2.4 - priprava preparatov za elektronsko mikroskopijo Flashcards
(24 cards)
Kakšna je priprava za elektronsko mikroskopijo?
- FIKSACIJA: mora biti hitrejša in učinkovitejša kot za svetlobno mikroskopijo
- ali kemijska ali fizikalna fiksacija
Kateri so osnovni kemijski fiksativi v elektronski mikroskopiji?
- gluteraldehid
- formaldehid
- OsO4
Predstavi gluteraldehid.
- reagira z aminokislinami (lizin)
- (reagira z lipidi, ogljikovimi hidrati, nukleinskimi kislinami)
- rezultat: zamreženje celičnih sestavin
- slabost: počasi prodira v tkivo in celice
Predstavi formaldehid.
- mešanica z gluteraldehidi
- hitreje prodre v tkivo
- slabost: stabilizira le začasno, reverzibilno
Prestavi OsO4.
- sekundarni fiksativ
- reagira predvsem z lipidi
- oborina, ki prispeva h kontrastnosti
Kateri način poznaš za fizikalno fiksacijo v elektronski mikroskopiji?
Kako se razlikuje od kemijskega?
- ultrahitro zamrzovanje = kriofiksacija
- poteka hitreje
- v celico ne dodamo tujih molekul
Kako se pri fizikalni fiksaciji izognemo poškodovanju celičnih struktur?
Kako imenujemo ta postopek?
- pri počasnem zamrzovanju nastajajo kristali vode, ki lahko poškodujejo celične strukture
- majhne koščke tkiva se zato zmrzuje v tekočem dušiku/heliju
- nastane amorfni led = VITRIFIKACIJA
Kakšne so prednosti vitrifikacije?
- celične strukture ostanejo nespremenjene
- ohrani se ultrastruktura celic, podobna stanju in vivo
Kakšni morajo biti preparati pri presevni elektronski mikroskopiji in zakaj?
- dobro fiksirani, suhi, tanki, kontrastni
- zaradi sipanja elektronov v vakuumu
Kakšne rezine pripravljamo pri presevnem elektronskem mikroskopu?
Kakšen je osnovni pristop priprave teh rezin?
- ultratanke rezine
- fiksacija
- dehidracija
- vklapljanje
- rezanje
- kontrastiranje
Kako poteka fiksacija ultratankih rezin?
- primarna fiksacija: fiksiramo z gluteraldehidom, s formaldehidom ali z njuno mešanico
- spiranje s pufrom
- sekundarna fiksacija z OsO4
Kako potekata dehidracija in vklop ultratankih rezin?
- dehidracija: z etanoli naraščajočih koncentracij
- vklop: v hidrofobno, umetno smolo (npr. epon), 60-80°C
Kako se pri ultratankih rezinah izognemo, da bi izgubili del preparata, ki nas zanima?
- najprej pripravimo poltanke rezine, ki nam omogočajo orientacijo v preparatu s pomočjo svetlobnega mikroskopa
Kako režemo ultratanke/poltanke rezine?
- z ultramikrotomom - steklen ali diamantni nož
- noži so opremljeni s kadičko z vodo
- rezine s kapljico vode poberemo na kovinsko mrežico
- debelina 1 mikrometer
Kako barvamo poltanke rezine?
- barvamo jih s toluidinskim modrilom skupaj z umetno smolo
(pri parafinskih rezinah ni skupaj s smolo!)
Kako poteka kontrastiranje?
- ko se mrežica s preparatom posuši, kontrastiramo
- vnos atomov težjih kovin: kombinacija svinčevega citrata in uranilacetata
Kaj je zamrzovalno lomjenje?
- priprava preparata za presevni mikroskop
- omogoča opazovanje celičnih membran in membranskih proteinov (integralni proteini v lipidnem dvosloju)
Kakšen je postopek priprave zamrzovalnega lomljenja?
- zamrzovanje
- lomljenje
- izdelava replike
- čiščenje replike
Kako fiksiramo tkivo pri zamrzovalnem lomljenju?
Kako lomimo tkivo?
- z ultrahitrim zamrzovanjem
- z ohlajenim kovinskim nožem
- visok vakuum in nizka temperatura
- nastane molekulski relief
- replika: poberemo jo s kovinsko mrežico
Ali je debelina preparata omejujoč dejavnik pri vrstičnem mikroskopu? Zakaj?
- ne
- primarni elektroni potujejo po površini preparata, od točke do točke, NE PRESVETLIJO PREPARATA
Katere so stopnje priprave preparatov za vrstični elektronski mikroskop?
- kemijska fiksacija
- dehidracija
- sušenje
- pritrditev vzorca na nosilec
- napraševanje
- fiksacija in dehidracija sta podobni kot pri pripravi preparatov za presevno elektronsko mikroskopijo
- preparat očistimo v pufru
Opiši postopek po dehidraciji, sušenje.
(vrstični mikroskop)
- po dehidraciji preparat prepojimo s tekočim CO2 in ga posušimo pri kritični točki CO2
Kaj storimo s posušenimi vzorci preparatov za vrstični elektronski mikroskop?
- prilepimo jih na kovinske nosilce
- prekrijemo jih s prevodnim elementom, da povečamo signal
- preparatov NE KONTRASTIRAMO
-> površina opazovanega vzorca je razgibana
-> primarni elektroni jo zadevajo pod različnimi koti
Kaj je tomografija?
- TEM
- objekt si ogledamo s čim več različnih položajev
