרים ממברנליים ב recycling endosome
קישור של אנסולין לרצפטור טרנס ממברנלי בתאי שריר ושומן מוציא לפועל קסקדת תגובות סיגנל בתוך התא , שלבסוף גורמות לעליה בטרנספורטרים לגלוקוז בממברנת התא.
161
רצפטורים במסלולי סיגנל על ממברנת התא עוברים down regulation ע״י דגרדציה בליזוזום:
אמרנו בכרטיס הקודם שיש 3 גורלות לרצפטורים שמגיעים ל early endosome מהממברנה במסלולי אנדוציטוזה מתווכת קולטן:
- להתקבץ בחלקים הטובולריים של ה early endosome ומשם לחזור לאותו דומיין בממברנה
- להגיע ל recycling endosome , ומשם להגיע לדומיין אחר בממברנה
- להישאר ב early אנדוזום בזמן הבשלתו ולהגיע לליזוזום
המון רצפטורים של מסלולי סיגנל , כמו למשל רצפטורים לאופיואידים , ורצפטורים לפקטור הגדילה EGF פועלים בסמלול השלישי , כלומר נשארים באנדוזום , ולבסוף מגיעים לליזוזם.
בשונה מהרצפטור ל LDL שיכול להיכנס ל clathrin coated pit בממברנה עוד בטרם קשר את הליגנד שלו , הרצפטור ל EGF נכנס ל pit רק אחרי שהוא קשר את הליגנד (EGF). לאחר ההגעה לאנדוזום (אני משער שהם מתנתקים זה מזה בגלל החומציות) , שניהם , ה EGF והרצפטור , נשארים בתוכו בזמן הבשלתו , ועל כן מעוכלים בליזוזום.
מנגנון פעולת ה EGF הינו דוגמה ל receptor down regulation , כי קישורו לרצפטור שלו בממברנה , מלבד הוצאה לפועל של מסלול הסיגנל הרלוונטי , גורם לדגרדציה של הרצפטור בליזוזום כאמור , כך קישורו מביא לפחות רצפטורים בממברנה , ולרגישות מופחתת בתא למולקולות EGF נוספות. מנגנון זה הגיוני , התא רוצה לבקר את השפעת פקטורי הגדילה שמא יהיה שגשוג תאים.
מנגנון receptor down regulation מבוקר מאד. **מיד אחרי שהליגנד נקשר לרצפטור בממברנה , הרצפטור עובר מודיפיקציה קוולנטית** מסוג **יוביטיקווינציה** על הצד הציטוזולוי שלו , כעת חלבונים מסויימים בתא , מזהים את הרצפטור עם היוביקוויטין ומכוונים אותו ל clathrin coated pit בממברנה לקראת האנדוציטוזה. לציין , בשונה משרשרת ה polyubiquitin הארוכה שמסמנת חלבונים לדגרדציה בפרוטאוזום , פה מדובר **או ביחידת יוביקוויטין אחת ויחידה שנקשרת לרצפטור , או בכמה יחידות מועטות** , ולכן קוראים למודיפקציות אלו monoubiquitylation ו multiubiquitylation בהתאמה. התג היוביקוויטיני שעל הרצפטור מסמן אותו ככזה שאינו צריך לעבור מחזור לממברנה , אלא שעליו לעבור לליזוזום. בעצם , **הרצפטור המסומן ביוביקוויטין ביחד עם הליגנד שלו** נכנסים אל תוך הלומן האנדוזומלי בתוך וזיקולות אנדוזומליות אינטראלומינליות intralumenal vesicles במהלך הבשלת האנדוזום , כך נוצר ה multi-vesicular body , ולבסוף הליזוזום היכן שהרצפטור מעוכל.
162
הבשלת ה early endosome ל late endosome:
ה early endosome בנוי בעיקר מוזיקולות אנדוציטיות שהנצו מהממברנה והתאחו יחדיו. תהילך היווצרות ה early endosome נמשך כ **10 דקות** , במהלכן עוד ועוד וזיקולות מגיעות אליו ומתאחות זו עם זו , ולאחר מכן הוא מתחיל את תהליך ההבשלה.
ה early endosome מורכב מאזורים טובולריים , ומאזורים ואקולריים vacuolar , כאשר **מרבית משטח הפנים של ממברנת האנדוזום נמצא באזורים הטובולריים , ומרבית הנפח (לומן) נמצא בואקוולות** (פיגר 13-55).
במהלך המטורציה של האנדוזום , חלים בו מספר שינויים:
1) **הוא משנה את צורתו ואת מיקומו**:
האזורים הטובולריים שלו חוזרים לממברנה (בעצם תהליך מחזור הרצפטורים מתרחש מהאזורים האלה) , האזורים הואקולאריים עוברים מודיפיקציות , והוא נע על גבי מיקרוטובולי לאזור הגרעין.
2) פוספוליפידים בחלק הציטוזולי (החיצוני) של ממברנת ה early אנדוזום משתנים ע״י חלבוני Rab לכדי פוספואנוזיטיד , ה Rab כמו כן מכניסים כל מיני שינויים בחלבוני SNARE ו- tethers שחיוניים לתהליך האיחוי בין ממברנות , וכך התכונות של האברון משתנות.
3) **חלבונים ליזוזומליים** , כגון ההידרולאזות הלומינאליות + משאבות V type ATPase ממברנליות מגיעים מה TGN על גבי וזיקולות ומתאחות עם האנדוזום , תפקיד המשאבות הוא להכניס H מהציטוזול ללומן של האנדוזום המבשיל כדי להפוך אותו לחומצי. החומציות ההולכת ועולה באנדוזום משפיעה על הקישור שבין הרצפטור לליגנד , וקובעת מה יעלה בגורל הליגנד (אם נשאר קשור לרצפטור חולק את גורלו , אם מופרדים הולך לליזוזום).
4) חלק מהרצפטורים מוכנסים אל תוך הלומן של האנדוזום המבשיל על גבי וזיקולות , כשזה קורה פעילות הסיגנל של הרצפטור נפסקת (כלומר בזמן הבשלת האנדוזום , ועד הרגע הזה הרצפטור ממשיך לתפקד ולייצר סיגנל).
כל התהליכים מתרחשים בהדרגה , כך שלבסוף נקבל מ early אנדוזום early endolysosome , שהוא אנדוזום וליזוזום קיים שהתאחו יחדיו.
תהליך ההבשלה חשוב כדי לשמור על מלאי חלבוני הליזוזום , האספקה המתמדת של חלבונים ליזוזומליים מה TGN לאנדוזום המבשיל מבטיחה שלליזוזום לא יחסר חלבונים.
החומר שנכנס באנדוציטוזה מה ECF , מתערבב ב early endosome עם המון הידרולאזות ליזוזומאליות שהגיעו מה TGN , יתכן שכבר בשלב זה יתחילו תהליכי עיכול מסויימים , אולם אלה זניחים מאד לאור העובדה שההידרולאזות מגיעות מה TGN כשהן מכילות דומיין אינהיביטורי במבנה שלהם ששומר אותם במצב של **proenzyme** - כלומר אנזים לא פעיל הנקרא Zymogen , בהמשך , במהלך הבשלת האנדוזום , ההידרולאזות הופכות להיות פעילות. כמו כן החומציות ב early endosome אינה מספקת להפעלת ההידרולאזות.
163
חלבוני ESCRT מעורבים ביצירת multivesicular bodies:
בזמן הבשלת האנדוזום , חלקים מהממברנה שלו נכנסים באינבגונציה אל תוך הלומן , ליצירת וזיקולות לומינליות. הודות למראה שהוא מקבל , האנדוזום נקרא בשלב זה multivesicular body (פיגר 13-58).
בתוך הוסיקולות הרבות שישנן בגופיף המולטיוזיקולארי , נמצא רצפטורים שמיועדים לדגרדציה בליזוזום , כמו למשל הפקטור EGF והרצפטור שלו , כמו כן נמצא מסביבם תוכן לומינלי של ה early endosome (פיגר 13-59).
רצפטורים כאלה שנכנסים לוזיקולות לומינליות , אינם פעילים יותר , וחוסר מחזורם לממברנה אומר גם שהם לא יחזרו לפעול.
מקודם אמרנו , שרצפטורים ממברנליים שמיועדים לדגרדציה בליזוזום עוברים יוביקוויטינציה בצד הציטוזולי שלהם , יוביקוויטינציה זו מכוונת אותם לאתר הנכון בממברנה , בעצם ל clathrin coated pit שממנו תנץ הוזיקולה. בהגיע הוזיקולה לאנדוזום , הרצפטורים שעליה יכנסו ללומן שלו על גבי וזיקולות אינטראלומינליות ליצירת הגופיף המוליטיוזיקולרי , כיצד זה קורה ? הודות ליוביקוויטין שעל הרצפטורים. כאשר הוזיקולה מגיעה מהממברנה לאנדוזום ומתאחה עימו , היוביקוויטין שקשור לרצפטורים נשאר בולט החוצה לציטוזול (ככלל , כל מה שבולט לציטוזול באברון / וזיקולה יהיה בצד הציטוזולי של ממברנת התא ולהפך , וכל מה שבולט ללומן של האברון , יפנה לחוץ התא ולהפך). פה , קומפלקס חלבונים ציטוזוליים שנקראים חלבוני ESCRT , נקשרים **בסדר אחד אחר השני** לצד הציטוזולי של הרצפטור , היכן שיש את היוביקוויטין , וגורמים להיווצרות הוזיקולה בממברנת האנדוזום שתהפוך להיות וזיקולה אנדוזומלית לומינלית , וכך בעצם נוצר הגופיך המיולטיוזיקולרי (פיגר 13-60).
בנוסף ליוביקוויטין שבולט לציטוזול על הרצפטור , בממברנת האנדוזום קינאזות מיוחדות מזרחנות פוספוליפיד מסוג phosphatidylinositol והופכים אותו ל PI3P , שמשמש כאתר עגינה נוסף עבור ESCRT , בעצם גם היוביקוויטין וגם ה PI3P הינם חיוניים עבור ESCRT.
קומפלקס ESCRT מורכב מהחלבונים ESCRT 0/1/2/3 , כאשר ESCRT3 מייצר קומפלקס מולטמרי גדול שנקשרת לממברנת האנדוזום מבחוץ.
פגיעה או מוטציות בחלבוני ESCRT תפגע במנגנון ה receptor down regulation , ועלולה להביא להתפתחות סרטן.
מנגנון ESCRT גם פועל ב cytokinesis בתאי בעה״ח וההנצה של וירוסים , שהם אקוויולנטים טופולוגיים , בעל המקרים ההנצה מתרחשת בכיוון שמתרחק מהצד הציטוזולי של הממברנה (פיגר 13-61).
וירוסים כמו HIV כשהם יוצאים מהתא הם גונבים לו את חלבוני ESCRT , קורונה יוצאים מהתא במנגנון שונה.
164
פיגר 13-59
יצירה של וזיקולות אינטראלומינליות באנדוזום
רצפטורים שהגיעו עם תג של יוביקוויטין בצד הציטוזולי שלהם מתקבצים על ממברנת האנדוזום. היוביקוויטין עצמו מורד ומוחזר לציטוזול לשימוש חוזר.
כל הממברנות של הוזיקולות האינטראלמינליות מעוכלות באנדוזום , וכך רק התוכן שלהם - חלבון ורצפטור - נשארים בלומן של האנדוזום.
165
פיגר 13-60
בשקף רואים את חלבוני ESCRT מתקבצים , מהצד הציטוזולי , סביב חלבון ממברנלי שמסומן ביוביקוויטין. כדי שה ESCRT יקשר נכון למקום שלו , לא מספיק סימן היוביקוויטין , צריך גם PI3P.
הקישור של חלבוני ESCRT נעשה בשלבים , תחילה נקשר ESCRT0 , ולאחר מכן ESCRT1 , עד שלבסוף נוצר באזור טבעת מולטימרית של ESCRT3.
חלבוני ESCRT הם חלבונים ציטוזוליים מסיסים , שלאחר היוצרות הוזיקולה האינטראלומינלית , מתנתקים מהאנדוזום וחוזרים לציטוזול.
166
פאגוציטוזה:
פאגוציטוזה היא מצב מיוחד של אנדוציטוזה , שבו התאים בולעים חלקיקים גדולים מהסביבה כגון מיקרואורגניזמים ותאים מתים, בתהליך נוצר פאגוזום.
בפרוטוזואה , פוגוציטוזה משמשת גדרך אכילה , תכולת הפאגוזום מפורקת בליזוזום , והצוצרים מופרשים לציטוזול לצורכי בניה. ביצורים רב תאיים ישנו תהליך דומה , בו תאים במערכת העיכול עושים פאגוציטוזה לחומרים אורגניים ב ECF ומכניסים אותם אל תוכם. אולם , פאגוציטוזה ביצורים רב תאיים נעשית **בעיקר** ע״י תאי מערכת החיסון , מאקרופאגים ונוטרופילים , שנלחמים בפתוגנים.
אותם תאים , מלבד בליעה של פולשים , אוכלים גם תאים מתים ותאים שנמצאים ב senescence , בעצם בכל יום תאי מערכת החסון בולעים בפאגוציטוזה כ 11^10 תאי דם אדומים שנמצאים ב senescence.
גודל הפאגוזום נקבע לפי מה שהתא בלע , שלעיתים זה יכול להיות כגודל התא עצמו (פיגר 13-69) , הפאגוזום מתאחה עם הליזוזום , שם תכולתו מעוכלת , דברים שהליזוזום אינו מצליח לעכל נשארים בתוך הליזוזום ליצירת residual bodies , שלאחר מכן מופרשים החוצה באקסוציטוזה , לא כל חלקי הממברנה הפלסמטית שהגיעו לפאגוזום בעצ יצירתו מגיעים לליזוזום , חלקם מוחזרים ישר לממברנה.
חיידק ה pneumophelia מפריש אנזימים שמשנים את חלבוני Rab ובכך מונע איחוי בין הפאגוזום לליזוזום , ועל כן אינו מפורק בתא , אלא שנותר לחיות בתוך הפאגוזום , שם הוא גם מוגן ממערכת החיסון של הגוף , וגורם למחלת הלגיונרים.
167
פגוציטוזה היא תהליך תלוי ליגנד;
כדי שתהליך הפאגוציטוזה יצא לפועל , נדרש בראש ובראשונה שהליגנד יקשר לרצפטור על פני ממברנת התא הפאגוציט , הרצפטור מופעל , ומוציא לפועל תגובה שבסופה תתרחש פעולת הפאגוציטוזה , כמובן שלא כל דבר שנקשר לרצפטורים שעל הממברנה יפעילו את המנגנון.
