12.

Question 1

što je plazmid

Answer 1

) relativno malih kružnih ekstrakromosmomskih molekula DNA (plazmida) koji imaju
ishodište replikacije, a na njima se mogu nalaziti dodatni geni koji mogu imati veliki
utjecaj na genotip i fenotip bakterije

Question 2

Plazmidi – utjecaj na fenotip bakterije

Answer 2

Rezistencija na antibiotike
Kolicini i bakteriocini
Virulencija
Bakterije koje inficiraju biljke
Geni za korištenje alternativnih izvora ugljika
Razgradnja potencijalno toksičnih kemikalija (bioremedijacija)

Question 3

Bakterije koje inficiraju biljke

Answer 3

Bakterija Agrobacterium tumefaciens uzrokuje tumorima slične tvorevine na biljkama
zahvaljujući tzv tumor inducirajućem (Ti) plazmidu. Tijekom infekcije dio ovog plazmida se
iz bakterije prenosi u biljnu stanicu. Stoga se ova bakterija i TI-plazmidi primjenjuju u
genetičkim modifikacijama biljaka

Question 4

Geni za korištenje alternativnih izvora ugljika

Answer 4

Neki plazmidi primjerice nose gene za korištenje laktoze i hidrolizu uree

Question 5

Razgradnja potencijalno toksičnih kemikalija (bioremedijacija)

Answer 5

Na plazmidima se često nalaze geni potrebni za razgradnju potencijalno toksičnih
kemikalija. Tako primjerice plazmid iz Pseudomonas putida, kodira za niz enzima koji su
potrebni za konverziju cikličkih ugljikovodika (toluen i ksilen) u benzoat te razgradnju
benzoata do spojeva koje bakterija može koristiti za dobivanje energije i u biosintetskim
putovima. Mogućnost mikroorganizama da razgrađuju ovakve spojeve interesantna je radi
njihove primjene u bioremedijaciji. Također postoje i plazmidi koji daju rezistenciju na
toksične metale kao što su bakar i živa.

Question 6

Virulencija

Answer 6

U nekim patogenim bakterijama, geni za toksine nalaze se na plazmidima. Tako primjerice
neki patogeni sojevi E.coli produciraju toksine koji su slični kolera toksinima, ali se geni za
toksine u Vibrio cholerae nalaze na profagu, a u E.coli na plazmidu.

Question 7

Kolicini i bakteriocini

Answer 7

Osim gena za rezistenciju na antibiotike, plazmidi mogu nositi i gene koji kodiraju za
antimikrobne proteine koji obično djeluju na filogenetski bliske organizme. Jednu
grupu takvih proteina proizvodi jedan soj E.coli, a ti proteini ubijaju druge sojeve E.coli pa
se nazivaju kolicini, a sojevi koji ih proizvode su kolicinogeni sojevi. Gen za kolicin
nalazi se na plazmidu zajedno sa još jednim genom koji daje imunost na kolicin. Jedan
takav plazmid je plazmid ColE1, a on ima posebni značaj jer je većina plazmida koji se
koriste u genetičkom inženjerstvu zapravo derivat ovog plazmida.

Question 8

Rezistencija na antibiotike

Answer 8

Plazmidi često nose gene koji su odgovorni za rezistenciju na jedan ili više antibiotika
(kodiraju za enzime koji inhibiraju ili inaktiviraju antibiotike), a mogućnost prijenosa
plazmida čak i između jako različitih vrsta doprinosi širenju antibiotičkih rezistencija.
Naravno, za pojavu i širenje rezistencije na antibiotike nisu odgovorni samo
plazmidi. Primjerice, bakterije mogu steći rezistenciju na neki antibiotik zahvaljujući
mutaciji u genu koji kodiraju za protein na koji taj antibiotik djeluje.

