10. Flashcards

Question

Ekspresija gena u 1 operonu kak se regulira

Answer 1

Svi geni/ORF-ovi unutar jednog operona, u pravilu su jednako eksprimirani jer se transkribiraju u istu policistronsku mRNA. Međutim moguće je da stanica ipak ne treba sve te genske produkte u istoj količini u istom trenutku. Ovaj problem rješava se na nivou translacije ali i terminacijom transkripcije tijekom sinteze policistronske mRNA.

Answer 2

zbog slabog terminatora (T1), određeni udio svih transkripata sadrži samo gene a i b pa će oni biti jače eksprimirani od gena c i d. Ovaj proces naziva se atenuacija (slabi terminator je atenuator, prigušivač), ali atenuacija unutar trp operona, o kojoj ćemo govoriti u nastavku ovog predavanja je sasvim drugačiji proces.

Answer 3

U stanici također postoje i antiterminatori – proteini koji mogu poništiti djelovanje terminatora unutar transkripta (atenuator), tako da modificiraju RNA-polimerazu tako da ona ignorira atenuatore. Najbolje opisana antiterminacija događa se u E.coli koja je inficirana bakteriofagom lambda

Answer 4

indukcijom i represijom transkripcije, a najčešće se osniva na postojanju represora represor ima afinitet za vezanje na operator ⚫ operator se nalazi tik do promotora ili se s njim djelomično preklapa ⚫ vezanje represora na operator sprječava polimerazu da se veže na promotor ili da započne transkripciju

Answer 5

sadrži gene koji bakterijama omogućavaju korištenje laktoze

Answer 6

sadrži gene koji bakterijama omogućavaju korištenje arabinoze

Answer 7

sadrži gene potrebne za biosintezu triptofana

Answer 8

pod regulacijom jednog promotora/operatora nalaze tri ORF-a: ⚫ lacZ – kodira za β-galaktozidazu, intracelularni enzim koji koja cijepa laktozu na glukozu i galaktozu ali nastaje i alolaktoza ⚫ lacY – kodira za permeazu, transmembranski protein koji omogućava transport laktoze u stanicu ⚫ lacA – kodira za intracelularni enzim galaktozid transacetilazu čija uloga u stanici još nije razjašnjena promotor i operator se preklapaju  za protein represor kodira gen lacI ⚫ nije dio operona lac (transkribira se sa vlastitog promotora) pa je trans-djelujući element ⚫ ima afinitet za vezanje na operator operona lac te sprječava vezanje RNA-polimeraze na promotor ⚫ ima afinitet za alolaktozu koja mu mijenja konformaciju te se on više ne može vezati za operator za katabolizam laktoze neophodni su produkti gena lacZ i lacY β-galaktozidaza ⚫ hidrolizira laktozu na glukozu i galaktozu ali mali dio laktoze prevodi (transglikolizira) i u alolaktozu koju također hidrolizira na glukozu i galaktozu pa zapravo nastaje mali udio alolaktoze ⚫ alolaktoza se veže na represor te se on više ne može vezati na operator Lac represor ⚫ sadrži helix-turn-helix motiv (karakterističan za proteine koji se vežu na DNA, 2. nastavna cjelina) koji ostvaruje interakciju s velikim utorom DNA i tako omogućava specifični kontakt Lac represora s operatorskom regijom DNA ⚫ Lac represor je homotetramerni protein (sastoji se od 4 identične podjedinice), pri čemu se dvije vežu na jednu, a druge dvije na drugu polovinu operatorske regije – Lac represor je zapravo dimer dvaju dimera operator sadrži dvije invertno (obrnuto) ponovljne sekvencije (nisu identične) na koje se veže dimer dvaju dimera Lac represora (svaki dimer na jedno ponavljanje) Lac represor, osim za operator operona lac ima afinitet i za alolaktozu (derivat laktoze koji nastaje djelovanjem β-galaktozidaze čiji ORF se nalazi unutar operona lac). Vezanje alolaktoze za Lac represor, mijenja konformaciju represora pa se on više ne može vezati na operator.

Answer 9

kodira za β-galaktozidazu, intracelularni enzim koji koja cijepa laktozu na glukozu i galaktozu ali nastaje i alolaktoza

Answer 10

kodira za permeazu, transmembranski protein koji omogućava transport laktoze u stanicu

Answer 11

kodira za intracelularni enzim galaktozid transacetilazu čija uloga u stanici još nije razjašnjena

Answer 12

nije dio operona lac (transkribira se sa vlastitog promotora) pa je trans-djelujući element

Answer 13

sadrži helix-turn-helix motiv (karakterističan za proteine koji se vežu na DNA, 2. nastavna cjelina) koji ostvaruje interakciju s velikim utorom DNA i tako omogućava specifični kontakt Lac represora s operatorskom regijom DNA ⚫ Lac represor je homotetramerni protein (sastoji se od 4 identične podjedinice), pri čemu se dvije vežu na jednu, a druge dvije na drugu polovinu operatorske regije – Lac represor je zapravo dimer dvaju dimera operator sadrži dvije invertno (obrnuto) ponovljne sekvencije (nisu identične) na koje se veže dimer dvaju dimera Lac represora (svaki dimer na jedno ponavljanje) Lac represor, osim za operator operona lac ima afinitet i za alolaktozu (derivat laktoze koji nastaje djelovanjem β-galaktozidaze čiji ORF se nalazi unutar operona lac). Vezanje alolaktoze za Lac represor, mijenja konformaciju represora pa se on više ne može vezati na operator.