דוגמה לליגנד כזה היא נוגדנים , שמצד אחד נקשרים לפתוגן שפלש לגוף , ומצד שני נקשרים לרצפטורי Fc על פני הפאגוציט , ובכך מטגררים את המנגנון (פיגר 13-70).
תהליך הפאגוציטוזה מתחיל בכך שהתא מאריך שלוחות ממברנליות , pseudopods , שאיתן הוא מאגף את הפתוגן. הפסאודופודים בנויים מבפנים מסיבי אקטין , ולכן כדי שהם יתארכו צריך קודם כל **לשפעל את הנוקליאציה של סיבי האקטין** , זה נעשה ע״י פקטור GEF , שמפעיל .
168
חזרה לשקף 243:
מה קורה כאשר תא צריך כולסטרול לסנתזה של הממברנה ?
התא יכול להכניס כולסטרול מבחוץ , הוא עושה זאת ע״י סנתזה של רצפטורים טרנסממברנליים ל LDL
הרצפטור once מגיע לממברנה הוא נע לטרלית בדיפוזיה בתוכה עד שהוא נתקל ב clathrin coated pit שנמצאים בתהליך היווצרות. בממברנת התא יש פוספוליפיד שנקרא PIP2 , כאשר הרצפטור נקשר ל PIP2 הוא משופעל ומשנה קונפורמציה , **ורק במצבו הפעיל LDL מהדם יכול להיקשר אליו**.
בשלב האחרון מגיע חלבון אדפטור בשם AP2 וקושר את הקומפלקס רצפטור-PIP2 , וכך נוצרת וזיקולת קלתרין שמכניסה את הרצפטור-LDL אל תוך התא
169
מה קורה לקומפלקס רצפטור-LDL ברגע שהוכנסו לתא ?
אחרי הנצת הוזיקולה מהממברנה , בעודה בציטופלסמה , מעטפת הקלתרין מתפרקת וחוזרת לממברנה.
הקומפלקס מגיע בוזיקולה (לחא קלתרין) ומתאחה עם ממברנת הearly endosome , הסביבה הפנימית של האנדוזום המוקדם הינה חומצית וזה גורם לניתוק בין הרצפטור ל LDL.
ה LDL ״נע קדימה״ מהאנדוזום המוקדם ומגיע לאנדוליזוזום או לליזוזום , פה **הכולסטרול אסתר** מתפרק והתא מפיק ממנו **כולסטרול חופשי**.
הרצפטור מוחזר מהאנדוזום המוקדם , **מהאזור הטובולרי שלו** , אל הממברנה הפלסמטית לסבב נוסף.
עבור רצפטור נתון ל LDL , בממוצע , הוא עושה סבב כזה כל 10 דקות. כשאורך חייו הוא כ 20 שעות , עד שהוא מפורק בצא ומוחלף ברצפטור חדש.
שקף 14-54
170
מה קורה כאשר בתא מצטבר יותר מדי כולסטרול ?
1) התא מפסיק מסלילוי סנתזה של כולסטרול
2) התא מפסיק סנתזה של רצפטור ל LDL , ובכך מקטין את ה intake של כולסטרול מהדם
171
מה קורה אצל אנשים חולים ?
יש אנשים שיורשים גן פגום לרצפטור ל LDL , אתל אנשים כאלה ה LDL לא מצליח להיכנס לתא ונשאר בדם , ויכול לגרום בכך למחלות בכל״ד וטרשת.
אצל חלק מהחולים הרצפטור חסר לגמרי ובכלל לא נוצר , אצל אחרים הוא כן מיוצר אך פגום. הפגם יכול להיות בחלקו החיצוני וכך LDL לא נקשר , או החלקו הפנימי וכך AP2 לא נקשר (לזכור שהרצפטור הוא טרנסממברנלי).
172
יותר מ 25 רצפטורים טרנס ממברנליים משתתפים באנדוציטוזה מתווכת קולטן:
לכל הרצפטורים האלה יש שני מאפיינים משותפים:
**1)** כולם עושים שימוש ב clathrin coated pits
**2)** לכולם בחלק הציטוזולי נדרש קישור של חלבון אדפטור (כגון AP2) להשלמת התהליך.
לחלקם חייב להיקשר הליגנד כדי שהאנדוציטוזה תתרחש , ולחלקם , כמו הרצפטור ל LDL הליגנד לא חייב להיקשר ועדיין תתרחש אנדוציטוזה.
173
מדוע אנדוציטוזה מתווכת קולטן נחשבת כ ״מסננת מולקולרית״ ?
בגלל הצפיציפיות הגבוהה יחסית של המנגנון. רוב חלבוני הפלסמה (דם) אינם יודעים להתרכז ב clathrin coated pits , ולכן רק חלבונים מאד מסויימים מוכנסים לתא באופן זה , ועל כן הספיציפיות הרבה.
174
אנדוציטוזה מתווכת רצפטור-
טרנספרין:
טרנספרין הוא חלבון מסיס הנושא ברזל בדם.
טרנספרין והברזל הקשור אליו נכנסים לתא מהדם המנגנון אנדוציטוזה מתווכת רצפטור. הקומפלקס רצפטור-טרנספרין-ברזל נכנס בוזיקולה ומגיע לאנדוזום המוקדם , הסביבה החומצית באנדוזום המוקדם גורמת לניתוק בין הטרנספרין לברזל (שכעת נקרא אפוטרנספרין) **אולם לא גורמת לניתוק בינו לבין הרצפטור**.
כעת הקומפלקס רצפטור-אפוטרנספרין ממוחזר מהאנדוזום המוקדם , מאזור טובולרי , חזרה לממברנה. הרצפטור הוא טרנס ממברנלי , חלקו החיצוני - קושר האפוטרנספרין - בולט אל מחוץ לתא , פה ה oH הוא 7.4 (ולא חומצי כמו באנדוזום) , ולכן האפוטרנספרין מתנתק מהרצפטור , וכעת יהיה זמין לקשירת ברזל נוסף.
175
תאר את התנאים בסביבה החוץ תאית:
זוהי סביבה מחמצנת , ולכן למשל קשרי SS יכולים להתקיים בה (לעומת הסביבה המחסרת בציטוזול)
זוהי סביבה בעלת pH פיזיולוגי של 7.35 , בדומה לציטוזול.
176
אנדוציטוזה מתווכת רצפטור:
EGF
החלבון EGF הוא פקטור גדילה חוץ תאי , שמגיע לתא מהדם , ומעודד חלוקה של מספר תאים , בייחוד תאים אפידרמליים.
EGF: epidermal growth factor
אמרנו באנדוציטוזה מתווכת קולטן של LDL , שהרצפטור נע בדיפוזיה בממברנה עד שמגיע לאזור של clathrin coated pits , שם הוא משופעל ע״י PIP2 , ורק אז הוא יהיה מסוגל לקשור את הליגנד. ב EGF הדבר שונה , הרצפטור ל EGF קושר את ה EGF עוד בטרם הוא נכנס לאזורים של ה clathrin coated pit , ורק לאחר הקישור הוא נכנס ל pits
הבדל נוסף , הרצפטור ל LDL ממוחזר מהאזור הטובולרי של האנדוזום המוקדם לממברנה הפלסמטית , הרצפטור ל EGF מגיע בעצמו לליזוזום ומפורק שם.
177
רגולציה על הרצפטור ל EGF:
קישור הפקטור EGF לרצפטור שלו גורם בהתחלה להפעלה של מסלולי העברת סיגנל , אך לאחר זמן מה , מוביל לירידה בריכוז הרצפטור , ועל כן להשהיה בהעברת הסיגנל. איך זה קורה ?
כאמור , הקומפלקס רצפטור-EGF נכנס בוזיקולת קלתרין מהממברנה לציטוזול , שם המעטפת הקלתרינית מפורקת והוזיקולה מגיעה לאנדוזום מוקדם , שממנו גם הרצפטור וגם הליגנד (EGF) מגיעים לליזוזום.
בליזוזום הרצפטור מפורק , כלומר **בשום שלב הוא אינו ממוחזר לממברנה הפלסמטית**. הדבר מדגים מנגנון רגולטורי שנקרא receptor down regulation , שלפיו ריכוז הרצפטור יורד , ובכך מוריד את הרגישות של התא לסיגנלים מסויימים.
מנגנון זה חיוני ביותר , EGF מעודד חלוקה תאית , ללא מנגנון הרגולציה , כלומר במידה ורגישות התא ל EGF נשארת גבוהה , עלול להתפתח גידול סרטני עקב שגשוג יתר של התא.
178
כציד רצפטורים מושמדים בליזוזם במנגנון receptor down regulation ?
נקח כדוגמה את הרצפטור ל EGF. תחילה הרצפטור קושר את הליגנד שלו , **הדבר מפעיל אותו** , **ברגע שהופעל** הוא עובר מודיפיקציה קוולנטית מסוג יוביקוויטינציה. בשלב הזה , מגיעים חלבונים קושרי יוביקוויטין ומובילים את הקומפלקס רצפטור-EGF לאזור בממברנת התא היכן שיש clathrin coated pit.
לציין , שפה לא מדובר במודיפיקציה מסוג poly uniquitylation שבה יש הוספה של המון שיירי יוביקוויטין לחלבון המטרה , אלא שמדובר ב mono ubiquitylation או multi uniquitylation (הוספה של מספר מועט של שיירים).
בשלב הבא , מהאזור בממברנה עם הקלתרין נוצרת וזיקולה שנעה לכיוון האנדוזום , מעטפת הקלתרין מתנתקת בציטוזול והוזיקולה מתאחה עם ממברנת האנדוזום המוקדם. כעת חלבונים קושרי יוביקוויטין , נקראים ESCRT , מזהים את התג שעל הרצפטור ומעודדים היווצרות וזיקולה , שתהפוך לוזיקולה אנטרא לומינלית. **אך בטרם שהוזיקולה נוצרת , היוביקוויטין מתנתק ממנה ומשתחרר לציטוזול**.
כעת הוזיקלה האנטראלומינלית עם תכולתה (רצפטור-EGF) נשארת בלומן **תוך כדי הבשלת האנדוזום**. במהלך הבדלת האנדוזום הוא מקבל אנזימים הידרוליטיים מהגולג׳י , אלה מפרקים את ממברנת הוזיקולה האנטראלומינלית , את ה EGF ואת החלק הציטוזולי של הרצפטור.
שקף 250
179
היכן מפורק הקומפלקס רצפטור-EGF ?
הסביבה החומצית באנדוזום המוקדם אינה מפרקת את הקשר שבין הרצפטור ל EGF , אלא ששניהם מגיעים יחדיו לליזוזום ומפורקים שם.
בניגוד לקומפלקס רצפטור-LDL שמפורק באנדוזום המוקדם , וכן קומפלקס רצפטור-טרנספרין-ברזל , שמפורק באנדוזום המוקדם לכדי רצפטור-אפוטרנספרין.
180
מה מכילים ה multivesicular bodies ?
תחילה נגדיר , multivesicular bodies הם אנדוזומים שבתהליך ההבשלה שלהם חלקים מהממברנה שלהם עברו אינבגינציה ונכנסו אל תוך הלומן. ריבוי הוזיקולות בתוך הלומן נותן להם מראה ייחודי תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שנקרא multivesicular bodies.
ולגבי תכולתם ? ה multivesicular bodies מכילים חלבוני ממברנה שעברו אנדוציטוזה אשר מיועדים לפירוק , כגון הרצפטור ל EGF + תוכן מסיס של אנדוזום מוקדם שגם היא מיועד לפירוק בליזוזום.
181
מהו תפקיד תג היוביקוויטין במסלולי אנדוציטוזה מתווכת רצפטור ?
תחליה תפקידו לכוון את הקומפלקס רצפטור-ליגנד לאזורי clathrin coated pits בממברנת התא
משהגיעה הוזיקולה אל האנדוזום המוקדם , תפקידו לכוון להיווצרות וזיקלה אינטראלומינלית בעזרת חלבוני ESCRT
182
חלבוני ESCRT:
מדובר במשפחת חלבונים **ציטוזוליים** שתפקידם לסייע ביצירת וזיקולות אינטרא לומינליות באנדוזום.
התהליך מתרחש בהדרגה ובשלבים , ה ESCRT’s מזהים את היובקוויטין שעל הרצפטור ובכך מסייעים בתהליך המיון של חלבונים ממברנליים אל תוך וזיקולות אינטרא לומינליות.
183
כיצד נוצרת וזיקולה אינטרא לומינלית באנדוזום ?
ישנם 3 שחקנים עיקריים:
- היוביקוויטין
- חלבוני ESCRT
- קינאזות של ליפידים
מגיע הקינאז של הליפידים ומזרחן פוספוליפיד שנקרא phosphoinositol לכדי PI3P. **ה PI3P ביחד עם היוביקוויטין** מהווים אתר עגינה עבור קומפלקס ה ESCRT הראשון שמגיע , ESCRT0. כעת תהיה שרשרת העברה של הרצפטור עם הליגנד שלו בין מספר קומפלקסי ESCRT עד שמגיעים ל ESCRT האחרון , בעצם ESCRT3.
ה ESCRT3 הוא קומפלקס חלבוני **מולטימרי** שמתווך אינבגינציה של הממברנה , בעצם גורם לכיםוף שלה מה שמביא לבסוף לאינבגינציה שלה (שקף 252).
חלבוני ESCRT הינם חלבונים ציטוזוליים מסיסים , בתום התהליך הם משתחררים חזרה לציטוזול , וכשצריך אותם הם מגוייסים חזרה לממברנת האנדוזום.
184
למה יגרום העדר חלבוני ESCRT ?
בעצם להתמרה סרטנית ,
בהעדר חלבוני ESCRT פונקציונליים נראה שמנגנון ה receptor down regulation נפגע , הרצפטורים אינם נהרסים בליזוזום , אלא שממשיכים להעביר סיגנל חוץ תאי כגון EGF , מה שעלול לגרום לשגשוג תאים.
185
ציטוקנזה בבעלי חיים והנצת וירוסים:
שני תהליכים שעושים שימוש בחלבונים דמויי ESCRT , שני תהליכים אלה , **ציטוקנזה והנצת וירוסים** הם תהליכים מקבילים מבחינה טופולוגית , כי בשניהם ישנה הנצה החוצה מהחלק הציטוזולי.
בעצם ציטוקנזה (חלוקת הציטופלסמה של התא) , הנצת וירוסים מהציטוזול החוצה , ויצירת וסיקולות אינטרא לומינליות באנדוזום הם תהליכים אקוויולנטים מבחינה טופולוגית.
