Geneeskunde 2A1 HC week 2 - 11/9

Question 1

Hoe zijn de basenparen gekoppeld?

Answer 1

Er is sprake van complementariteit: A zit altijd met T en C altijd met G
- dit omdat A en T 2 H-bruggen kunnen vormen en C en G 3 (sterkere verbinding)

Question 2

Waarvoor wordt Next Generation Sequencing (NGS) gebruikt?

Answer 2

het detecteren van:
- kleine mutaties (substituties van een aminozuur, deleties/inserties, etc.)
- deleties en amplificaties
- translocaties en fusiegenen

Question 3

Hoe werkt een PCR (polymerase chain reaction) en wat kun je ermee?

Answer 3

Doel: in kaart brengen van het volledige genoom door het DNA heel vaak te kopiëren

Werking:
1. dubbelstrengs DNA-molecuul uit elkaar door temperatuurverhoging (>90 graden Celsius)
2. temperatuur omlaag –> complementaire primers (aan stukje template-DNA) toevoegen
3. basen worden toegevoegd
4. DNA-polymerase wordt toegevoegd
5. nieuwe DNA strengen worden gemaakt

Question 4

Hoe wordt NGS in de praktijk toegepast?

Answer 4

• Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
• Therapiekeuze (therapie A of B)
• Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
• Oncogenetica (vinden erfelijke tumorsyndromen)
• Weefselidentificatie (onderscheid weefsel patiënten)

Question 5

Welke 2 soorten next generation sequencing zijn er?

Answer 5

• Targeted NGS (amplicon enrichment): specifiek deel van het genoom sequencen, label aan de PCR-primer en hierdoor dezelfde gebieden van verschillende individuen bekijken –> efficiënt, maar 1 fragment uit een bepaald gebied wordt gesequenced
• Hybridization enrichment: DNA in kleine fragmenten splitsen voordat het geamplificeerd wordt, hierna adapters voor latere sequencing toevoegen, interessante gebieden eruit halen (captured) en sequencen –> minder efficiënt, wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied

–> hierna bij beide: m.b.v. adapters moleculen binden aan een flowcell –> DNA-fragmenten vermeerderen –> clusters van dezelfde moleculen –> aflezen bouwsteenvolgorde tijdens de synthese (door vergelijking van sequenties achterhalen waar een gen van afkomstig is)

Question 6

Wat betekenen de begrippen ‘coverage’ en ‘VAF’ bij NGS?

Answer 6

• Coverage (deep sequencing): hoeveelheid dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is, hoe hoger de coverga hoe meer gesequenced is en hoe nauwkeuriger het resultaat
• VAF (variant allel frequency): aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. het referentie DNA (afhankelijk van gen en van tumor percentage)

Question 7

Wat zijn de eigenschappen van Next generation sequencing?

Answer 7

• Single molecuul
• Duizenden fragmenten/analyse
• Output van 1-20 * 10^9 basen
• Weinig DNA nodig (20 ng)
• Hoge gevoeligheid (1-2%)
• Poolen van samples (barcode)
• Bio-informatica nodig