Answer 14

Neovisno o prisutnosti laktoze, gen lacI je konstitutivno (stalno) eksprimiran, te u stanici ima desetak molekula represora LacI

Answer 15

U odsustvu laktoze represor LacI vezanjem na operator reprimira operon lac, ali ne u potpunosti pa u stanici ima oko 5 molekula βgalaktozidaze

Answer 16

U prisustvu laktoze zahvaljujući prisutnoj β-galaktozidazi nastaje alolaktoza koja se veže na represor LacI te se on više ne može vezati na operator zbog čega nastupa indukcija operona lac koja je potrebna za korištenje laktoze

Answer 17

U prisustvu glukoze i laktoze, E.coli najprije metabolizira glukozu, a na metaboliziranje laktoze prelazi tek kad nestane glukoze jer je operon lac reprimiran glukozom. Ovaj slučaj represije gena za korištenje alternativnog izvora ugljika (laktoze), u prisustvu izvora ugljika koji se lako metabolizira (glukoza), naziva se katabolička represija.

Answer 18

Ovaj slučaj represije gena za korištenje alternativnog izvora ugljika (laktoze), u prisustvu izvora ugljika koji se lako metabolizira (glukoza), naziva se katabolička represija.

Answer 19

U prisutnosti glukoze u stanici je visoka razina ATP-a i niska razina cAMP-a (zbog aktivnosti cAMP fosfodiesteraze) ⚫ U odsustvu glukoze, aktivira se adenilat ciklaza te raste razina cAMP-a pa se on veže na CRP („cAMP receptor protein”, poznat i pod nazivom CAP – „catabolite activator protein”) ⚫ Zbog vezanja cAMP na CRP (CAP), CRP mijenja konformaciju te se kompleks cAMPCRP veže uzvodno od promotora na regiju od -72 do -52 i stupa u direktnu interakciju s RNA-polimerazom što omogućava njeno vezanje na promotor te dolazi do potpune aktivacije operona lac. CRP (CAP) je aktivator operona lac. ⚫ U odsutnosti kompleksa cAMP-CRP, odnosno u prisutnosti glukoze, RNA-polimeraza se s malim afinitetom veže na promotor operona lac.

Answer 20

negativno (zbog represora LacI) i pozitivno reguliran (zbog aktivatora cAMP-CRP), a oba načina regulacije su inducibilna jer ligandi (alolaktoza ili cAMP) aktiviraju transkripciju

Answer 21

odsutnosti arabinoze, dimer regulatornog proteina AraC istovremeno se veže na dvije udaljene regije DNA čime savija DNA i tako reprimira transkripciju s promotora operona ara

Answer 22

Vezanje arabinoze na AraC uzrokuje promjenu njegove konformacije tako da se on više ne može istovremeni vezati na udaljene regije pa ne može ni saviti DNA. Umjesto toga, veže se na dvije bliske regije u blizini promotora i djeluje kao aktivator transkripcije.

Answer 23

Regulatorni protein može biti i aktivator i represor (pozitivna i negativna regulacija), ali je način regulacije inducibilan jer ligand (arabinoza) inducira transkripciju

Answer 24

operon trp je represibilan jer se reprimira produktom biosintetskog puta (triptofan).  Regulatorni protein represor TrpR može se vezati za operator (i tako reprimirati sintezu triptofana) samo ako se na njega veže triptofan. Stoga je operon trp negativno-represibilno reguliran – jer je protein regulator represor, a ligand (triptofan) reprimira transkripciju. može biti i prigušivanjem

