2. Molekylærgenetiske metoder Flashcards
(12 cards)
Redegøre for princip i PCR
Komponenter i en PCR:
DNA-template: Et dobbeltstrenget
DNA-fragment, som indeholder den
DNA-sekvens, man gerne vil have amplificeret.
2 Primere: Primeren baseparrer med template-strengens to strenge og definerer dermed startstedet for DNA-synteste.
DNA-polymerase: Enzymet der syntetiserer nyt DNA.
dNTP’er: Byggestenene til nyt DNA.
PCR bygger på tre hovedtrin, som gentages i en cyklus:
Denaturering (ca. 95 °C):
Dobbeltstrenget DNA opvarmes, så hydrogenbindingerne mellem baseparrene brydes. Dette resulterer i to enkeltstrenget DNA-molekyler.
Annealing (ca. 55 °C):
Temperaturen sænkes, så DNA-primere kan binde (anneale) til deres komplementære sekvenser på enkeltstrengede DNA-skabeloner.
Elongering:
Temperaturen hæves. DNA-polymerasen binder til primerne og syntetiserer nyt DNA.
Det var 1 cyklus, og man kan starte en ny cyklus, ved at hæve temp. igen = kædereaktion.
Redegøre for princip i RT-PCR
Komponenter i en RT-PCR:
RNA-template: Et enkeltstrenget RNA-molekyle,
Reverse transcriptase:
Et enzym, der laver RNA om til DNA (cDNA).
1 Primer:
En primer binder til RNA’et og giver reverse transcriptase et startsted for at lave cDNA.”
2 primere (til PCR-trinnet):
Disse binder til hver sin ende af cDNA’et og definerer dermed startstedet for DNA-synteste..
Polymerase:
Enzymet, der laver mange kopier af cDNA’et i PCR-delen.
dNTP’er:
Byggesten til nyt DNA.
RT-PCR består af to trin:
1. Revers transkription:
RNA → cDNA
Reverse transcriptase laver RNA om til dobbeltstrenget DNA (cDNA).
- PCR (samme som i almindelig PCR):
Denaturering (ca. 95 °C):
Dobbeltstrenget cDNA opvarmes, så hydrogenbindingerne mellem baseparrene brydes. Dette resulterer i to enkeltstrenget DNA-molekyler.
Annealing (ca. 55 °C):
Temperaturen sænkes, så DNA-primere kan binde (anneale) til deres komplementære sekvenser på enkeltstrengede DNA-skabeloner.
Elongering:
Temperaturen hæves. DNA-polymerasen binder til primerne og syntetiserer nyt DNA.
Redegøre for princip i fragmentanalyse med kapillærelektroforese)
Kapillærelektroforese adskiller DNA-fragmenter i et tyndt kapillarrør fyldt med en polymer.
DNA-fragmenterne (ofte fra en PCR-reaktion) er mærket med et fluorescerende molekyle.
Prøven puttes i et lille kapillarrør, og når der tilføres elektrisk strøm, placeres prøverne ved den negative pol, da DNA er negativt ladet.
DNA-fragmenterne bevæger sig mod den positive pol. De mindste fragmenter bevæger sig hurtigst gennem kapillaren.
Når fragmenterne passerer et UV-detektionssted i røret registreres deres fluorescens, og dette kan analyseres på et computerprogram.
Redegøre for princip i fragmentanalyse med gelelektrofo- rese
Gelelektroforese adskiller DNA-fragmenter i en gelmatrix ved hjælp af et elektrisk felt.
En gel (typisk af agarose eller polyakrylamid) støbes med små brønde, hvor DNA-prøverne påføres.
Når en elektrisk strøm tilføres, placeres prøverne ved den negative pol, da DNA er negativt ladet.
DNA-fragmenterne bevæger sig mod den positive pol.
Undervejs bevæger fragmenterne sig gennem gelens porer – små fragmenter vandrer hurtigere og længere end store fragmenter.