186
HIV vs. SARS-CoV-2:
ידוע שתהליך ההנצה של HIV מהתא עושה שימוש במנגנון ESCRT
הנצה של הקורונה לא עושה שימוש במנגנון ESCRT , אלא שהוא עושה שימוש במנגנון הפרשה , הוירוס נכנס לצבר וזיקולות טובולרי בין הגולג׳י ל ER , ויוצא מהתא דרך אקסוציטוזה.
187
מה הם שלשת הגורלות עבור רצפטור שנכנס לתא בתהליך אנדו ציטוזה מתווכת רצפטור:
בעצם , לרצפטור הקושר ליגנד ונכנס לתא באנדוציטוזה מתווכת קולטן יש 3 גורלות:
1) הוא מגיע לאינדוזום המוקדם מהממברנה , שם הרצפטור והליגנד נפרדים , החיגנד ממשיך לליזוזום , והרצפטור **עובר recycling חזרה לממברנה**. במצב הזה , הרצפטור חוזר **לאותו דומיין** ממברנלי (לאותו צד) שהוא הגיע ממנו. תהליך הrecycling יכול להיות ישיר מהאנדוזום המוקדם , ויכול להיות עקיף דרך ה recycling endosome.
2) הוא נשאר בתוך האנדוזום המבשיל , נוצר גופיף מולטי וזיקולרי , ואז הרצפטור מושמד בליזוזום.
**אך קיימת אפשרות שלישית:**
3) הרצפטור ביחד עם הליגנד שלו , מועברים מהאנדוזום המוקדם לדומיין אחר בממברנה (בעצם לצד השני) ולא חוזרים לאותו דומיין שהם הגיעו ממנו , כך שבעצם מה שמתרחש זה תהליך **טרנסציטוזה**.
188
טרנסציטוזה:
כאשר הרצפטור והליגנד שלו , שנכנסו לתא בתהליך אנדוציטוזה מתווכת קלטן , אינם חוזרים לאותו דומיין ממברנלי , אלא הולכים לדומיין השני.
189
ספיגת נוגדן מחלב האם ע״י התינוק היא דוגמה לטרנסציטוזה:
העובר יונק , הנוגדנים שבחלב האם מגיעים ללומן של המעי שלו , הסביבה בלומן חומצית ומעודדת קשירה בין הנוגדן לרצפטור (שנקרא Fc receptor). הרצפטור-נוגדן נכנסים לציטוזול של תא האפיתל במעי באנדוציטוזה מתווכת קלטן מהצד האפיקלי , ויוצאים מהצד השני של התא , הצד הבזולטרלי. בצד זה (המרווח הבין תאי) ה pH הוא ניטרלי , וזה מעודד ניתוק בין הרצפטור לליגנד , הרצפטור חוזר לתא והליגנד - הנוגדן - נספג לדם.
190
במסלול טרנסציטוזה המעבר לדומיין השני אינו ישיר:
קודם הוזיקולה שמכילה את הקומפלקס רצפטור-ליגנד הולכת מהאנדוזום המוקדם ל recycling endosome , ואז ממנו נעה לכיוון השני של התא.
191
כיצד הרצפטור יודע מהו גורלו ?
על הרצפטור ישנו סיגנל מיון (כנראה רצף סיגנל) שמכווין את הרצפטור למסלול ההעברה המצאים מבין ה 3
192
כמה אתרי קשירה יש על רצפטור שמשתתף באנדוציטוזה מתווכת קולטן ?
שניים , אתר קישור אחד הוא לליגנד. אתר קישור שני הוא ל coated pits
193
מה עולה בגורלו של הליגנד הקשור חרצפטור באנדוציטוזה מתווכת קולטן ?
הרצפטור והליגנד מגיעים לאנדוזום המוקדם , שהסביבה בו היא חומצית. אם הסביבה החומצית גורמת לפירטק הקשר בינהם , החיגנד **בהכרח יגיע לליזוזום**. אם הם נשארים קשורים , הליגנד חולק עם הרצפטור את גורלו , ומגיע ביחיד איתו לאחד משלשת היעדים הסופיים.
194
Recycling endosome:
ה recycling endosome משחק מספר תפקידים חשובים בתא:
1) מסלול טרנסציטוזה חייב להתרחש דרכו.
2) **חלק** מהרצפטורים הממוחזרים לאותו דומיין מנברנלי עוברים אליו קודם , ולא ישירות מהאנדוזום המוקדם.
3) מהווה תחנה שבה חלק מהרצפטורים נשארים באופן זמני , עד שהם עוברים sorting לייעודם הסופי.
4) משחק תפקיד בהתאמה של הריכוז של חלבונים ממברנליים ספיציפיים , כגון קולטנים לגלוקוז בתאי שריר ושומן.
195
קליטת גלוקוז בתאי שריש ושומן:
בתוך תאי השריר והשומן יש מאגרים גדולים של רצפטורים לגלוקוז שמאוחסנים ב recycling endosome
בתגובה לאנסולין (שמעיד על רמת סוכר גבוהה בדם) וזיקולות רבות , שמכילות את הרצפטורים לגלוקוז , יוצאות מה recycling endosome אל הממברנה , כך כמות הקולטנים לגלוקוז על פני הממברנה גדלה , וגלוקוז מוכנס מהדם אל תוך התא ביתר שאת.
דבר דומה גם קורה בכליות עם אקווהפורינים ו- V-ATPase , שמפרישים מים וחומצה בהתאמה.
שקף 258
196
פאגוציטוזה:
זהו מצב מיוחד של אנדוציטוזה שבו תאים מיוחדים בולעים **חלקיקים גדולים** כגון מיקרואורגניזמים ותאים מתים.
בפגוציטוזה התא הבולע עושה שימוש **בוזיקולות אנדוציטיות** גדולות המיוחד הנקראות פאגוזום phagosome באמצעותן הוא מכניס את אותם צורונים גדולים אל תוכו.
197
למה משמשת פאגוציטוזה ?
בתאים מסויימים , כגון פרוטוזואה וכמה סוגי תאים ספיציפיים ביצורים רב תאיים , פאגוציטוזה משמשת להזנה. הפאגוזום מתאחה עם הליזוזום , תכולתו מפורקת ויוצאת חזרה לציטוזול , שם היא מהווה אבני בניין ומקור לאנרגיה.
אולם , במרבית בעלי החיים , המטרה לשמה תאים עושים פאגוציטוזה היא שונה ולא נועדה לצורכי הזנה. בבעלי חיים , פאגוציטוזה מבוצעת ע״י תאים מתמחים שנקראים professional phagocytes , והיא נועדה להגן מפני פולשים ופתוגנים.
198
מי הם ה professional phagocytes ביונקים ?
מדובר בשתי מחלקות עיקריות של תאי דם לבנים שמתפתחים מתאי גזע המטופואטים , בעצם נוטרופילים ומאקרופאגים. תאים אלה בולעים פתוגנים שפולשים לגוף מבחוץ **ובכך מונעים זיהומים** באורגניזם.
למאקרופאגים , בנוסף לבליעת פולשים מבחוץ , יש עוד שני תפקידים חשובים: הוא בולע תאים הנמצאים במצב של senescence + בולע תאים שמתו באפופטוזיס. בעצם בכל יום תאים מאקרופאגים בולעים 11^10 תאי דם אדומים הנמצאים בסניסנס.
199
מהו גודלו של הפאגוזום ?
גודלו של הפאגוזום משתנה לפי גודל החלקיק הנבלע , במקרים מסויימים הפאגוזום יכול להגיע לגודל התא הבולען עצמו.
200
מהו גורלו של הפאגוזום ?
הפאגוזום שנוצר מתאחה עם הליזוזום , והתוכן שנבלע מפורקשם. חומרים שלא ניתנים לפירוק נותרים בתוך הליזוזום ליצירת מה שנקרא residual bodies , שאז יוצא מהתא דרך אקסוציטוזה.
לא כל מרכיבי הפאגוזום מגיעים לליזוזום , חלק ממרכיבי הממברנה שנבלעו במהלך הפאגוציטוזה ממוחזרים לממברנה ע״י transport vesicles
201
Legionella pneumophila:
חיידק פתוגני שםיתח מנגנון שמונע מהפאגוזום להתאחות עם הליזוזום , החיידק מפריד אנזים אל תוך הציטופלסמה של התא הבולען , האנזים פוגע בחלבוני Rab וכורם להם לעשות הכוונה לא נכונה של וזיקולות , בעצם מונע איחוי בין הפאגוזום לליזוזום.
החיידק בסה מצליח להישאר בתוך התא , הוא מתחלק ומתרבה בתוכו , והתא מספק לו הגנה מפני מערכת **החיסון הנרכשת**.
202
מהו הטריגר לפאגוציטוזה ?
**פטגוציטוזה הינה תהליך תלוי cargo**. כלומר היווצרות הפאגוזום לא תצא לפועל כל עוד החיגנד הספיציפי לא נקשר לרצפטור מסויים על פני מנברנת התא. ברגע שהליגנד נקשר , הרצפטור מופעל ושולח מסר אל פנים התא שעומד להגיע פאגוזום.
האם זה אומר שכל חלקיק שנקשר לרצפטור הנ״ל יעורר פאגוציטוזה ? התשובה היא לא.
דוגמה לליגנד שמפעיל מנגנון פאגוציטוזה הוא נוגדן. נוגדן נקשר לפתוגן בקצה אחד שלו, ובקצהו השני , קצה ה Fc , הוא נקשר לממברנת התא הבולען על רצפטור מיוחד שנקרא Fc receptor ומפעיל אותו. כל הפתוגן , הנוגדנים , והרצפטור נבלעים בתוך הפאגוזום.
203
שלבי פאגוציטוזה ?
1) אמרנו שפאגוציטוזה הינה **תהליך תלוי cargo** , ולכן שלב ראשון בפאגוציטוזה הוא **קשירת הליגנד הנכון לרצפטור**.
2) בשלב השני נוצרים מבנים מיוחדים בממברנת התא הבולען שנקראים פסאודופודים pseudopods שעוטפים את הליגנד
3) הליגנד נבלע
204
פסאודופודים
Pseudopods
מדובר בשלוחה ממברנלית של תאים בולעניים שמאגפת את החלקיק (פתוגן) אותו הם עומדים לבלוע.
היווצרות הפסאודופוד מתרחשת בעקבות היקשרות החלקיק הנתון לרצפטור המתאים על ממברנת התא , נניח Fc receptor , הדבר מוציא לפועל שרשרת תגובות:
ה Fc receptor מפעיל חלבוני GEF שמפעילים GTPase מסוג Rho שמפעיל PI kinase שמזרחן PI בממברנת התא לכדי PIP2.
ה PIP2 מעודד התפלמרות של סיבי אקטין באזור הנתון של הממברנה , ובכך נוצרת השלוחה - בעצם הפסאודופוד
כדי שהחלקיק יבלע נדרשת דה התפלמרות של סיבי האקטין , בשביל זה מגיע קינאז נוסף שנקרא PI3 kinase ומזרחן את PIP2 בעמדה 3 , הדבר גורם להרס סיבי האקטין בבסיס הפסאודופוד והוא נסגר
שקף 263
205
PI kinase:
מדובר בקינאזה של ליפידים , האנזים יודע לזרחן פוספוליפידים בממברנת התא שנקראים phosphoinositoles , והדבר חיוני עבור ריאקציות רבות:
**יצירת PI3P מ PI:** ז״א הפוספואנוזיטול מזורחן בזרחן אחד על עמדה 3 שלו. PI3P נוצר בממברנה של האנדוזום והוא חיוני עבור עיגון של חלבוני ESCRT
**יצירת PIP2**: מדובר בעצם בפוספוליפיד המזורחן בשתי עמדות 4 ו- 5, ולכן בשמו המלא PI(4,5)P. פוספוליפיד זה כשנוצר בממברנת תא בולען מעודד התפלמרות סיבי אקטין שמעודד יצירת פסאודופוד
**יצירת PIP3**: מדובר בעצם בפוספוליפיד המסורחן בשלש עמדות 3, 4 ו- 5. ולכן בשמו המלא יקרא PI(3,4,5)P. כשהוא נוצר הוא גורם לדה פולמריזציה של סיבי אקטין המביאה לסגירת מבנה הפסאודופוד.
206
הרבה רצפטורים משתתפים בתהליך הפאגוציטוזה:
כבר נתקלנו באחד מהם שנקרא Fc receptor , שקושר את קצה ה Fc של נוגדן (שקשור בקצהו השני לפתוגן).
קיימים מספר רצפטורים נוספים , כאלה שיודעים לקשור רכיבים של מערכת המשלים , הפועלים יחדיו ים נוגדנים.
רצפטורים אחרים מזהים באופן ישיר אוליגוסכרידים על פני שטח הממברנה של פתוגנים מסויימים
רצפטורים נוספים מזהים תאים שמתו באפפטוזיס , תא שמת באפפטוזיס מציג על העלעל החיצוני של הממברנה שלו פוספטידילסרין phosphatidylserine הטעון שלילית ונמצא בד״כ על העלעל הפנימי בממברנה , נוכחותו ביתר שאת בעלעל החיצוני הינה סממן שהתא הינו אפופטוטי ושצריך לבלוע אותו ע״י מאקרופאג
207
מה מאקרופאג יודע לבלוע ?
- פתוגנים שפלשו מבחוץ
- תאים מתים או חולים של הגוף
- חלקיקים דוממים כגון זכוכית ואזבסט
**אך הוא לא מסוגל לבלוע תאים חיים של הגוף** תא חי של הגוף מציג על הממברנה שלו סיגנל ״אל תאכל אותי״ בצורה של חלבונים ממברנליים שנקשרים לרצפטורים על המאקרופאג׳ ומעכבים אותו
היקשרות סיגנל ״אל תאכל אותי״ לרצפטור בממברנת המאקרופאג׳ מגייסת אנזימי tyrosine phosphatase המעכבים סיגנלים תוך תאיים המאתחלים את תהליך הפאגוציטוזה
לתא אפופטוטי על הממברנה שלו יהיה שני סממנים כדי שייבלע ע״י מאקרופאג׳: להציג סיגנל ״אכול אותי״ , ולהעלים סיגנל ״אל תאכל אותי״
208
Tyrosine phosphatase
טירוזין פוספטאז
אנזים שמגוייס בתאי מאקרופאג׳ בעקבות עיכוב שלהם ע״י סיגנל ״אל תאכל אותי״ שמציגים תאים חיים של הגוף. האנזים מונע יציאה לפועל של תהליך הפאגוציטוזה.