Question 9

Ulazak T-DNA u biljnu stanicu

Answer 9

1. protein VirA je senzor za signale iz okoline i aktivator proteina VirG
2. fosforilirani protein VirG aktivira vir gene
3. sinteza proteini VirD1 i VirD2
4. proteinski kompleks VirD1-VirD2 cijepa jedan lanac DNA u LB i RB
5. protein VirD2 ostaje vezan na 5’-kraju jednolančane DNA
   (jednolančana praznina u plazmidu se resintetizira)
6. DNA u blijnu stanicu ulazi kroz “T-pilus” koji izgrađuje protein VirB a u
   stanicu ulazi i protein VirE2
7. u biljnoj stanici VirE2 prekriva T-DNA te nastaje “T-kompleks” u kojem je
   DNA zaštićena od nukleaza, prolazi kroz jezgrinu membranu (NPC – nuclear
   pore complex) uz pomoć proteina domaćina
8. proteini VirE1 i virD2 se degradiraju, a jednolančana DNA se ugrađuje u
   genom ilegitimnom rekombinacijom.

Question 10

Što su epizomi

Answer 10

Epizomi su plazmidi koji sadrže dijelove genoma stanice
domaćina te u stanici mogu postojati kao ekstrakromosomska molekula DNA ili
mogu biti ugrađeni u kromosom stanice domaćina

Question 11

o čemu ovisi Broj kopija plazmida po stanic

Answer 11

ovisi o regulaciji replikacije plazmida i nasljeđivanju plazmida
u stanice kćeri, ali i o veličini plazmida. Malih plazmida (do 10 kb) u pravilu ima u više kopija, a
velikih u manje kopija.

Question 12

Što su Konjugacijski plazmidi

Answer 12

omogućuju konjugaciju, odnosno fizičko spajanje
stanica i prijenos genetičkog materijala iz stanice-donor u stanicu-recipijent (slijedeća
nastavna cjelina). U stanici se nalaze u malom bro

Question 13

Kriptični plazmidi što su

Answer 13

plazmidi čije postojanje u stanici ne utječe na fenotip stanice.

Question 14

Plazmid ColE1 što je i što sadrži

Answer 14

colE1 – kodira za kolicin E1
• imm – kodira za protein koji daje imunost na kolicin E1
• oriV - ishodište replikacije
• oriT - ishodište replikacije pri konjugaciji (omogućava
prijelaz (transfer) plazmida u stanicu recipijent
• mob - kodira za nukleazu koja omogućava prijenos
plazmida konjugacijom
• rom - kodira za protein odgovoran za regulaciju broja kopija
plazmida u stanici

Question 15

što je mobilizacija

Answer 15

Plazmid ColE1, iako sadrži sekvencije oriT i mob, nije „konjugativni” plazmid jer sam ne
sadrži sve gene koji su potrebni za konjugaciju, ali može biti prenesen u stanicu recipijent ako
u istoj stanici postoji kompatibilni konjugativni plazmid

Question 16

Plazmid ColE1 Regulacija replikacije

Answer 16

Prvi korak u replikaciji ovog plazmida je sinteza RNA molekule koja se naziva RNA II.
Njena sinteza počinje 555 parova baza uzvodno od oriV i nastavlja se i nizvodno od oriV.
DNA/RNA hibrid koji ovako nastaje prepoznaje RNaza H (koji cijepa RNA samo ako je
ona komplementarno sparena s DNA) i cijepa RNA II na točno određenom mjestu čime
nastaje klica za sintezu vodećeg lanca DNA. Klicu za sintezu tromog lanca kasnije
sintetizira primaza.

Osim RNA II, na istoj regiji DNA
sintetizira se i RNA I. Međutim RNA I
nastaje transkripcijom komplementarnog
lanca DNA pa je komplementarna s
RNA II (108 nt na 5’-kraju).
⚫ Vezanje RNA I na RNA II tijekom sinteze
RNA II dok je RNA-polimeraza u
području inhibicije (iscrtkano područje)
ometa sintezu RNA II te ne nastaje klica
za sintezu DNA

U regulaciju je uključen i protein
kodiran genom rom koji olakšava
povezivanje molekula RNA II i RNA I.
Ovakav način regulacije osigurava da u
stanici ima 20ak molekula plazmida.
Uklanjanje (delecija) gena rom rezultira
većim brojem plazmida u stanici.