Answer 25

Operon trp između mjesta početka transkripcije i prvog gena (ORF-a) sadrži tzv. vodeću (leader) sekvenciju duljine 162 pb ⚫ Vodeća sekvencija sadrži dva obrnuta ponavljanja (ukupno 4 ponovljene regije koje nisu identične) Nakon transkripcije mRNA, atenuator sadrži 4 međusobno komplementarne regije koje mogu formirati strukture ukosnice Čim se sintetizira dovoljno dugački dio mRNA na njega se veže ribosom i započne translaciju, ali ubrzo dolazi do regije koja sadrži dva kodona za triptofan, dakle, da bi se translacija mogla nastaviti, neophodno je da u stanici ima dovoljno triptofana Bez utjecaja translacije (ribosoma) sparuju se regija 1 i 2 te regija 3 i 4, pri čemu sparivanje regije 3 i 4 tvori terminator transkripcije. ⚫ U odsustvu triptofana, ribosom zastaje na kodonima za tiptofan unutar regije 1 i time sprječava sparivanje regija 1 i 2, ali se sparuju regije 2 i 3 koje ne tvore terminator. ⚫ U prisustvu triptofana, ribosom neometano dolazi do stop kodona koji se nalazi odmah iza regije 1. Ovdje će ribosom disocirati s RNA, ali se ipak zadrži dovoljno dugo da spriječi sparivanje regije 2 i 3. Stoga se sparuju regije 3 i 4 koje tvore terminator transkripcije.

Answer 26

Ima puno manji utjecaj ma ekspresiju gena od regulacije transkripcije ⚫ Uzvodno od start kodona na mRNA se nalazi mjesto za vezanje ribosoma (Shine-Dalgarno, oko 8 nukleotida uzvodno od AUG) koje varira u sekvenciji i udaljenosti od start kodona ali jači utjecaj na regulaciju ekspresiju gena ima udaljenost od start kodona. ⚫ Pri translaciji policistronske mRNA nakon translacije prvog gena (ORF-a) ribosom može disocirati s mRNA pa se ponovno mora vezati za mRNA da bi translatirao slijedeći ORF, a to može rezultirati smanjenom razinom translacije nizvodnih ORF-ova. Međutim, u mnogim slučajevima start kodon slijedećeg ORF-a može biti jako blizu (nekoliko parova baza) ili se čak preklapati sa stop kodonom prethodnog ORF-a. U ovom slučaju uopće ne dolazi do disocijacije 30S podjedinice ribosoma, nego ona odmah stupa u interakciju sa start kodonom slijedećeg ORF-a.

Answer 27

Regulacija na nivou translacije Poznato je da za mnoge aminokiseline postoje sinonimni kodoni, ali u nekim slučajevima pojedine tRNA prepoznaju samo pojedine sinonimne kodone pri čemu neke od tih tRNA u stanici mogu biti prisutne u malom broju. Zbog toga različiti organizmi/vrste imaju specifični „codon bias”, odnosno u genima se značajno više pojavljuju samo pojedini sinonimni kodoni. Zbog svega navedenog, geni koji odstupaju od pristrane uporabe sinonimnih kodona za dotični organizam/vrstu slabije su eksprimirani zbog znatno sporije translacije. Ovo je jako važno pri ekspresiji gena/proteina iz jedne vrste u drugoj vrsti. Za uspješnu ekspresiju neophodno je optimizirati kodone gena koji se eksprimira na način da se poštuje „codon bias” organizma u kojem ga želimo eksprimirati.

Answer 28

Regulacija ekspresije operona lac, ara i trp primjer su kako stanica reagira na signale unutar stanice (prisutnost nekog izvora uljika ili produkta biosisnteze). Međutim, bakterijske stanice reagiraju i na signale iz okoline. Jedan primjer sustava koji to omogućava temelji se transmembranskom proteinu koji se naziva histidin protein kinaza (HPK) i citoplazmatskom proteinu RR („response regulator”). Mehanizam regulacije je slijedeći: • ligand iz okoline stupa u interakciju s domenom HPK koja se nalazi na vanjskoj strani stanične membrane • to uzrokuje autofosforilaciju jednog histidina u domeni HPK koja se nalazi na unutrašnjoj strani membrane • fosfatna grupa se prenosi na RR koji se u fosforiliranom obliku može vezati na DNA i regulirati transkripciju odgovarajućih gena/operona

Answer 29

mRNA koje reguliraju ekspresiju gena ovisno o temperaturi jer na 5’-kraju (pri nižim temperaturama) tvore sekundarne strukture koje mogu spriječiti vezanje ribosoma. Jedan ovakav element pronađen je u E.coli uzvodno od gena rpoH koji kodira za σ-faktor σ32 (veže se na RNA-polimerazu i omogućava joj da transkribira „heat-shock” gene koji su potrebni za preživljavanje na povišenoj temperaturi). ⚫ Mnoge patogene bakterije na ovaj način detektiraju povećanje temperature na 30 do 37°C kao znak da se nalaze u, primjerice, ljudskom organizmu pa dolazi do ekspresije gena odgovornih za virulenciju i preživljavanje unutar životinjskog organizma.

Answer 30

U prethodnim primjerima, regulatorna RNA je zapravo dio mRNA (njen netranslatirani 5’- kraj). Međutim, male regulatorne RNA eksprimiraju se neovisno od gena čiju ekspresiju reguliraju, a djeluju tako da se komplementarno sparuju s mRNA utječući na njenu stabilnost ili uspješnost translacije (slično interferenciji RNA u eukariota)

10. Flashcards

(55 cards)