209
אקסוציטוזה:
תהליך של הפרשה , במהלכו וזיקולה נצמדת לממברנה , מתאחה עימה , ותכולתה נשפכת החוצה.
קיימים שני מסלולי הפרשה אקסוציטיים:
- constitutive secretion
- regulated secretion
210
constitutive secretion
מסלול הפרשה קונסטיטוטיבי
**כל התאים עושים זאת**
במסלול זה וזיקולות נעות ללא הרף וללא הפסקה בזרם קבוע כצינורות **א-רגולריות** ומגיעות לממברנת התא.
בממברנה של הוזיקולה ישנם חלבונים וליפידים שמספקים מרכיבים חדשים לממברנת התא , בתוך הוזיקולה ישנם חלבונים מסיסים שמופרשים מהתא החוצא.
**במסלול זה תאים מפרישים את הפרוטאוגליקנים והגליקופרוטאינים של ה ECM**
מסלול הפרשה זה שונה בין תאים פולריים לתאים לא פולריים. בתאים פולריים על החומר המופרש להכיל סיגנל מתאים שמכוון אותו לקצה האפיקלי , או לקצה הבאזולטרלי. אם התא אינו פולרי החלבון לא צריך להכיל שום סיגנל , ועל כן מסלול זה נקרא גם default pathway
211
regulated secretion
מסלול הפרשה מבוקרת
**מבוצע רק ע״י תאים מתמחים**.
לצד המסלול הקונסטיטוטיבי , ישנם תאים שמסוגלים להפריש חומרים מסויימים לפי דרישה ובתגובה לגירוי מסויים.
מסלול זה לא נועד לספק מרכיבי ממברנה לממברנת התא , ולכן בגדול מה שמעניין בוזיקולה זה תכולתה , במסלול זה **הוזיקולות מכילות חלבונים וחומרים מסיסים** שמיועדים להפרשה מחוץ לתא. החומרים המופרשים שמיוצרים בתא , תחילה **מאוחסנים** ב secretory vesicles , ואז בהתקבל הגירוי המתאים , מתרחש תהליך אקסוציטוזה שבו החלבונים (או חומרים מסיסים אחרים) מופרשים מחוץ לתא.
דוגמה לכך: הפרשת נוירוטרנסמיטורים מהקצה הפרה סינפטי. הפרשת הורמונים ואנזימי עיכול.
212
תהליך האקסוציטוזה:
תחילתו של תהליך האקסוציטוזה היא ב TGN , פה יש sorting של וזיקולות שכל אחת מכילה חלבונים שמיועדים למסלול אחר. ניתן לסכם זאת ב 3 מסלולים:
1) חלבונים עם הסימן מנוז6פוספט המיועדים לליזוזום יוצאים מה TGN בוזיקולה עטופת קלתרין , מגיעות לאנדוזום וממנו לליזוזום.
2) חלבונים המיועדים להפרשה מבוקרת יצאו מה TGN ויאוחסנו ב secretory vesicles עד להפרשה. חלבונים אלה מכילים סיגנל שמכוון אותם ל secretory vesicles (קיים כאמור רק בתאים מסויימים)
3) חלבונים המיועדים להפרשה קונסטיטוטיבית בכל התאים , חלבונים אלה אינם מכילים סיגנל מיוחד (אלא אם כן התא פולרי).
213
תאר את מסלול ה default בהפרשה קונסטיטוטיבית:
**בתא לא מקוטב** , נראה שכל חלבון בלומן של הגולג׳י נישא **אוטומטית** על ידי מסלול ההפרשה הקונסטיטוטיבי **אל פני התא**. זוהי ברירת המחדל שלו בעצם , ה default , אלא אם כן על החלבון יש סיגנל אחר שמלמד על ייעוד שונה.
למשל , תא דם לבן , הוא תא שאינו קוטבי , ברירת המחדל של חלבון הנמצא בלומן הגולג׳י היא להיות מופרש במסלול קונסטיטוטיבי. רק במידה ועל החלבון יש סיגנל מיוחד שיכוון אותו ל secretory vesicles נגיד , החלבון ילך להפרשה מבוקרת
214
בתא לא פולרי , בהעדר סיגנל , כל חלבון בלומן של הגולג׳י יופרש במסלול קונסטיטוטיבי , אלא אם כן:
- החלבון מכיל סיגנל שהופך אותו לחלבון resident בגולג׳י
- מכיל סיגנל שמכוון אותו ל secretory vesicles
- מכיל סיגנל המחזיר אותו ל ER
- מכיל מנוז6פוספט שמכוון אותו לאנדוזום וממנו לליזוזום
בתא פולרי כל חלבון חייב להכיל לפחות סיגנל אחד שיכוון אותו לאחד משני הדומיינים של הממברנה , אפיקלי לעומת באזולטרלי.
215
אקסוציטוזה:
מסלול הפרשה מבוקר regulated
קיים כאמור רק בתאים מתמחים , חלבון שנמצא בגולג׳י מכיל סיגנל מיוחד שמכוון אותו לוסיקולות הפרשה secretory vesicles , שבמיקרוסרופ אלקטרונים נראים בעלי ליבה מאד צפופה ולכן גם נקראים
dense core secretory granules
השחרור של הגרנולה הוא בתגובה לסיגנל ספיציפי
216
כיצד חלבון יודע שהוא מיועד להיות מופרש במנגנון הפרשה מבוקר ?
Regulated
**וזיקולות ההפרשה נוצרות ב TGN!!**
אריזת החלבונים לתוך וזיקולת ההפרשה מתרחשת דרך מנגנון הנקרא **אגרגציה סלקטיבית** , שלפיו חלבונים המיועדים להפרשה מכוונים לאגרגטים אלו דרך סיגנלי מיון משותפים.
יש מספר סיגנלי מיון , אך ככל הנראה חלבונים שמכילים אותו סיגנל יוכוונו לאותו אגרגט שיעטף בוזיקולה נתונה.
וזיקולות ההפרשה secretory מכילות בממברנה שלהם רצפטורים שיודעים לקשור חלבונים מסיסים המיועדים להפרשה מבוקרת , לא לכל חלבון באגרגט יש רצפטור כזה , האגרגט נקשר לאזור בממברנה וגורם לה להתקפל סביבו כך שגם חלבונים שלא קשרו רצפטור גם כן יכנסו. הממברנה של ה TGN תחילה נסגרת סביב האגרגט באופן רופף ובהתחלה היא דומה מורפולוגית לציסטרנה של הטרנס גולג׳י , בהמשך מספר וזיקולות כאלה יתאחו , **בתהליך ההבשלה של הוזיקולות**
217
וזיקולות ההפרשה במסלול אקסוציטוזה מבוקרת הם מאד צפופות:
הדבר מתרחש הודות לכך שהמון וזיקולות לא בשלות שמתנתקות מה TGN מתאחות יחדיו , ולכן **הוזיקולה הבשלה** שנוצרת מכילה ריכוז גבוה מאד של חלבונים. סיבה נוספת היא שבמהלך ההבשלה חתיכות מהממברנה של הוזיקולות הלא בשלות מתנתקות וחוזרות ל TGN , כך שבוזיקולה הבשלה שנוצרת יש יחס שטח פנים / נפח בטובת הנפח , כלומר המון חלבונים בתוך וזיקולה יחסית קטנה.
סיבה שלישית , הסביבה בוזיקולה הבשלה הופכת להיות חומצית , מה שגורם לאגרגטים החלבוניים שהגיעו מה TGN להפוך להיות יותר צפופים.
218
שקף 13-42
היווצרות וזיקולות הפרשה במסלול מבוקר regulated:
תחילה אני רואה שהוזיקולה שמנצה מה TGN הינה עטופת קלתרין , הקלתרין הזה חשוב כי האזורים שיש עליהם קלתרין מתנתקים מהוזיקולה בתהליך ההבשלה שלה וחוזרים ל TGN. הניתוק הזה של חלקי ממברנה מהוזיקולה (שמכילות גם תוכן לומינלי) תורם להיווצרות וזיקולות בשלות צפופות במיוחד.
סיבה נוספת לכך שוזיקולת הפרשה (secretory) בשלה היא צפופה , הוא ריכוז החלבונים הגבוה שהיא מכילה. בעצם , מספר וזיקולות שהנצו מה TGN מתאחות יחדיו **אחרי שהם שלו מעליהם את מעטפת הקלתרין וביחד איתה חתיכה מהממברנה שלהם** , האיחוי הזה אומר שכעת ריכוז החלבונים בוזיקולה הבשלה הוא גבוה במיוחד.
סיבה שלישית , האגרגטים החלבוניים שבתוך הוזיקולה נהיים יותר צפופים הגלל הסביבה החומצית שבה
219
וזיקולת הפרשה בשלה לעומת וזיקולה לא בשלה:
בוזיקולה הלא בשלה יש מעטפת קלתרין
בוזיקולה הבשלה אין מעטפת קלתרין
220
שלש סיבות לכך שוזיקולת הפרשה במסלול מבוקר הן צפופות:
- חזרה של חתיכות ממברנה מהוזיקולה ל TGN שלוקחת איתה גם ממברנה ותוכן לומינלי
- התאחות מספר וזיקולות , וכך התוכן שלהם מתאסף ונערם
- הסביבה החומצית של הוזיקולה שגורמת לאגרגטים להיות יותר צפופים
221
הסביבה בלומן ה TGN לעומת הלומן של הוזיקולות:
ב TGN הסביבה הינה יונית ionic , וזה מעודד אגרגציה של החלבונים המיועדים להפרשה.
בוזיקולות הנוצרות הסביבה הולכת ומחמיצה עד שבוזיקולה הבשלה (חסרת הקלתרין) הסביבה חומצית דיה וגורמת לצפיפות האגרגטים לעלות.
ההחמצה של הוזיקולה היא הודות לעליה בריכוז משאבות מסוג V-type ATPase בממברנה שלה. **למעשה , משאבות אלה מחמיצות את כל הוזיקולות האנדוציטיות והאקסוציטיות בתא**.
222
עיבוד **פרוטאוליטי** של חלבונים:
הרבה חלבונים נוצרים בצורתם הלא פעילה , הם מגיעים ל TGN כשהם עדיין לא פעילים , **ורק כשהם נארזים בוזיקולת ההפרשה או מופרשים מחוץ לתא הם הופכים להיות פעילים** במנגנון של עיבוד פרוטאוליטי.
223
pre-pro-proteins:
חלבונים לא פעילים , הפעלתם מתרחשת דרך **עיבוד פרוטאוליטי**. העיבוד מתרחש בוזיקולת ההפרשה או בנוזל החוץ תאי.
ה pre-peptide מכיל רצף סיגנל בקצה ה N טרמינלי שתפקידו לכוון את החלבון ל ER
לאחר חיתוך ראשוני נותר ה pro-peptide , שמכיל רצף סיגנל בקצה N שמבקר את היצירה של החלבון הבשל.
224
Polyproteins
**מולקולת סיגנל** פפטידית שמכילה עותקים רבים של **אותו** רצף חומצות אמינו. היא אינה פעילה , ורק אחרי שעוברת מספר חיתוכים נוצרים הפפטידים הפעילים.
במקרים אחרים , אותו polyprotein מהווה פריקרסור עבור מספר חלבונים סופיים **שונים**. אותו פוליפרוטין יכול להיות מעובד באופנים שונים בתאים שונים , ולכן יניב תוצרים סופיים שונים.
225
מדוע מנגנון עיבוד פרוטאוליטי הוא כה נפוץ במסלולי הפרשה ?
1) חלק מהחלבונים בצורתם הפעילה הם קצרים מאד , וקשה לתא להתעסק איתם (כמו למשל העמסה בתוך וזיקולת הפרשה) , ולכן התא קודם מייצר אותם כשרשרת פפטידית ארוכה ורק בזמן הנכון מקצץ אותם.
2) באנזימים הידרוליטיים שמיועדים להיות מופרשים מחוץ לתא , המנגנון מבטיח שרק כשהם מופרשים הם יופעלו או לכל הפחות בתוך הוזיקולה , הדבר מספק רובד נוסף של בטיחות.
226
כיצד וזיקולות הפרשה , הן במסלול המבוקר והן במסלול הקונסטיטוטיבי מתניידות בתוך התא ?
על גבי סיבי מיקרוטובולי !!
נקח לדוגמא תא עצב , הוזיקולה נוצרת בגוף התא , ולעיתים היא צריכה לעבור מרחק רב עד קצה האקסון , הוזיקולה נישאת במצב כזה על גבי חלבון מוטורי , והם נעים יחדיו לאורך axonal microtubule עד שהם מגיעים לקצהו.
מוקרוטוהול אקסונלי הוא בעל אוריינטציה אחידה , וזה מכוון את הוסיקולה למקום הנכון.
227
ההבדל בין הפרשה קונסטיטוטיבית להפרשה מבוקרת הוא סוג סיב שלד התא שעליו הוזיקולה נעה ?
נכון / לא נכון
לא נכון ,
גם וזיקולות טרנספורט (קונסטיטוטיבי) , וגם וזיקולות הפרשה (מבוקר) נעות על גבי סיבי מיקרוטובול.
ההבדל הוא שוזיקולות טרנספורט מתאחות עם ממברנת התא ישירות איך שהן מגיעות אליה. וזיקולות הפרשה שוהות בקרבתה מבלי להתאחות , ורק בהגעת סיגנל מתאים הן יתאחו והתוכן שלהן יופרש החוצה (למשל נוירוטרנסמיטור).
228
מה גורם לוזיקולת הפרשה להתאחות עם הממברנה ?
הגעת סיגנל מסויים מחוץ לתא , הסיגנל **גורם לעליה בריכוז הסידן החופשי בציטוזול** , וזה גורם לאיחוי בין הוזיקולה לממברנת התא.
דוגמה תאי עצב
229
הפרשה מבוקרת בתאי עצב:
תאי עצב אוגרים את הנוירוטרנסמיטורים שלהם בוזיקולות הפרשה מיוחדות שנקראות וזיקולות סינפטיות synaptic vesicles.
המאפיין של וזיקולות סינפטיות זה שהן קטנות (הנוירוטרנסמיטורים בעצמם הם מולקולות קטנות)
כאשר פוטנציאל פעולה מגיע , הוא גורם לעליה בריכוז הסידן התוך תאי , הסידן מאוחסן בתוך ה ER החלק , ויציאתו לציטוזל בעקבות הגעת המתח הדהפולריזטורי מתרחשת דרך תעלות סידן תלויות מתח. העליה בריכוז הסידן בתא מעודדת איחוי בין הוזיקולה לממברנת התא.