Question 17

Plazmid R100

Answer 17

R100 je konjugativni plazmid (89 kb),
daje rezistenciju na 4 antibiotika
(tetraciklin (tet), kloramfenikol (cat),
streptomicin (str) i sulfonamide (sul)) i
živine soli (mer). Sadrži sve gene
potrebne za konjugaciju („transfer
region”). Također sadrži ishodište
replikacije i regiju za regulaciju broja
kopija plazmida u stanici (repA/oriV),
ishodište za prijenos plazmida u
stanicu recipijent (oriT) te pokretne
genetičke elemente (insercijske
sekvencije IS1 i IS10 te transpozon
Tn10)

Question 18

Nasljeđivanje plazmida u stanice kćeri

Answer 18

Održavanje plazmida u bakterijskim stanicama zahtijeva da prilikom diobe, svaka stanica
kćer naslijedi najmanje jednu molekulu plazmida. Stoga se održavanje plazmida kojih u stanici
ima u velikom broju („high-copy-number” plazmidi) može osnivati na njihovoj slučajnoj raspodjeli
unutar stanice majke. Međutim, za pravilno nasljeđivanje „low-copy-number” plazmida u
stanice kćeri potreban je aktivan sustav.

Question 19

Nasljeđivanje plazmida u stanice kćeri kod R 100

Answer 19

Tako primjerice plazmidi kao što je R100 sadrže regiju par koja
kodira za dva proteina ParA i ParB te sadrži regiju parS na koju
se veže ParB. Potom se na ParA veže ParB i tako poveže dva
plazmida. Međutim, uz utrošak ATP-a ParA polimerizira i tvori
filament i tako odguruje jednu molekulu plazmida od druge, čime
se osigurava da stanice kćeri naslijede po jednu kopiju plazmida.

Question 20

Kompatibilni i nekompatibilni plazmidi

Answer 20

ne mogu svi plazmidi stabilno koegzistirati u istoj stanici. Takvi plazmidi nazivaju se
nekompatibilni plazmidi. Naime ako neka stanica sadrži dva nekompatibilna plazmida, tijekom
uzastopnih dioba stanica, jedan od ta dva plazmida će se izgubiti, odnosno u populaciji
bakterija zadržat će se samo jedan plazmid.
Nekompatibilni plazmidi su oni koji imaju isto ishodište replikacije, odnosno isti način regulacije broja kopija plazmida u stanici, kao i plazmidi -koji imaju isti sustav za pravilnu raspodjelu plazmida u stanice kćeri. Ako dva plazmida imaju isti sustav regulacije replikacije onda jedan drugome inhibiraju replikaciju, pa jedan plazmid prevlada, a pritom je moguće i da stanice koje sadrže različite plazmide imaju nešto različito
generacijsko vrijeme.

Naravno, nekompatibilnost najviše
dolazi do izražaja kod „low-copynumber”
plazmida pa kod njih razlog
za nekompatibilnost može biti i isti
sustav za pravilnu raspodjelu plazmida u
stanice kćeri.

Question 21

Strukturna nestabilnost plazmida

Answer 21

Strukturna nestabilnost plazmida najčešće je posljedica intra- ili interplazmidne homologne
rekombinacije tj recipročne izmjene („crossing-over”) između homolognih sekvencija.

Question 22

Recipročna izmjena između dva istosmjerna ponavljanja

Answer 22

rezultira gubitkom, izrezivanjem jednog
ponavljanja i cjelokupne sekvencije između ponavljanja.

Question 23

Recipročna izmjena između dva obrnuta ponavljanja

Answer 23

rezultira inverzijom DNA između ponavljanja

Question 24

Recipročna izmjena između dvije homologne regije koje
se nalaze na različitim plazmidima

Answer 24

rezultira spajanjem,
odnosno integracijom jednog u drugi plazmid. Obratni
proces je izrezivanje.

