PCR

Question 1

La PCR se caracteriza por:

Answer 1

Sensibilidad, reproductibilidad y eficiencia

Question 2

¿Cuáles son las dos técnicas que existen?

Answer 2

• Cuantitativa
• Cualitativa

Question 3

Cuantitativa

Answer 3

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Question 4

¿Cuál es el objetivo de la PCR en tiempo real?

Answer 4

Detectar y cuantificar las secuencias específicas de ac. nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en reacción.

Question 5

¿A qué se refiere el término en tiempo real?

Answer 5

A que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción

Question 6

La PCR no nos permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra. V/F

Answer 6

Falso. Si nos permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra

Question 7

Cualitativa

Answer 7

Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa

Question 8

¿Qué es la PCR?

Answer 8

Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada

Question 9

¿Qué enzima utiliza la PCR?

Answer 9

ADN polimerasa (pq tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células)

Question 10

¿Cuándo se utiliza el ADNc?(ADN complementario)

Answer 10

Cuando utilizamos el ARNm de algún gen de interés

Question 11

La técnica se divide en 3 partes: ¿Cuáles?

Answer 11

1. Desnaturalización
2. Hibridación
3. Extensión

Question 12

Para realizar la reacción se usan aparatos llamados

Answer 12

Termocicladores (que contienen un software que genera gráficas)

Question 13

¿Por qué se usan termocicladores?

Answer 13

Establecen un sistema homógeno en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de sus ciclos

Question 14

Se utilizan termocicladores para:

Answer 14

1. Excitar el sistema de fluorescencia
2. Capturar la señal de emisión del mismo
3. Realizar el análisis cuantitativo

Question 15

¿En qué se diferencian los termocicladores?

Answer 15

• En la fuente de energía (Lamparas de luz, diodos de emisión de luz y láseres)
• En las velocidades para disminuir e incrementar las temperaturas en cada etapa de la reacción
• En el número de muestras que puede soportar

Question 16

¿Qué muestran las gráficas de los termocicladores?

Answer 16

Una de estas gráficas es la de la amplificación que muestra el curso y el progreso de la reacción, otra gráfica es la disociación que muestra la especificidad de la reacción

Question 17

¿Cómo se denominan los productos de la PCR?

Answer 17

Amplicones

Question 18

¿Dónde son analizados los amplicones (productos de la PCR)?

Answer 18

Electroforesis en gel de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa

Question 19

¿En que consiste la electroforesis?

Answer 19

Consiste en la separación de grandes moléculas a traves de una matriz solida que funciona como filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica

• Utiliza un buffer o tampón

Question 20

¿Cómo se mueven los ácidos nucleicos en el gel de agarosa?

Answer 20

Ya que el grupo fosfato les otorga una carga negativa—> los ác. nucleicos migran hacia el lado positivo.

Question 21

¿Cuándo se usa ADN genómico y cuándo ADN complementario proveniente del ARNm?

Answer 21

• ADN genómico: PCR
• ADN complementario proveniente del ARNm: RT-PCR (enzima transcriptasa reversa)

Question 22

¿La PCR en tiempo real y PCR se deben analizar ambas en gel de agarosa?

Answer 22

No, no es necesario que la PCR en tiempo real sea manipulada en un gel de agarosa para saber que fue exitosa la reacción

Question 23

La enzima más usada se llama:

Answer 23

Taq polimerasa

Question 24

Taq polimerasa

Origen

Answer 24

Proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus la cual vive en condiciones de temperaturas muy altas—–Su ADNpol es termoestable

Question 25

¿Qué son los primers?

Answer 25

Son secuencias de oligonucleótidos que delimitan la secuencia blanco que desea amplificar y son complementarios a esta

Question 26

Tamaño promedio de los primers

Answer 26

• 12-15 pares de bases
• La cantidad de G-C no debe esceder el 55% de la secuencia (pq tienen enlace triple)

Question 27

¿Cuáles son las dos secuencias de primers usadas?

Answer 27

• Forward: sentido
• Reward: antisentido

Question 28

DESNATURALIZACIÓN

Answer 28

• Las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95° durante 20-30 seg

Question 29

¿Dé que depende el tiempo de desnaturalización?

Answer 29

• El tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la concentración de G-C es alta entonces será necesario más tiempo para romper sus uniones (tienen 3 enlaces)

AT tiene solo dos

Question 30

HIBRIDACIÓN

Answer 30

• Los primers se unen al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
• Si la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente

Question 31

¿Cuál debe ser la temperatura durante la hibridación?

Answer 31

• 50-60°C

Question 32

EXTENSIÓN

Answer 32

• La Taq polimerasa actua sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica (rápida)
• Función catalítica: agrega dntp’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN
• Al final del ciclo se habran formado los amplicones

Question 33

La extensión de las cadenas es en dirección de:

Answer 33

La síntesis de ADN: 5’ a 3’

Question 34

¿Cuál es la temperatura óptima para la extensión?

Answer 34

72°C

Question 35

¿Cuando utilizamos la PCR es suficiente hacer electroforesis?

Answer 35

No, se deben hacer más análisis, como la espectrometría de masas.

Question 36

¿Cuál es el método más sensible para detectar y cuantificar los ác. nucleicos?

Answer 36

La PCR en tiempo real

Question 37

¿Cuál es una de las aplicaciones más usadas para la PCR tiempo real?

Answer 37

Cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles de ARNm procedentes de células o tejidos

Question 38

La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción de PCR tiempo real puede ser a partir de concentraciones bajas. V/F

Answer 38

Verdadero

Question 39

Ingredientes en PCR tiempo real

Answer 39

Los ingredientes son los mismos que en PCR en punto final, solo que la enzima, los DNTP’s, Mg+, el buffer y el sistema de fluorescencia se venden en una solución conocida como Master MIX.

El agua se vende por separado y es libre de nucleasas

Question 40

Especificaciones para los primers que se usarán

Answer 40

Los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar alta especificidad y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb

Question 41

¿Cómo puede ser la cuantificación?

Answer 41

Absoluta y relativa

Question 42

Cuantificación absoluta

Answer 42

• Sirve para conocer el número exacto de copias amplificadas o la concentración precisa de ác. nucleicos en una muestra

Sirve para medir carga viral o bacteriana en tejidos

Question 43

Cuantificación relativa

Answer 43

• Se aplica cuando se desea evaluar los cambios de expresión de genes en distintos estados fisiológicos

(se buscan en el ARNm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen)

Question 44

Qué relevancia tiene el alineamiento de secuencias?

Answer 44

Al alinear dos secuencias se pueden encontrar regiones similares, esto puede tener implicaciones evolutivas y funcionales