230
וזיקולות סינפטיות:
שני מאפיינים לוזיקולות סינפטיות:
- הן קטנות יחסית לוזיקולות הפרשה רגילות
- קצה ההפרשה בתאי עצב הוא גבוה מאד
שלב האקסוציטוזה בנוירון מתרחש לפי שלבים:
**1)** שלב **עגינה** docking:
הוזיקולה מתמקמת ליד ממברנת התא אך טרם אירע איחוי
**2)** שלב **האתחול** priming:
נוצר קשר ראשוני בין חלבונים ממברנליים בטזיקולה לבין חלבונים ממברנליים בממברנת התא
**3)** שלב **האיחוי** וההפרשה
231
שלב העגינה docking:
כאשר הוזיקולה מגיעה לממברנת התא , מתמקמת בסמוך אליה אך לא נוצר בינהם איחוי עדיין
232
שלב האתחול priming:
בשלב הזה נוצר קשר ראשוני בין הוזיקולה לממברנת התא , אך טרם התרחש איחוי. **מטרת השלב הזה הוא לשמור על הוזיקולה בסמיכות לממברנה** כדי שבהגעת הסיגנל , הנוירוטרנסמיטור ישוחרר מהר.
הקישור הראשוני הזה בין הוזיקולה לממברנת התא מתרחש דרך משפחת חלבונים ממברנליים שנקראים SNARE. על ממברנת הוזיקולה יש חלבון שמסווג כ v-SNARE ועל הממברנה של התא יש שני חלבונים שמסווגים כ t-SNARE.
ה v-SNARE שעל הוזיקולה נקרא synaptobrevin , שני ה t-SNARE’s שעל ממברנת התא נקראים syntaxin ו- SNAP25
שלב האתחול מיוצב ע״י חלבונים שנקראים complexins , ששומרים ומייצבים את הקישור החלקי בין חלבוני ה v-SNARE ל t-SNARE , **וכן מונעים איחוי בין הוזיקולה לממברנה**.
233
שלב האתחול priming נחלק לשני תת שלבים:
- Priming 1
- priming 2
בשלב priming1 חלבוני ה SNARE שעל הוזיקולה ועל ממברנת התא נקשרים (דרך 4 סחיחי אלפא)
שלב priming2 הוא השלב שבו החלבון complexin נקשר לחלבוני ה SNARE ומייצב אותם , הקומפלקסין גם מונע איחוי (כלומר שומר על קישור חלקי).
234
שלב האיחוי וההפרשה:
מגיע פוטנציאל פעולה , וגורם לעליה בריכוז הסידן התוך תאי , הסידן נקשר לחלבון ממברנלי נוסף שנמצא על ממברנת הוזיקולה (אך אינו שייך למשפחת SNARE) , חלבון זה נקרא synaptotagmin. על הסינפטוטגמין יש שני אתרי קישור לסידן , וברגע שזה נקשר אליו , הסינפטוטגמין משופעל.
שפעול הסינפטוטגמין גורם לו להעיף את complexin ולקשור במקומו את חלבוני ה SNARE , גם t וגם v , אך הוא גם קושר את הפוספוליפידים של ממברנת התא. קישור יציב זה מאפשר כעת איחוי בין הוזיקולה לממברנה , וכך הנוירוטרנסמיטור מופרש החוצה
**סינפטוטגמין: סנסור לסידן**
235
האם כל הוזיקולות הסינפטיות משחררות נוירוטרנסמיטורים בבת אחת ?
בסינפסה טיפוסית רק מספר קטן של וזיקוחות העוגנות בררבת ממברנת התא מאותחלות ומוכנות לאקסוציטוזה , השימוש במספר קטן של וזיקולות מאפשר לכל סינפסה לירות שוב ושוב ברציפות מהירה. בכל ירי , וזיקולות חדשות מאותחלות ומתאחות , וחוזר חלילה.
236
שקף 13-46
חלבוני SNARE
שני החלבונים synaptobrevin ו- syntaxin הם חלבונים טרנסממברנליים. למרות שהם סוגים שונים של SNARE.
כשהם נקשרים , הם נקשרים דרך אזורים אלפא הליקליים , בעצם כל אחד מביא סליל אלפא אחד והם נקשרים. SNAP25 הוא חלבון פרפרי , והוא תורם לקישור שני סלילי אלפא:
**במהלך שלב האתחול חלבוני ה SNARE קשורים זה לזה ב 4 סלילי אלפא**
שני סלילי האלפא של ה SNAP25 מחוברים בינהם ב loop ששוכבת על הממברנה ומקבילה אליה , על ה loop ישנה גם שרשרת fatty acyl שמעוגנת לממברנה
237
מנגנון מחזור וזיקולות בתאי עצב:
בגלל הצורך בירי מהיר ושחרור נוירוטרנסמיטור בקצב גבוה , תאי עצב פיתחו מנגנון המאפשר להם למחזר במהירות רבה וזיקולות סינפטיות מהממברנה הפרה סינפטית של האקסון.
בעצם , אחרי האיחוי של הוזיקולה עם הממברנה ושחרור הנוירוטרנסמיטור , מתבצע מחזור מקומי שלה. דבר נוסף שמתרחש זה שוזיקולות טרנספורט שבמקור שייכות למסלול הקונסטיטוטיבי , מוחזרות לתא מהממברנה הפלסמטית באנדוציטוזה , אך במקום לחזור לאנדוזום המוקדם , הם מתמלאות בנוירוטרנסמיטורים שנמצאים בציטוזול והופכות מיד לוזיקולות הפרשה
238
היכן מיוצרים נוירוטרנסמיטורים ?
נוירוטרנסמיטורים קטנים כגון אצטיל כולין , גלוטמט , גליצין מיוצרים בציטוזול.
נוירו טרנסמיטורים גדולים (חלבוניים) מסונתזים ב ER ، ומועברים לסינפסה במסלול הפרשה אקסוציטי.
239
שקף 13-46
כיצד מתמלאת וזיקולה ממוחזרת בנוירוטרנסמיטור בציטוזול ?
על גבי הממברנה של הוזיקולה ישנו אנטיפורטר של פרוטונים , שמוציא פרוטון ומכניס במקומו נוירוטרנסמיטור.
הגרדיינט של הפרוטונים נשמר ע״י משאבה מסוג V type ששומרת על הריכוז פרוטונים בתוך הוזיקולה גבוה (אמרנו מקודם שבתהליך ההבשלה של הוזיקולה היא הופכת להיות חומצית)
240
בתהליך ההבשלה שלה , וזיקולה נהיית יותר חומצית מדוע ?
גבר ראשון יש לדעת שזה נכון גם לוזיקולות אסוציטיות וגם לוזיקוחות אנדוציטיות.
בוזיקולות אנדוציטיות נתקלנו בזה כאשר באנדוציטוזה מתווכת קולטן שהסביבה החומצית של האנדוזום המוקדם גורמת בעצם לשבירת הקשר בין הקולטן לליגנד.
בוזיקולות אקסוציטיות זה גורם לאגרגטים החלבוניים שבוזיקולה להיות יותר צפופים , וכן מספק כח מניע בוזיקולות סינפטיות שמאפשר הטענת נוירוטרנסמיטור קטן בציטוז , כנגד הוצאת פרוטון.
241
מבנה וזיקולת הפרשה:
7000 פוספוליפידים
5700 מולקולות כולסטרול
50 חלבונים אינטגרליים
70 עותקים של synaptobrevin
1-2 משאבת Vtype ATPase
242
אקסוציטוזה ואנדוציטוזה מתרחשות בצורה שווה:
השוויון הזה חיוני כדי לשמור על גודל והרכב קבועים יחסית של הממברנה התאית. כאשר וזיקולה מתאחה עם הממברנה החלבונים והפוספוליפידים שלה עוברים לממברנה , אך מהר מאד מוסרים בתהליך אנדוציטי.
לעיתים , כמו בתאי לבלב , בגלל ההפרשות הרבות שהוא עושה , ממברנת התא מקבלת כמות גדולה של וזיקולות הפרשה , ולכן באופן זמני המימדים שלה גדלים.
243
האם בכל התאים קיים שיווי משקל בין אקסוציטוזה לאנדוציטוזה ?
לא !
לעיתים צריך להגביר את האקסוציטוז כדי לענות על צורכי התא.
1) אם התא צריך לגדול (נגיד בשלבי G1) אז יהיה יותר מסלולי הפרשה מאשר אנדוציטוזה , כי הממברנה של התא צריכה לגדול.
2) בתהליך ההבשלה של עוברי זבוב , נקרא cellularization שבו תא syncytium שמכיל 6000 גרעינים מתחלק מהר כדי ליצור תאים רבים בגודל שווה
3) בתהליך הציטוקנזה , כדי שתאי הבת הנוצרים יגדלו
4) תאים שנמצאים תחת לחץ מכני דורשים מדי פעם אספקה של וזיקולות לתיקון קרעים שנוצרים בממברנה (מנגנון תיקון זה תלוי בסידן).
5) פאגוציטוזה
244
אקסוציטוזה בתאים פולריים:
תאים פולריים מכילים שני דומיינים ממברנליים לכל הפחות , אפיקלי ובאזולטרלי , שמופרדים זה מזה בעזרת tight junctions.
הרכבו של כל דומיין שונה מהשני , שוני זה נשמר הן באופן ישיר כשוזיקולות מראש מיועדות לדומיין ואז מגיעות אליו על סמך סיגנל שיש להם (שקף 294)
או שהוזיקולות באופן אקראי פשוט מגיעות לממברנה , לא משנה לאיזה דומיין , ואז יש סידור מחדש דרך האנדוזום המוקדם , כלומר וזיקולה מגיעה למקום באופן אקראי , אם זה אינו הדומיין שלה , היא תתנתק באנדוציטוזה , תגיע לאנדוזום המוקדם וממנו לדומיין הנכון (שקף 293)
245
אקסוציטוזה מכוונת לצד אפיקלי:
הצד האפיקלי עשיר בגליקוספינגוליפידים glycosphingolipids וחלבונים עם עוגן GPI
חלבונים המעוגנים לממברנה דרך GPI מועברים לצד האפיקלי באופן ישיר דרך lipid rafts הקיימות ב TGN , ה lipid rafts האלה בנויות מגליקוספינגוליפידים וכולסטרול , עוברות לתוך וזיקולות טרנספורט , ואז מגיעות לממברנה האפיקלית.
246
אקסוזום:
אקסוזומים הם וזיקולות קטנות (עד 100 ננומטר בקוטר) שמשוחררות **לסביבה החוץ תאית** באקסוציטוזה.
הם מכילים חלבונים , מולקולות סיגנל , ואםילו microRNA. ניתן לבודד אקסוזומים מנוזלי הגוף כגון שתן וסרום.
הם משמשים בעיקר לשחרור פסולת וטוקסינים , וכן במסלולי תקשורת אנדוקריניים.
תאי סרטן משחררים לדם כמות גדולה של אקסוזומים , באופן זה גידול סרטני מכין את הקרקע לתהליך גרורתי.
247
תנועת חלבונים בין מדורים:
כל חלבון , אלא אם כן מכיל סיגנל שאומר אחרת , יתחיל סנתזה בציטוזול וישאר בציטוזול !!
מלבד חלבונים שמסונתזים במיטוכונדריה ובפלסטיד , **כל חלבון בתא מתחיל את הסנתזה בציטוזול** , חלק מהחלבונים מכילים רצפי מיון sorting signals שמכוונים אותם לאזורים / מדורים שונים בתא.
רצף ה sorting הוא רצף סיגנל , בעצם רצף חומצות אמינו במבנה החלבון שמורה על המקום הסופי אחיו החלבון צריך להגיע.
חלבון לחא סיגנל נשאר בציטוזול
248
כיצד חלבונים נעים בין מדורים ?
ישנם 4 דרכים בהם חלבונים נעים בין מדורים:
1) translocation טרנסלוקציה
2) gated transport
3) vesicular transport
4) engulfment
249
טרנסלוקציה:
אחת מיני 4 דרכים בהם חלבונים נעים בין מדורים שונים. חלבונים עוברים **בטרנסלוקציה** בין שני מדורים **שאינם אקוויולנטים טופולוגיים**. בד״כ החלבון מועבר בעודו פרוס , ומשתחל דרך הטרנסלוקטור.
דוגמאות: טרנסלוקציה ללומן של ה ER , לממברנת ה ER , למיטוכונדריה
250
Gated transport:
אחת מיני 4 דרכים בהם חלבונים נעים בין מדורים שונים.
**מתרחשת בין מדורים שהם אקוויולנטים טופולוגיים**.
דוגמה: מעבר של חלבונים ורנא בין הציטוזול לגרעין דרך NPC. ה NPC הוא בגדר שער סלקטיבי שמאפשר למולקולות מסויימות להיכנס ודוחה אחרות.
251
הולכה וזיקולרית;
Vesicular transport
המעבר בין המדורים נעשה דרך ״מתווכי ביניים עטופי ממברנה״ - הלא הן הוזיקולות.
המורפולוגיה של הוזיקולות יכולה להשתנות , מוזיקולות קטנות ועגולות , צינורות מוארכים , ועד למבנים גדולים המכילים שברי אברונים. כמו כן , תוכן הוזיקולות יכול להשתנות.
**טרנספורט דרך וזיקולות מתרחש בין מדורים אקויוולנטים מבחינה טופולוגית**.
**במסלול זה , ה cargo אינו חוצה שום ממברנה**
דוגמה: המעבר בין ER לגולג׳י
252
טרנספורט על ידי וזיקולות;
- מתרחש בין אקוויולנטים טופולוגיים
- ה cargo אינו חוצה שום ממברנה בדרך
- הכיווניות של חלבונים ולפידים נשמרת בין המדור המקורי למדור המקבל (מד מיטוזולי נשאר בצד הציטוזולי)
253
Engulfment
אחת מיני 4 דרכים בהם חלבונים נעים בין מדורים שונים.
במנגנון זה ממברנה דו שכבתית מאגפת איזורים בציטופלסמה שבדרך כלל יכילו שברי אורגנלות , או אפילו אורגנלות שלמות , המבנה נאטם מסביב לציטופלסמה ונוצר אוטופאגוזום.