For at visualisere DNA’et tilsættes SYBR Green), som binder til DNA og gør båndene synlige.
- Sanger sekventering
Området amplificeres vha. PCR og genspecifikke primere. Ved sekventeringen anvendes
ligeledes en genspecifik primer der elongeres med en polymerase (sekvenase). Der anvendes
en blanding af dNTP og fluorescens mærkede ddNTP (dideoxy nukleotider). Der køres typisk et
antal cykler af syntese, denaturering og anealing for at opnå kraftigere signal. Inkorporering af
ddNTP terminerer syntesen. Produkterne adskilles efter størrelse typisk ved kapilar
elektroforese, de flourescerende molekyler eksiteres med laser og farvesignalerne aflæses
med et kamera. En computer oversætter de indkomne signaler til elektroferogrammer og
sekvens.
- Next Generation Sequencing (Illumina teknologi)
- Next Generation Sequencing (Illumina teknologi)
Genomisk DNA oprenses fra f.eks en blodprøve. DNA fragmenteres og der ligeres adaptorer i
enderne. Efter PCR og evt enrichment sker der bridge-amplification på en flowcelle efterfulgt af
sekventering (sequencing by synthesis). Data alignes efterfølgende mod det humane genom og
forskelle registreres.
Kromosom- og kopitals undersøgelser: * MLPA
Der oprenses DNA fra patienten. DNA analyseres ved anvendelse af et MLPA reagens. Dette reagens
består at probe par for alle exons der ønskes analyseret. Disse prober er lagt umiddelbart ved siden
af hinanden således at de kan ligeres med en DNA ligase. Dette øger specificitet. Påhæftet enden af
alle højrestillede prober findes et identisk primer bindings site. Tilsvarende for den venstrestillede
probe. Nu amplificeres det ønskede analyserede område vha PCR med primere specifikke for de
anvendte prober, Taq polymerase samt de fire dNTPér. Den endelige reaktion analyseres vha.
kapillær elektroforese og ændring i den individuelle tophøjde kan nu efter normalisereing vurderes
RNA undersøgelser:
* Splicing assay: RT-PCR (Reverse transcription PCR)
* Kvantitativ mRNA expressionsanalyse: Kvantitativ RT-PCR
Markørundersøgelser:
* Mikrosatellit-analyser
Forklare betydningen af DNA mutationer/varianter på RNA og protein niveau
Punktmutationer: Vedrører ét enkelt basepar og omfatter substitutioner: Én enkelt base ændres til en af de tre andre baser → silent, missens, neutral og nonsens
Silent mutation: Basen ændres, men aminosyren forbliver den samme.
Missense mutation: Basen ændres, hvilket medfører en ændret aminosyre.
Nonsense mutation: Basen ændres, så kodonet bliver til et stopkodon.
Neutral mutation: En aminosyre ændres, men det påvirker ikke proteinets funktion væsentligt.
Frame shift mutationer:
En insertion eller deletion af en base, som gør at hele læserammen rykkes/ændres proteinet påvirkes.
Splice site mutation
Ved base udskiftning, der gør at splicing ikke sker eller sker et forkert sted. En mutation kan også gøre, at der kommer til splicesite, hvor der ikke burde være det. Kan give forlænget eller forkortet exon
Forklare hvilke faktorer der har betydning for vurderingen af om en mutation er patogen/sygdomsfremkaldende
En mutation kan vurderes som sygdomsfremkaldende (patogen), hvis den fx:
Ændrer det proteinkodende område → kan give et forkert protein.
Sidder i transskriptionsregulerende sekvenser (promotor, enhancer) → for meget eller for lidt genekspression.
Forstyrrer splejsning → introns fjernes ikke korrekt → ændret protein.
Indfører et stopkodon for tidligt → forkortet mRNA og protein.
Ændrer det aktive site i proteinet → nedsat eller øget funktion.
Giver en frameshift (indsættelse/sletning) → hele læserammen ændres → forkert protein.