Question 25

Kako plazmid prisiljava stanicu da ga ima

Answer 25

Postoje plazmidi koji kodiraju za neki toksin i protein koji neutralizira djelovanje tog toksina. Međutim, toksin je znatno stabilniji od „protuotrova” pa stanice koje ostanu bez plazmida umiru. Primjer ovakvog plazmida je F-plazmid koji sadrži operon koji kodira za dva proteina: ⚫ CcdB – stabilniji, toksičan jer ometa replikaciju DNA – djeluje na girazu ⚫ CcdA – manje stabilan, ometa CcdB

Question 26

Pokretni genetički elementi

Answer 26

Pokretni genetički elementi su definirani dijelovi DNA koji imaju mogućnost premještanja s jednog na drugo mjesto u genomu. Otkriveni su 1960-ih godina u bakterijama, a 1970-ih u kvascima i bakteriofagima.  Najjednostavniji pokretni genetički elementi su inercijske sekvencije (IS), a ima ih više od 500 različitih vrsti. Razlikuju u duljini i nekim detaljima ali imaju vrlo sličnu osnovnu strukturu. Insercijska sekvancija IS1 dugačka je 768 pb, dok je duljina ostalih IS 1300 do 1500 pb

Question 27

građa insercijske sekvancije

Answer 27

Središnji dio IS elementa kodira za transpozazu koja je potrebna za premiještanije, a na krajevima se nalaze gotovo savršeni palindromi koji su u IS1 dugački 23 pb. Istosmjerna ponavljanja (DR) nisu sastavni dio IS nego nastaju tijekom ugradnje u genom.  IS su pronađene u mnogim bakterijama, a njihov broj i vrsta varira ovisno o soju. Tako primjerice, uobičajeni laboratorijski soj E.coli u genomu ima 6 kopija IS1 i veliki broj kopija drugih IS. IS se često nalaze i na plazmidima. Tako primjerice plazmid R100 ima dvije identične IS1 i dvije različite IS10.

Question 28

Što rade insercijske sekvencije

Answer 28

IS elementi sami po sebi ne utječu na fenotip bakterije jer kodiraju samo za transpozazu koja im omogućava premiještanije, Međutim insercija (ugradnja) IS u neki gen može uzrokovati njegovu inaktivaciju. Stoga je pitanje zašto bakterije toleriraju postojanje ovakvih sekvencija koje troše stanične resurse, od njih bakterija nema nikakve koristi, a potencijalno su opasni za stanicu. Najjednostavniji odgovor je da su IS zapravo primjer parazitske („sebične”) DNA koja je „razvila” sustav za vlastito održavanje unutar stanice.  Neke IS se zaista samo premiješaju po genomu tj izrežu se s jednog mjesta i ugrade se udrugo mjesto (konzervativno premiještanje). Međutim, neke IS se premještaju replikativno. U tom slučaju originalna IS sekvencija ostaje na svom mjestu, a nova se ugradi u novo mjesto u genomu. Stoga ove IS imaju tendenciju povećanja broja u genomu. Međutim, kad dosegnu određeni broj njihova aktivnost se suprimira kako one ne bi preplavile bakterijski genom i time izazvale smrt stanice što zapravo rezultira i eliminacijom IS. S druge strane, ako stanica izgubi određeni broj ovih IS, njihov broj se poveća do onog broja koji omogućava njihovu supresiju.  Stoga se ove IS sekvence ponašaju kao dobro adaptirani paraziti koji koloniziraju svog domaćina ali mu istovremeno ne nanose previše štete jer to onda nosi rizik i za parazita

Question 29

transpozoni

Answer 29

Za razliku od IS, transpozoni su pokretni genetički elementi koji sadrže i dodatne gene koji nisu povezani s njihovim premještanjem (transpozicijom). Primjer jednog jednostavnog transpozona je transpozon Tn3 koji je velik oko sadrži oko 5.000 pb, na krajevima ima kratka invertna ponavljanja (38 pb) i nosi gen bla koji kodira za β-laktamazu koja daje rezistenciju na ampicilin. Osim toga, kodira za još dva proteina ⚫ TnpA – transpozaza ⚫ TnpR – bifunkcionalni protein koji djeluje kao represor ali ima ulogu i u transpoziciji Postoje i složeniji, tzv „kompozitni” transpozoni kao što je T10 (9.300 pb) koji se sastoji od dvije kopije IS10 (1.300 pb) u obrnutoj orijentaciji između kojih se nalazi sekvencija koja daje rezistenciju na tetraciklin.