דוגמאות:
העברת חלבונים מהציטוזול לליזוזום באוטופאגיה
יצירה מחדש של מעטפת הגרעין לאחר מיטוזה מתרחשת כך , ממברנת ה ER מאגפת אזור בציטופלסמה שיש בו כרומוזומים שעברו דה קונדנסציה , לאיר מכן הממברנה מתאחה וכך נוצרת מעטפת הגרעין
254
שקף 312 + 313
מפת הדרכים
255
מעבר חלבונים בין מדורים שונים:
קונדנסט
קיימת דרך רביעית שבה ישנו מעבר של חלבונים בין מדורים , וזה בעצם כאשר מולקולה מסויימת קושרת באופן ישיר רכיב של קונדנסט - חלבון או רנא - ואז נכנסת איתו לתוך הקונדנסט.
**במסלול מעבר זה אין בכלל חציה של ממברנות בשום צורה ואופן**
משנכנסה לקונדנסט , המולקולה נשארת קשורה לפרטנר שלה , וכך בעצם הקונדנסט הופך להיות הבית החדש שלה.
256
Sorting signal:
רצף חומצות אמינו שקיים בחלבון , ולפיו התא יודע מהו האזור אליו צריך להגיע החלבון , sorting signal נחלק לשני סוגים:
- signal sequence
- signal patch
ה signal sequence הוא רצף **לינארי** של חומצות אמינו , משמש בתהליך **טרנסלוקציה**.
ה signal patch הוא סידור מרחבי **וספציפי** של חומצות אמינו , קיים בטרנספורט לגרעין ובטרנספורט וזיקולארי.
257
תכונות רצף הסיגנל:
signal sequence
- לינארי
- **לרוב** יימצא בקצה ה N טרמינלי
- משמש בתהליכי **טרנסלוקציה**
במידה ורצף הסיגנל אכן נמצא בקצה ה N טרמינלי של החלבון המועבר , הוא יוסר **בתום תהליך הטרנסלוקציה** ע״י סיגנל פפטידאזות signal peptidase , אם הוא נמצא במקום אחר בחלבון מלבד קצה N , הוא נשאר כחחק מהחלבון הבוגר.
258
רצף הסיגנל ל ER:
ישנם מספר רצפי סיגנל המכוונים חלבונים מהציטוזול ל ER , **המשותף לכולם הוא שכל רצף סיגנל כזה יכיל בין 5 ל 10 חומצות אמינו לינאריות והידרופוביות** , מין טביעת אצבע כזאת…
מרבית החלבונים שמגיעים ל ER ימשיכו ממנו לגולג׳י , אלא אם כן **על החלבון יש סיגנל ספיציפי של 4 חומצות אמינו בקצה ה C טרמינלי** וכך הוא מזוהה כ resident של ה ER ובמידה ויצא לגולג׳י , אז הוא יחזור אליו.
259
רצף סיגנל למיטוכונדריה:
אז גם למיטוכונדריה מעבר החלבונים מתרחש דרך טרנסלוקציה.
רצף הסיגנל בנוי מחומצות אמינו טעונות חיובית המתחלפות לסירוגין עם חומצות אמינו הידרופוביות.
260
רצף סיגנל לגרעין:
מורכב בעיקר מחומצות אמינו חיוביות
261
חלבונים שמיועדים לפרוקסיזום:
בעלי רצף סיגנל של חומצות אמינו ספיציפיות בקצה ה C טרמינלי שלהם.
262
רצפי סיגנל בחלבונים המיועדים לאותו מדור:
רצפי הסיגנל יכולים להיות שונים מעט מבחינת רצף חומצות האמינו שמרכיבים אותם , אולם נראה שלמרות השוני ברצף , **התכונות של חומצות האמינו יהיו דומות מאד** , כך שנראה שכל סוגי הרצפים למדור נתון יכילו חומצות אמינו הידרופוביות למשל , או טעונות חיובית.
263
Sorting receptors:
רצפטורים שתפקידם לזהות ולקשור את החלבון הרלוונטי , לפי רצף ביגנל שיש עליו , ולהביאו למדור הנכון.
רצפטורים אלה עובדים בצורה מחזורית , כלומר ברגע שהם הביאו את ה cargo ליעד שלו , הם חוזרים למדור המקורי שלהם.
נתון מעניין הוא **שהרצפטורים האלה מזהים קבוצות חלבונים יותר מאשר סוג מסויים**
264
חלבוני Rab ותנועת וזיקולות:
**רוב התנועה בתוך התא מתרחשת ע״י וזיקולות**.
הממברנה של הוזיקולה היא ממברנה טיפוסית שבנויה מליפידים וחלבונים.
מספר שחקנים משתתפים בטרנספורט הזה:
1) חלבוני SNARE שנמצאים על ממברנת הוזיקולה וממברנת התא ומתווכים את תהליך האיחוי
2) סיבי מיקרוטובולי שמספקים את המסילה עליה הוזיקולה נעה
3) חלבוני Rab (חלבון G מונומרי) שיוצרים את הקשר הראשוני בין הוזיקולה לאתר המטרה.
265
וזיקולות יכולות לנוע בתוך התא ב 4 צורות אפשריות:
1) תנועה קדימה , נקראת גם **anterograde**, למשל תנועה מה ER ל CGN בגולג׳י
2) תנועה אחורה , **retrograde** , למשל חזרה מה CGN לגולג׳י. אני רואה בשקף 311 שאין חזרה ישירה מה TGN ל ER
3) הפרשה , secretion , תהליך האקסוציטוזה. מעבר וזיקולות מה TGN לממברנת התא , או לליזוזום
4) אנדוציטוזה: כניסה פנימה מחוץ התא , מהממברנה לאנדוזום , וממנו לליזוזום (במישרין או בעקיפין).
266
כמה מדורים תאיים משתתפים בטרנספורט וזיקולרי ?
טרנספורט וזיקולרי מתווך חילוף מרכיבים מתמשך בין **10 מדורים תאיים** עטופים בממברנה.
למרות חילוף החומרים (דרך וזיקולות) בין המדורים השונים , הממברנות שלהם שומרות על זהות ייחודית מבחינת סימנים מולקולריים , כלומר , הרכב חלבונים ושומנים ספיציפיים , המוצגים **על פני השטח הציטוזוליים של הממברנה**
לפי סימנים מולקולריים אלה , וזיקולות גם יודעות לעגון במקום הנכון , וגם כאשר מנצות , יודעות לאן ללכת.
267
וזיקולות טרנספורט יהיו עטופות במעטפת חלבונית:
**רוב וזיקולות הטרנספורט נוצרות מאזורים ספיציפיים ומיוחדים של הממברנה**. הן מנצות כוזיקולות עטופות (coated vesicles) בכלוב ייחודי של חלבונים המכסים את הצד הציטוזולי שלהם , אך לפני שהוזיקולה מגיעה ליעד שלה , היא מורידה מעליה את הכלוב החלבוני הזה , כך שהממברנה שלה תוכל להתאחות עם ממברנת התא / אברון
268
Coated vesicles:
וזיקולות עטופות
כאמור המעטפת היא מעטפת חלבונית , והיא דו שכבתית.
השכבה הפנימית של המעטפת נועדה לגייס לאזור הנכון של הממברנה (ממנו תנץ הוסיקולה) את החלבונים הממברנליים הנכונים שישתתפו בתהליך כגון רצפטורים , חלבוני SNARE וכו. בכך היא בעקיפין גם משפיעה על איזה חלבונים מהלומן הוזיקולה תכיל.
השכבה החיצונית , מתאספת על פני הממברנה בצורה של סריג או כלוב , מעוותת את המבנה שלה והכך מעצב את צורת הוזיקולה.
269
וזיקולת טרנספורט יכולה להיווצר מכל אזור של הממברנה ?
לא נכון ,
היא מנצה מאזורים מיוחדים , שבהם ישנה המעטפת החלבונית הדו שכבתית.
270
ישנם 4 סוגים של שכבה חלבונית:
כאמור רוב וזיקולות הטרנספורט בתא יהיו עטופות במעטפת חלבונית דו שכבתית , שיורדת מהוזיקולה בטרם ההגעה לאברון היעד , ישנם 4 סוגים של מעטפת חלבונית:
- clathrin
- COP1
- COP2
- retromer
271
Clathrin:
קלתרין
מעטפת חלבונית דו שכבתית המלווה וזיקולות טרנספורט **מהגולג׳י , אנדוזום , וממברנת הפלסמה**
היכן נראה קלתרין:
- הנצה מה TGN לאנדוזום
- הנצה מה TGN לממברנת התא
- אנדוציטוזה ממברנת התא לאנדוזום המוקדם
שקף 317 רואים חתיכת גולג׳י שנעה לכיוון הממברנה , כנראה כדי לתקן קרעים וכו , **זו אינה עטופה בקלתרין**.
272
COP1:
מעטפת חלבונית חד שכבתית המלווה תנועת retrograde של וזיקולות טרנספורט מה CGN חזרה ל ER
מעטפת חלבונית זו ייחודית בכך שהיא מורכבת משתי שכבות בפועל , אולם שכבות אלה בונות יחדיו קומפלקס שנקרא קוטמר coatomer ולכן מתייחסים אליהם כאל שכבה אחת.
תפקידי ה COP1 זה למחזר חלבונים רזידנטים של ה ER שדלפו ממנו לגולג׳י. או למחזר חלבוני SNARE ורצפטורים מנברנליים של ממברנת ה ER שהגיעו ל CGN במהלך הטרנספורט.
273
COP2:
מעטפת חלבונית דו שכבתית שמשתתפת בתובלת anterograde של וזיקולות מה ER אל ה CGN
מעטפת זו גם מלווה וזיקולות שמתקדמות מה CGN בכיוון ה TGN
274
אזורים שונים בתא שמשתמשים באותו סוג של מעטפת חלבונית , יכילו תת יחידות שונות של החלבונים שבונים אותה
כמו למשל תת יחידות שונות של קלתרין וכו׳
275
סוגים שונים של מעטפות חלבוניות:
נקח את המעטפת החלבונית COP1. מעטפת זו מלווה חלבונים במסלול retrograde מה CGN ל ER
נבדיל בין שני מצבים:
1) אם החלבון שצריך לחזור ל ER הוא חלבון **ממברנלי** , נראה שעל החלבון יש רצף חומצות אמינו מיוחד , KKXX , בקצה ה C טרמינלי שלו.
**במקרה כזה , החלבון יקשור את COP1 ישירות**
2) אם החלבון שצריך לחזור ל ER הוא חלבון לומינלי , נמצא בקצה הקרבוקסילי שלו רצף KDEL. דוגמאות BiP ו- PDI
חלבוני KDEL אינם קושרים את COP1 ישירות כמו חלבוני KKXX, אלא שהם נקשרים לרצפטור ממברנלי מיוחד , נקרא KDEL receptor , שהוא multipass
276
רצף KDEL:
אחד משני רצפי **retrieve** שיש על חלבוני ה ER
הרצף השני KKXX הוא רצף שקיים על חלבונים ממברנליים , בעוד KDEL נממא על חלבונים מסיסים.
הוא נקשר לרצפטור מיוחד בממברנה , KDEL receptor. בגולג׳י היכן שהסביבה טיפה חומצית (pH טיפה נמוך) האפיניות בין החלבון לרצפטור תהיה גבוהה ולכן הם יקשרו.
בהגעה ל ER , היכן שהסביבה היא פחות חומצית (pH יותר גבוה מהגולג׳י) האפיניות תרד , ולכן החלבון משתחרר.
277
KDEL receptor:
רצפטור ממברנלי , multipass , קושר חלבונים לומינליים שיש להם רצף KDEL בקצה הקרבוקסילי שלהם.
ברצפטור ישנה חומצה אמינית מסוג היסטדין שקריטית לקישור של חלבוני KDEL , בגולג׳י , היכן שהסביבה חומצית מעט יחסית ל ER , ההיסטדין תהיה במצב protonsted , ותקשור את החלבון באפיניות גבוהה , ב ER , הסביבה מעט בסיסית יותר , ה pH הגבוה ממיר את ההסטדין למצב de protonsted והיא משחררת את החלבון
278
שקף 321
COP1 and KDEL receptor
מעטפת COP1 קיימת הן בגולג׳י , ב CGN , והן בצורון ביניים שנקרא vesicular tubular clustr שנמצא פיזית בין ה ER לגולג׳י עצמו.
בשני הצורונים חלבונים לומינליים של ה ER נקשרים ל KDEL receptor ומובאים חזרה ל ER.
בעת קישור החלבון שלו , ה KDEL רצפטור משנה קונפורמציה כדי שיהיה לו יותר קל להיכנס לוזיקולה.
279
הצורונים בהם יש KDEL receptor:
- golgi
- ER
- vesicular tubular cluster
280
מהם תפקידיו של רצף KDEL ?
הרצף הזה חיוני לשמירת חלבונים ב ER , אך עיקר תפקידו הוא **להחזיר** חלבונים שנמלטו.
אם מורידים את רצף KDEL מהחלבונים , הם יופרשו מה ER אך בקצב איטי יותר מחלבונים רגילים , נשמע יש מנגנון ששומר אותם ב ER ומעכב את הפרשתם.
מנגנון זה הוא יצירת אגרגטים , מנגנון נפוץ בהרבה אברונים ולא יחודי ל ER , כאשר חלבונים לומינליים מתקבצים יחדיו ליצירת אגרגטים שהם גדולים מדי כדי להיכנס לוזיקולות , ובכך האברון שומר אותם אצלו.
281
מבנה וזיקולה שעטופה ב COP2:
מעטפת COP2 משמשת בוזיקולות anterograde. מעטפת זו אופיינית לוזיקולות שיש בהם מטען גדול יחסית
282
שקף 323
פיגר 13-16
חלבוני SEC23/24 הם החלבונים שבונים את השכבה הפנימית של מעטפת COP2.
את השכבה החיצונית בונים חלבוני הציפוי SEC13/31
כתלות בגודל וסוג המטען , צורת ההתארגנות של חלבונים אלה משתנה , ועל כן צורת הכחוב שבונה COP2
אם ה cargo שהוזיקולה צריכה להכיל הוא גדול , החלבונים יתארגנו באופן שהוזיקולה תהיה צינורית יותר מאשר כדורית
283
יציאה מה ER בעזרת COP2:
אמרנו מקודם שהיווצרות הוזיקולה בממברנה של אברון מסויים אינה יכולה להתרחש מכל מקום , אלא מאזורים מיוחדים בממברנה. ב ER , אזור היווצרות הוזיקולה והנצתה נקרא ER exit site.
אחד במאפיינים של ממברנת ה ER באזור ה exit site זה שהיא חסרת ריבוזומים.
