Geneeskunde 2A1 VO week 4 Flashcards
Hoe werken deze algemene transcriptiefactoren van RNA polymerase II?
Ze binden eerst aan de promotor, waarna het RNA polymerase II kan binden (enzym dat de transcriptie van eiwit-coderende genen uitvoert)
Op welke plek in het DNA vind je de promotor van een gen?
Direct voor het punt waar de transcriptie van een gen begint
Waaruit bestaat een enhancer element en op welke plek vind je deze?
Een basenvolgorde in het DNA
Hij kan zowel voor/na en ver/dichtbij de promotor zitten, als het maar op hetzelfde chromosoom zit
Ergens in een gen is een mutatie opgetreden waardoor het mRNA langer dan normaal is geworden maar het eiwit korter dan normaal, welke mutatie is hier opgetreden?
Splice donor mutatie;
- donor markeert begin van een intron en acceptor markeert het einde van een intron, bij een mutatie gebeurt de splicing aan het begin pas later, waardoor er een stuk intron in het RNA komt, grote kans dat hierdoor er ergens een stopcodon zit en dat het eiwit korter is dan normaal
In welke richting vindt DNA synthese plaats?
Van 5’ –> 3’
Vier specifieke primers zijn:
(1) een voorwaartse primer van exon 1
(2) een terugwaartse primer van intron 1
(3) een terugwaartse primer van exon 2
(4) een voorwaartse primer van exon 2
Welke combinatie kan gebruikt worden voor de analyse in de afbeelding?
1 en 3: ze zitten allebei op een einde van een gen en gaan in verschillende richtingen dus ontstaat een stukje DNA
Welke moleculaire-genetische technieken zijn er om het DNA/RNA/eiwitten in beeld te brengen?
- Analyse van DNA: FISH, PCR, sequencing
- Analyse van RNA: RNA blot, RT-PCR
- Analyse van eiwitten: Westernblot, immunokleuring
Wat is Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)?
- kan op metafase chromosomen of op interfase-kernen (niet-gecondenseerde kernen)
- gebruik maken van een probe; bekend stuk enkelstrengig DNA of RNA dat kan hybridiseren met een specifiek enkelstrengig DNA of RNA molecuul
Wat is westernblotting en welke informatie verkrijg je eruit?
Eiwit analyse van specifieke antilichamen
- na veel centrifugeren krijg je een ebje met bonvenin supernatant met alle eiwitten (die wil je analyseren) en het patant zit onderin –> dit ga je analyseren o.b.v. hoe groot de eiwitten zijn (polyaacrylamide Gel electrophoreses) –> eiwitten op een membraan zetten
Verkregen informatie:
- Grootte van het eiwit (plaats van de band)
- Hoeveelheid van het eiwit (dikte van de band)
- Modificaties (bv fusie eiwitten door chromosomale translocaties)
Wat gebeurt er bij de BCR-ABL translocatie waardoor CML (chronische myeloïde leukemie) ontstaat?
cABL verhuist van chromosoom 9 naar chromosoom 22, daarnaast blijft 5’ BCR op chromosoom 22 en 3’ BCR gaat naar chromosoom 9
- Als je met FISH hier naar kijkt met een 5’ BCR-probe krijg je het resultaat in de afbeelding (groene en rode kleuring bij elkaar)
- Nieuw mRNA bevat dus zowel 5’ BCR als ABL sequenties, op eiwit niveau zorgt dit voor een fusie-eiwit, ABL is een kinase die nu niet meer gereguleerd kan worden en hierdoor ontstaat kanker
Welke translocatie komt bij >90% van de B-cel lymfomen voor en wat heeft dit tot gevolg?
T(14;18): het gevolg van de translocatie is dat het BCL2-gen (gelegen op chromosoom 18q) nu in de nabijheid komt te liggen van de enhancer van het IgH gen op 14q32, dat codeert voor de zware ketens van de immuunglobulinen. De expressie van het BCL2-gen komt dan onder controle van de IgH enhancer. De IgH-enhancer stimuleert de transcriptie van het IgH-gen: in de B-lymfocyten is dit gen uiteraard zeer actief, zo wordt ook de transcriptie van het BCL2-gen sterk gestimuleerd (veranderde expressie gen)
Hoe kan een translocatie de genregulatie aanpassen?
- translocatie van 2 genen door dubbelstrengs breuken, hierdoor een fusie van genen
- translocatie van de enhancer/promotor van een gen waardoor de regulatie anders is
Welke 2 verschillende probes zijn er voor het BCR-gen?
- de voorkant van het BCR-gen (5’-bcr)
- de achterkant van het BCR-gen (3’-bcr)
Hoe verloopt een RNA blot?
Om na te gaan of de veranderingen op DNA-niveau ook consequenties hebben voor het mRNA dat wordt afgelezen, is een RNA blot uitgevoerd. Daarvoor werd mRNA geïsoleerd uit het beenmerg van een gezond persoon (N) en uit dat van een CML-patiënt
- Afbeelding: 8.5kb mRNA bij de CML patiënt (door 9-22 translocatie van BCR-ABL) komt door de fusie van mRNA BCR-ABL
Hoe werkt een RT-PCR (reverse-transcribed PCR)?
Analyse in meerdere stappen:
1. mRNA isoleren uit een beenmergmonster van de patiënt
2. daarvan wordt dan m.b.v. poly T primer en het enzym reverse transcriptase cDNA gemaakt
3. dit cDNA mengsel onderwerpen aan een PCR met behulp van primers specifiek voor coderende gebieden uit BCR en ABL
4. verkregen DNA fragmenten door gel-elektroforese gescheiden en DNA zichtbaar maken
Waarnaar kijk je bij NGS bij patiënten met leukemie?
Zijn er leukemie-specifieke verworven mutaties
- voor methode, zie afbeelding! (hier zijn ook nog adapters bij betrokken, zowel voor en na het DNA stuk)
Wat betekenen de volgende mutaties:
- JAK2
- MPL
- CALR
- CSF3R
- JAK2 mutatie: GTC wordt TTC: valine wordt fenylalanine: V617F –> veel kans op polycystemia vera
- MPL mutatie: TGG wordt TTG: tryptofaan wordt leucine: W515L
- CALR: mutatie: 52 bp deletie
- CSF3R mutatie: ACC naar ATC: threonine wordt isoleucine: T618I –> marker voor chronische neutrofielen leukemie (CNL)