284
ישנם 3 סוגי חלבונים שיוצאים מה ER בעזרת וזיקולה:
1) חלבונים טרנסממברנליים , אלה **מכילים סיגנל יציאה**. הם מזוהים ע״י חלבוני השכבה הפנימית של COP2 , מגוייסים לאזור היציאה בממברנה ובכך יוצאים מה ER
2) חלבונים לומינליים מסיסים , **מכילים סיגנל יציאה** , אלה נקשרים לרצפטורים טרנסממברנליים (שחלקם גויסו בסעיף 1) , נקשרים אליהם ובכך יוצאים בתוך הוזיקולה.
3) חלבונים **ללא סיגנל יציאה** שבטעות נכנסים לוזיקולה , אלה יכילו רצף retrieve שיחזיר אותם ל ER (שני רצפי סיגנל KKXX ו KDEL)
285
**תנאי הכרחי ליציאה מה ER זה שהחלבון התקפל כמו שצריך**.
התא מייצר הרבה יותר חלבונים ממה שהוא צריך באמת , אך הוא בוחר את הכי טובים ומשתמש בהם , ואת השאר הוא הורס
מחלת ה CF מתפתחת הודות למנגנון בקרת איכות זה. הטרנספורט שנוצר מכיל פגם מינורי שלא מונע ממנו בפועל לתפקד , אך בגלל שהתא הורס את החלבונים הלא מושלמים שנוצרים בו , הוא הורס את הטרנספורטר הזה , וכך אנשים מפתחים את המחלה.
286
איחוי וזיקולות:
אנחנו רואים כבר כמה דוגמאות שבהם וזיקולות מתאחות במהלך מסלולי הטרנספורט השונים. כמו למשל איחוי וזיקולה שמכילה חלבונים הידרוליטיים עם האנדוזום ליצירת האנדוליזוזום או הליזוזום …
אנחנו גם מגלים שוזיקולות לאחר שיצאו מה ER ושלו מעליהם את מעטפת COP2 הם מתאחות יחדיו.
**איחוי homotypic**: כאשר וזיקולות מאותו מדור מתאחות (למשל וזיקולות מה ER)
**איחוי heterotypic**: כאשר וזיקולות ממדורים שונים מתאחות.
בשני הסוגים נדרשים חלבוני SNARE , בהומוטיפי , האינטראקציה היא סימטרית , כל וזיקולה תורמת v-SNARE אחד , ושלשה t-SNARE
287
ההבדל בין t-SNARE ל v-SNARE זה שהראשון קיים רק בממברנת התא , והשני קיים רק בוזיקולות:
לא נכון ,
שני הסוגים קיימים בוזיקולות. ה t היא כנגד target , והיא קיימת על כל ממברנה אשר מקבלת וזיקולה מאברון כלשהו , זה יכול להיות ממברנת התא כגון מסלולי הפרשה , או ממברנה של וזיקולה אחרת , כגון איחוי הומוטיפי
חלבוני v קיימים רק על הוזיקולה , v הוא כנגד vesicle
288
Vesicular tubular cluster:
וזיקולות שמניצות מה ER שלות מעליהם את מעטפת COP2 והממברנות שלהם מתאחות באופן הומוטיפי homotypic
הוזיקולות המתאחות האלה יוצרות מבנה שנקרא VTC או vesicular tubular cluster , הקלאסטר אינו תפקודי , אין ריאקציות יחודיות שמתרחשות בו והוא חסר הרבה מהחלבונים שפעילים ב ER. הוא נע על גבי המיקרוטובול במהירות ומגיע לגולג׳י. בזמן שהוא מתקדם ה VTC עובר תהליך הבשלה , בעצם הוא שולח במסלול retrograde וזיקולות חזרה ל ER שמכילות חלבוני רזידנט רצפטורים וכו׳ ועטופות ב COP1. מאחוריו נוצרים קלאסטרים חדשים ע״י וזיקולות חדשות שהנצו מה ER
שקף 329
289
איזה חלבון מעטפת יש על ה vesicular tubulr cluster:
COP1
הרכבת כלוב COP1 מתחילה שניות בודדות לאחר הורדת מעטפת COP2
290
שני מודלים שמדגימים מעבר וזיקולות בין הציסטרנות בגולג׳י:
1) **מנגנון טרנספורט של וזיקולות**: המודל מציע שהציסטרנות בגולג׳י נותרות סטטיות ולא זזות , **ולכל ציסטרנה יש הרכב חלבוני רזידנט משלה שאינו משתנה.** וזיקולות שהגיעו מה ER מתאחות ב CGN , מה CGN יוצאות וזיקולות שמכילות חלבונים לציסטרנה שלפניהם בכיוון טרנס , וזו שולחת וזיקולה לזו שלפניה וכן הלאה. כך בכל ציסטרנה נשמר הרכב חלבונים יחודי שעושים מודיפיקציות ספיציפיות על החלבונים שהתקבלו. המודל מציע כי COP1 משמש במעבר של הוזיקולות , הן קדימה והן אחורה.
2) **מנגנון מטורציה של הציסטרנות**:
כאשר ה VTC מגיע ל CGN , הוא הופך להיות ציסטרנת ה cis הטרמינלית , וזו שהייתה לפני מתקדמת מעט קדימה , וכן הלאה , בכל פעם שמגיע VTC חדש , הציסטרנות מתקדמות שלב עד שלבסוף יוצאות וזיקולות מה TGN. במהלך התקדמותה הציסטרנה מבשילה בכך שהיא משנה את הרכב החלבונים שלה , היא בעצם מקבלת חלבונים בוזיקולות מציסטרנות יותר טרנסיות , וכן שולחת אחורה חלבונים בוזיקולות יותר ציסיות. בכל מקרה השימוש הוא ב COP1
שקף 331
291
חלבוני GTPase **מונומריים** מווסתים יצירת מעטפת חלבונית:
אמרנו מקודם שלא מכל מקום בממברנה תתכן היווצרות וזיקולות , אלא באזורים מיוחדים שבהם נמצאים רכיבי המעטפת החלבונית שמכסה את הוזיקולה בתחילת דרכה
**בקלתרין:** ייצור מקומי של פוספוליפידים מסוג **PIP** מעודד היווצרות וזיקולות בממברנה הפלסמטית , ועל ממברנת הגולג׳י. וחלבוני GTPase מעודדים היווצרות מעטפת קלתרין על אנדוזומים.
חלבוני GTPase מעודדים היווצרות COP1 בגולג׳י , COP2 ב ER , רטרומר באנדוזום , קלתרין באנדוזום.
292
חלבוני GTPase **מונומריים** מווסתים יצירת מעטפת חלבונית:
חלבונים אלה כאמור הם מונומריים , הם נקראים coat recruitment GTPase , ויש 3 סוגים שלהם:
- SAR1
- ARF
- Rab7
חלבונים אלה נמנים עם משפחת חלבונים כדולה , GTP binding proteins , שבתאים יורריוטים פועלים כמתגים מולקולריים העוברים בין מצבים פעילים קושרי גטפ , למצבים לא פעילים קושרי גדפ.
המעבר ממב פעיל למצב לא פעיל הוא דרך שני החלבונים GEF שמדליק אותם (מחליף גדפ בגטפ) , ו GAP שמכבה אותם (מזרז הידרוליזה של גטפ לגדפ)
293
יצירת וזיקולות COP2 ב ER:
שקף 336
1) מתחילים מה SAR1 GTPase בצורתו הלא פעילה והמסיסה , SAR1-GDP שנמצא בציטוזול.
2) בשלב הבא הקומפלקס SAR1-GDP קושר חלבון GEF שנמצא בממברנה של ה ER.
אני שם לב ש GEF תמיד קשור למשהו בתא!!
3) החלבון GEF מחליף את הגדפ הקושר את SAR1 בגטפ , וככה מקבלים SAR1-GTP
4) קשירת הגטפ לSAR1 משנה את הקונפורמציה שלו וגורמת לו לחשוף הליקס **אמפיפילי** שעד כה היה מוסתר, אזור זה מאפשר לו לקשור את ממברנת ה ER מבחוץ
5) ברגע ש SAR1-GTP הפעיל קושר את הממברנה מבחוץ , היא מתכופפת
6) הקומפלקס מגייס את שני החלבונים SEC23/24 שמרכיבים את **השכבה הפנימית** של COP2 , כאשר sec23 נקשר ישירות ל SAR , ו sec24 נקשר ל sec23 מצד אחד ולרצפטור טרנסממברנלי מצד שני , שאליו יקשר ה cargo
הקישור של sec23/24 מכופף את הממברנה עוד יותר
7) כעת מגוייסים החלבונים sec13/31 שבונים את השכבה החיצונית של COP2 , אלה גורמים להנצה.
קומפלקס החלבונים sec13/31 בונים כלוב חלבוני סימטרי כמו קלתרין
294
מתי המעטפת החלבונית , קלתרין , COP1 ו- COP2 יורדות מהוזיקולה ?
ב COP2 זה קורה בשלב יחסית מאוחר כאשר הוזיקולה נמצאת קרוב לאברון המטרה. מנגד , קלתרין ו COP1 יורדים מהר מאד , ברגע שהוזיקולה הנצה.
הפירוק הזה מתרחש בשלבים , ע״י חלבון שנקרא coat recruitment GTPase , שנמצא בוזיקולה עצמה , הוא עושה הידרוליזה של הגטפ שעל SAR1 לכדי גדפ , מה שיגרום לו לצאת מהממברנה (כשהוא קושר גדפ הוא מסיס) , וזה מערער את מבנה המעטפת , **כשתעגון** (לפני האיחוי) קינאז בממברנת המטרה יזרחן אותה וישחים את פירוקה.
חלבונים אלה גם קובעים את משך הזמן שיחלוף עד פירוק המעטפת.
295
ה ARF GTPase אחראי על בניית מעטפת COP1 וקלתרין בגולג׳י:
מה שמאפיין מעטפות COP1 וקלתרין זה שהם מוסרות מיד לאחר ההנצה.
הטריגר להרס מעטפת COP1 הוא העקמומיות שנוצרת בממברנה לאחר היווצרות הוזיקולה. בעצם , מגיע לממברנה קומפלקס של GAP-ARF שיוצר קשר עם הפוספוליפידים וחש את צפיפותם , כאשר הוא יש שהעקמומיות של הממברנה מדמה את זו של וזיקולה (עדות לכך שנוצרה וזיקולה) ה GAP כורם ל ARF לבקע את הגטפ שלו לכדי גדפ , וזה מוביל להרס המעטפת.
296
חלבוני rab מנחים וזיקולות באופן ספיציפי לאתר המטרה:
בציטופלזמה יש המוווווון וזיקולות שנעות ממקום למקום בו״ז.
וזיקולות אלה מתנגדות זו בזו , אך לא נוצר איחוי וזו כי צהליך האיחוי הינו ספיציפי. הוזיקולה מציגה על פני הממברנה שלה מרקרים המלמדים על המקור שלה ומה המטען אותו היא נושאת. באתר המטרה , הממברנה תציג רצפטור משלים למרקר שעל פני הוזיקולה.
קיימים שני סוגי מרקרים:
- rab
- SNARE
297
חלבונים ממשפחת rab ו- SNARE הם מרקרים ממברנליים:
חלבוני rab מהווים מרקר שנמצא על פני ממברנת הוזיקולה , תפקידו של rab הוא להכווין את הוזיקולה לעמדות ספיציפיות על ממברנת היעד.
תפקיד חלבוני SNARE הוא , לאחר שהוזיקולה הגיעה ליעד שלה , לתווך את האיחוי בינהם
298
חלבוני GTPase מונומריים:
- rab
- Rho
- Rac
- cdc42
- Ras
- Ran
299
תפקיד חלבוני rab בטרנספורט ויזיקולרי:
על כל אברון בתא **ישנו לפחות חלבון rab אחד** על העלעל **הציטוזולי** שלו
כמו כן , על וזיקולות שונות נמצא צירוף חלבוני rab שונים.
התפוצה **הסלקטיבית** של חלבוני rab הופכת אותם למרקרים ממברנליים שמכתיבים אינטראקציות בין וזיקולות , אברונוים וכו׳ במערכת הטרנספורט התאית.
300
חלבוני rab נעים בין מצב פעיל למצב לא פעיל:
חלבוני rab הם ממשפחת ה GTPase
**כאשר הם קושרים גדפ:** במצב זה הם **אינם פעילים** , הם קשורים לחלבון נוסף שנקרא GDI שמעכב אותם ושומר אותם מסיסים ולא פעילים בציטוזול.
**במצב הפעיל** , הם קושרים GEF שנמצא בעצמו על הממברנה , ה GEF ממיר את הגדפ לגטפ , ומפעיל אותם.
במצבם הפעיל , חלבוני rab קשורים לממברנה דרך עוגן לפידי
301
היכן נמצא את הקומפלקס rab-GDP-GDI ?
בציטוזול ,
זהו המצב הבלתי פעיל של חלבוני rab
302
Rab effectors
חלבונים ממברנליים **בעלי מבנה סיבי** ש rab במצבו הפעיל נקשר אליהם (כשהוא נמצא על הממברנה).
חלבוני SNARE נחשבים rab effectors
303
קיימים שני סוגי חלבונים שהם rab effectors:
**חלבוני tethering** חחבונים שממוקמים בממברנת המטרה , הם ״לוכדים״ את הוזיקולה דרך קישור לחחבון rab שעל הממברנה של במרחק של 200 ננומטר
**חלבוני מנוע** , אלה קושרים את חלבוני ה rab שעל ממברנת הוזיקולה , ומניעים אותה על פני סיבי אקטין / מיקרוטובולי לעבר אתר המטרה
304
מדוע חלבון rab מופעל חייב להיות על ממברנת הוסיקולה ?
נוכחותו על ממברנת הוזיקולה במצבו הפעיל מאפשרת לחלבוני rab effector לקשור אותו ולכוון את הוזיקולה ליעדה הנכון.
305
שקף 347
חלבוני rab
בממברנת הוזיקולה נמצא:
- קומפלקס rab-GTP
- חלבון v-SNARE
- הרצפטור של ה cargo
לפי השקף , הקישור בין rab ל rab effector הוא האחראי על שלב ה docking (עגינה) , הקישור של חלבוני SNARE אחראי על האיחוי
306
היכן נמצאים חלבוני rab פעילים ?
על ממברנת הוזיקולה ו/או על ממברנת המטרה.
במקרה כזה הם קושרים גטפ
307
Rab-GAP
במהלך האיחוי בין שתי וזיקולות הוא מבקע את ה גטפ לכדי גדפ וגורם ל rab להתנתק מהממברנה ולחזור לציטוזול
בציטוזל rab-DGP נקשר ל GDI ונשאר במצב הזה
308
מחזור חלבוני SNARE:
האיחוי מתווך ע״י חלבוני SNARE
כדי למחזר אותם , יש צורך לנתק את הקשר שנוצר בינהם , ולהכין אותם לסבב נוסף. מי שעושה זאת הוא חלבון שנקרא NSF שמפרק את הקשר תמורת ביקוע מולק אטפ
אסוציאציה: NSF = שובר
309
NSF:
הוא חלבון ATPase , ממשפחת ה AAA
בעת שבירת הקשר בין חלבוני SNARE הוא דורש חלבון אקסיסורי
310
חלבוני AAA:
הם משפחה של ATPase , נתקלנו במשפחה הזאת ב 3 מקומות:
- מחזור חלבוני SNARE ע״י NSF
- בפרוטאוזום , מתפקד כ unfoldase
- מושך חלבונים מה ER לציטוזול ברטרו טרנסלוקציה
311
מה עולה בגורל חלבוני v-SNARE אחרי ש NSF מפרק בינם לבין t-SNAREs ?
ממוחזרים לאברון המקורי שלהם , שם הם משתתפים בסבב נוסף של טרנספורט וזיקולרי
312
תגובת האיחוי בין חלבוני SNARE דורשת אנרגיה:
צריכת האנרגיה היא לא באיחוי עצמו , אלא בפירוק שלו , והיא מגיעה בצורת ביקוע של מולקולת אטפ ע״י NSF
313
ההרכבה של חלבוני rab וה effectors שלהם הינה תהליך קאופרטיבי:
לדוגמה rab5 שנמצא על ממברנת האנדוזום , ברגע שהוא נקשר ל GEF ומופעל (מתנתק מ GDI) , הוא מגייס חלבוני effectors נוספים , ועוד חלבוני GEF וכך נוצר מעגל פידבק חיובי.
כמו כן rab5 מפעיל PI3 kinase שבתורו שמזרחן פוספוליפיד בממברנה וממיר אותו ל PI3P וזה מפעיל עוד effectors
314
שקף 351:
הקישור של GEF ל ran-GDP-GDI ממיר את הגדפ ב גטפ וזה גורם לשחרור ה GDI
חלבוני rab5 מקבלים וזיקולות אינדוציטיות מהממברנה הפלסמטית לאנדוזום
חלבוני rab4 ו- rab11 מסייעות במחזור וזיקולות מהאנדוזום לממברנה
חלבוני rab7 מארגן וזיקולות רטרומר לגולג׳י
315
ההבדל בין חלבוני rab לחלבוני SNARE:
חלבוני SNARE הם חלבונים טרנסממברנליים שמקובעים לאזור שלהם בממברנה. חלבוני rab וה effectors שלהם יכולים להתפרק , ובמקומם בממברנה ישבו חלבוני rab אחרים , מה שמשנה את זהות האברון / וזיקולה , תהליך הנקרא rab cascade.
למשל , חלבוני rab5 והאפרטורים שלהם הם סממן מולקולרי עבור אנדוזום מוקדם , בעוד rab7 הם סממנים של אנדוזום מאוחר. בתהליך המטורציה של האנדוזום rab5 מוחלפים ב rab7
316
Rab patch
האזור בממברנה שבו יש חלבון rab מופעל (rab-GTP) + חלבוני ה effector שלו
כאמור היווצרות הפאצ׳ הינה לפי מעגל פידבק חיובי.
נקרא גם rab domain
317
כיצד מוחלף rab patch אחד ב rab patch אחר ?
ה rab שנמצא ב patch הראשון מגייס GEF שמפעיל את הrab של ה patch השני , וזה בתורו מגייס GAP שמעכב את ה rab מה patch הראשון.
תהליך ההחלפה הינו בלתי הפיך
318
הבדל בין עגינה (docking) לאיחוי:
עגינה מתווכת ע״י חלבוני rab וה effectors שלהם כשהוזיקולות נמצאות במרחק 200 ננומטר
איחוי מתווך על ידי חלבוני SNARE כשהמרחק בין הוזיקולות (או וזיקולה וממברנה) הוא 1.5 ננומטר.
התהליך האיחוי ליםידים משתי הממברנות יכולות לזלוג מאחת לשניה , וכן יש צורך לסלק את מולקולת המים מהאזור ההידרופילי של הממברנה
319
איחוי ממברנות ע״י חלבוני SNARE:
חלבון v-SNARE **אחד** על הוסיקולה יודע ליצור קשר **ספיציפי** עם 3 חלבוני t-SNARE על ממברנת המטרה , הם יוצרים קשרים דרך דומיינים אלפא החיקליים , 4 במספר.
צורת קישור זו נקראת trans SNARE complex
320
Trans SNARE complex:
קשר יציב מאד של 4 סלילים אלפא הליקליים בין חלבון vSNARE אחד ל 3 tSNAREs
יציבות הקשר הופכת את הריאקציה למועדפת תרמודינמית (חרף סילוק מולקולות המים). הקשר יציב כל כך ומבוקע ע״י החלבון NSF בריאקציה אנדותרמית ולכן דורש ביקוע אטפ
321
איחוי בתנאי מעבדה לעומת התא:
במעבדה האיחוי מתרחש לאט יותר מאשר בתא
322
איחוי באסוציטוזה מבוקרת regulated;
האיחוי מתרחש באופן חלקי , ורק לאחר הגעת סיגנל חוץ תאי הוא מושלם וה cargo מופרש מחוץ לתא.
323
האיחוי של שתי ממברנות מתרחש באופן הדרגתי:
- תחילה יש לסלק את מולקולות המים
- בקרבה של 1.5 ננומטר פוספוליפידים משני **העלעלים הציטוזוליים** נודדים בין הממברנות
- שני העלעלים הפנימיים מתאחים
324
האם איחוי בין ממברנות מתרחש אך ורק העצ טרנספורט וזיקולרי ?
לא , הוא מתרחש במספר תהליכים:
- איחוי בין תא זרע לביצית
- אייוי ממברנות של תאים ליצירת סניסיטיום syncytium
- איחוי בין ממברנת ה ER למעטפת הגרעין
325
וזיקולות עטופות קלתרין:
קלתרין עוטף וזיקולות שמנצות:
- מהגולג׳י לממברנת התא האקסוציטוזה
- מהגולג׳י לאנדוזום וממנו לליזוזום
- ממברנת התא לאנדוזום המוקדם באנדוציטוזה
- מהאנדוזום המוקדם (או מה recycling endosome) לממברנת התא בתהליך מחזור וזיקולות
326
תאר את מבנה החלבון קלתרין:
החלבון קלתרין מורכב משרשראות כבדות ושרשראות קלות , בעצם הוא בעל מבנה שנקרא טריסקליון triskelion שבנוי מ 3 שרשראות קלות ו 3 שרשראות כבדות
טריסקליונים מתארגנים לכדי מבנה דמוי בל המכסה וזיקולות מבחוץ , טריסקליונים יכולים להתארגן בצורה משושה או מחומשת ואפילו הפטגונית.
קלתרין מהווה את השכבה החיצונית של הוזיקלה , חלבוני adaptor מהווים את השכבה הפנימית.
327
חלבון הקלתרין הוא הקסמר:
כל חלבון בנוי מ 6 שרשראות , 3 כבדות ו 3 קלות.
(אפשר גם להגיד שהוא טרימר פרוטומרי ?)
328
כלוב קלתרין:
היווצרות הכלוב , כלומר התארגנות הטריסקליונים בצורה מחומשת / משושה / הפטגונית יכולה להתרחש בתנאים הנכונים גם במבחנה ואינה דורשת נוכחות הממברנה.
329
ממה בנוי טריסקליון אחד של קלתרין ?
מ 3 שרשראות כבדות + 3 שרשראות קלות
הקצה ה N טרמינלי שלו פונה אל תוך הלומן של הוזיקולה וקושר חלבוני אדפטור adaptor המרכיבים את השכבה הפנימית.
330
השרשרת הקלה של קלתרין:
1) זרחון שלה מבקר את הרכבת מעטפת הקלתרין
2) היא נקשרת לסיבי אקטין ומבקרת התמיינות הממברנה והנעת הוזיקולה (אקטין של הקורטקס ?)
3)
331
היווצרות כלוב קלתרין:
1) התארגנות קלתרין על הממברנה גורמת לכיפוף שלה באופן מקומי וליצירת גומות - clathrin coated pits
2) חלבוני adaptor כגון AP2 מקשרים לקצה האמיני של הטריסקליונים מצד אחד ולרצפטורים מצד שני
3) ה cargo נקשר לרצפטורים
4) דינמין מגיע לצוואר הגומה ומבקע אותה , וכך בעצם מנצה וזיקולה.
שקף 361
332
AP2:
חלבון מתאם , נפוץ שמהווה את השכבה הפנימית של ציפוי קלתרין.
הוא תחיחה נקשר ל PIP2 , זה משנה את הקונפורמציה שלו ומאפשר לו לקשור את הרצפטור שאליב נקשר הcargo
בשלב האחרון נקשר אליו ציפוי הקלתרין.
333
שקף 362
כיצד AP2 תורם להיווצרות ה pit בממברנה ?
החלבון בנוי מ 4 תת יחידות , הטרו טטרמר.
הוא מגיע במצבו הסגור לממברנה , קושר PIP2 שזה PI(4,5)P וזה פותח אותו.
במצבו הפתוח הוא נקשר לרצפטורים טרנס ממברנליים , שבצד השני שלהם קשור ה cargo.
**היקשרות ה AP2 לרצפטורים מעקמת את הממברנה** , בהמשך יקשר ל AP2 חלבוני קלתרין מה שיעקם את הממברנה עוד יותר ,ודינמין יבקע את הוזיקולה.
334
במצבו הפתוח , למי AP2 יהיה קשור ?
- ל PIP2
- ל רצפטור שקושר את הcargo
- למעטפת קלתרין
335
חלבון אדפטור adaptor מסוג AP2 הוא ספיציפי:
לכל מדור יש פוספואינוזיטידים (PI) ייחודיים משלו בממברנה , שאותם ידעו לקשור חלבוני AP2 שונים , כך שה PI מהווים סממן מולקולרי עבור האברון וקובעים את סוג המטען שהוזיקולה תכיל.
איך? בעצם ה PI הרלוונטי מגייס AP2 ספיציפיים , שיודעים להפעיל רצפטורים ספיציפיים בעלי motif מבני משותף בצד הציטוזולי שלהם , שיודעים לקשור cargo ספיציפי.
336
דינמין dynamin
חלבון ציטופלסמתי , יוצר טבעת סביב צוואר הוזיקולה , שהולכת ומתהדקת כנגד. יקוע כטפ עד שהוזיקולה מתנתקת מהממברנה. שני קצוות הטבעת נקשרים זה לזה דרך אתרי ה GTPase שלהם.
בפועל , לדינמין יש שני אתרי קישור , אחד ל פוספואינוזיטידים (בממברנת הוזיקולה) , ואחד לגטפ אותו הוא מבקע כדי ללחוץ את הוזיקולה ולנתק אותה מהממברנה
337
פירוק מעטפת קלתרין:
1) הקלתרין נקשר ל AP2 שקשור ל PIP2. כאשר הוזיקולה מתנתקת , מגיעים פוספטאזות מסיסות בציטוזול , ומורידות את הפוספט מהפוספואינוזיטיד , הדבר גורם למיתוק ה AP2 ועל כן לפירוק הקלתרין.
2) החלבון אוקסילין auxilin מפעיל ATPase שמפעיל שפרון hsp70 שבתורו מפרק את המעטפת
338
פוספטידיל אנוזיטול:
הוא פוספוליפיד מסוג גליצרו-פוספוליפיד , שקבוצת הראש שלו היא הסוכר אינוזיטול , בקיצור נכתב PI. הוא נמצא בחלק הציטוזולי של הממברנה , הוא יכול לעבור זרחון בעמדות 3, 4, 5 של הסוכר וכך מתקבל המבנה פוספואינוזיטיד.
הפוספואינוזיטיד PIP2 הוא דוגמה לכך , הוא עובר זרחון בעמדות 4 ו- 5 של האינוזיטול.
לאורגנלות שונות יש קינאזות ופוספטאזות שונות שקובעים איזה סוג PIP יווצר
339
340
היווצרות וזיקולה בממברנת התא:
ממברנת התא יותר קשיחה ממברנות של אברונים הודות לריבוי כולסטרול וסיסבי אקטין (קורטקס) ולכן היווצרות הוזיקולה דרך הכוחות שמפעילים AP2 וקלתרין אינה מספיקה , אלא שנדרשים חלבונים נוספים , חלבוני BAR domain שנקשרים לממברנה דרך אנטראקציות אלקטרוסטטיות ומקפלים אותה.
חלבוני BAR donain ביחד עם הקלתרין מעודדים התגרענות מקומית של סיבי אקטין שבתורם דוחפים את הוזיקולה עוד יותר.
341
שאלה 9 עמ׳ 376
!!!
342
ההבדל בין רצף הסיגנל ה N טרמינלי בטרנסלוקציה למיטוכונדריה לעומת ה ER:
בטרנספורט למטריקס במיטוכונדריה , נוכחות הרצף הזה מלמדת שהחלבון מיועד למטריקס , תתכן נוכחות רצפים אחרים או אפילו העדרו , ואז היעד הסופי של החלבון משתנה. אך נתמקד רגע ברצף ה N טרמינלי שמכוון למטריקס. הרצף הזה מתאפיין בהיותו חיובי (מכיל חומצות אמינו חיוביות) , הדבר חשוב כדי לקדם את הטרנסלוקציה , כי על העלעל החיצוני של הממברנה הפנימית יש מטען חיובי (ע”ר נוכחות פרוטונים) , וזה דוחה -ועל כן דוחף - את הפפטיד פנימה דרך הממברנה אל המטריקס.
בייבוא חלבונים ללומן של ה ER , קיים רצף הסיגנל גם כן בקצה ה N טרמינלי , אך הוא הידרופובי ולא טעון חיובית , בעצם מכיל מוטיב חוזר של 8 חומצות אמינו הידרופוביות. הרצף בעל תפקיד חשוב בפתיחת ה plug של הטרנסלוקטור sec61 מה שמאפשר השחלה של הפפטיד דרכו אל הלומן , בעצם רצף הסיגנל נכנס לטרנסלוקטור ונדחף לטרלית דרכו אל הממברנה (מכאן חשיבות הרכבו ההידרופובי) , מה שמפנה מקום לשאר הפפטיד להשתחל אל תוך הלומן של ה ER (כרטיס 71).
