2.5 - histokemijske metode Flashcards
(66 cards)
1
Q
Kaj nam omogočajo histokemijske metode?
A
kvantitativno in kvalitativno ugotavljanje kemijskih sestavin v celicah in zunajceličnem prostoru
2
Q
Kaj je osnova vseh histokemijskih metod?
A
uporaba specifičnih reagentov
-> nastanek končnega reakcijskega produkta, ki mora biti:
- netopen
- kemijsko stabilen
- obarvan
- elektronsko gost (električna mikroskopija)
- ohrani lokacijo
3
Q
Kako delimo histokemijske metode?
A
a) dokazujemo skupine makromolekul (lipidi, nukleinske kisline…)
b) dokazujemo specifične molekule ali njihov del (encim)
4
Q
Katero metodo dokazovanja nukleinskih kislin poznaš?
A
- feulgenova reakcija
5
Q
Opiši feulgenovo reakcijo.
A
- delamo na parafinskih rezinah
- stopnja: rezine inkubiramo v HCl
- hidroliza purinskih baz na DNA - stopnja: rezine inkubiramo v Schiffovem reagentu
- vezava na aldehidne skupine
- rdeče-vijolična barva
6
Q
Kdaj je Feulgenova reakcija pozitivna?
A
- v jedrih in mitohondrijih
- intenzivno se obarva heterokromatin
- pozor: molekule RNA se NE OBARVAJO
- reakcija je negativna v jedrcu in citoplazmi
7
Q
Katere metode dokazovanja ogljikovih hidratov poznaš?
A
- reakcija PAS
8
Q
Opiši reakcijo PAS.
A
- na parafinskih rezinah
- stopnja: cepitev vezi med C atomoma v molekuli sladkorja z perjodovo kislino
- stopnja: reakcija s Schiffovim reagentom
- nastane rdeče-vijolični produkt
9
Q
Kdaj je reakcija PAS pozitivna?
A
- glikogen, škrob, celuloza, NEVTRALNI proteoglikani, glikoproteini, glikolipidi
10
Q
Katere metode dokazovanja kislih proteoglikanov poznaš?
A
Alciansko modrilo
11
Q
Opiši reakcijo z alcianskim modrilom.
A
- alcialnsko modrilo je kationsko, veže se na kisle proteoglikane
- parafinske rezine
- obarva se modro
12
Q
Kdaj je reakcija z alcialnskim modrilom pozitivna?
A
- sekrecijski produkti čašastih celic
- medceličnina hrustanca
13
Q
Katere metode dokazovanja lipidov poznaš?
A
- OsO4
- barvila sudan
14
Q
Opiši reakcijo z OsO4.
A
- nase veže dvojne vezi nenasičenih maščobnih kislin
- obori se črno
- nenasičene maščobe tudi fiksira –> lahko ga uporabljamo za sekundarno fiksacijo pri pripravi preparatov za elektronsko mikroskopijo
15
Q
Kdaj je reakcija z OsO4 pozitivna?
A
- celične membrane na ultratankih rezinah
- mlečne žleze
16
Q
Opiši reakcijo z barvili sudan.
A
- sudan III, sudan IV, sudan črno
- dobro se topijo v lipidih
17
Q
Kdaj je reakcija z barvilom sudan pozitivna?
A
- maščobne kapljice
18
Q
Kaj ugotavljamo z encimsko histokemijo?
A
- ugotavljamo prisotnosti in lokalizacijo aktivnega encima
19
Q
Kako poteka encimska histokemija pri svetlobni mikroskopiji?
A
- inkubiramo parafinske ali zamrznjene rezine
20
Q
Kako poteka encimska histokemija pri elektronski mikroskopiji?
A
- inkubiramo majhne koščke tkiva
21
Q
Kaj ponavadi na preparatih obarvamo s hematoksilinom in zakaj?
A
- jedra
- da se lažje oritentiramo po preparatu
- parafinske ali zamrznjene rezine
22
Q
Kako poteka fiksacija pri encimski histokemiji?
A
- paziti moramo, da med fiksiranjem ne uničimo encima
a) šibka kemijska fiksacija: nizke koncentracije glutaraldehida in formaldehida
b) fizikalna fiksacija: zamrzovanje vzorcev
23
Q
Kaj je posebnost encimske histokemije?
A
Potrebna je izdelava kontrolnega preparata:
- reakcija mora biti negativna
- rezino tkiva inkubiramo v mediju, ki ne vsebuje substrata
24
Q
Prisotnost česa ugotavljamo z encimsko histokemijo?
A
- kislih hidrolaz
- oksidoreduktaz
25
Kaj je markerski encim?
- encim, ki je značilen za določen organel
26
Kaj je markerski encim za lizosome?
- kisla fosfataza
27
Kdaj je kisla fosfataza aktivna in kaj katalizira?
- aktivna v nizkem pH
- katalizira hidrolitični razcep organskih fosfatnih estrov
28
Kako dokažemo encimsko aktivnost pri svetlobnem mikroskopu?
- inkubiramo rezine v mediju, ki vsebuje substrat (alfa-naftilfosfat) in reagent (diazonijeva sol)
- tvori se primarni produkt NAFTOL -> netopen, stabilen končni produkt
29
Kako dokažemo encimsko aktivnost pri elektronskem mikroskopu?
- kot substrat uporabimo Na-beta-glicerofosfat in reagent svinčev fosfat Pb(NO3)2
- nastane Pb-fosfat, ki je stabilen in elektronsko gost končni reakcijski produkt
30
Kaj je sukcinska dehidrogenaza?
- encim Krebsovega cikla
- markerski encim za MITOHONDRIJE
31
Kje najdemo kislo fosfatazo?
- mitohondriji
- pozni endosomi
- trans GA
- transportni vezikli
32
Kaj nastane pri delovanju sukcinske dehidrogenaze?
- FADH2
- prenese visokoenergijske elektrone v dihalno verigo
33
Kakšen je produkt sukcinske dehidrogenaze?
- formazani
- rdeča barva
34
Kaj je katalaza?
Barva?
- markerski encim za peroksisome
- rjava
35
Kaj dokazujemo z imunooznačevanjem?
- prisotnost in lokacijo proteinov s pomočjo protiteles
36
Kako se imenujejo telesa, na katere se protitelesa specifično vežejo?
- antigeni
37
Kaj sta paratop in epitop?
- PARATOP: del protitelesa, s katerim se veže na antigen
- EPITOP: del antigena, ki se veže na protitelo
38
Kako pridobivamo protitelesa?
1. laboratorijske živali -> poliklonska protitelesa
-> vežejo se na več epitopov
2. hibridomi -> monoklonska protitelesa
-> vežejo se na en epitop
39
Kako fiksiramo preparat pri imunooznačevanju?
- šibka kemijska fiksacija
- zamrzovanje
- rezine inkubiramo v raztopini protiteles
40
Kako označujemo z direktno metodo imunooznačevanja?
- vezani so izbrani označevalci
- hitro in enostavno
- šibkejši signal
41
Kako označujemo z indirektno metodo imunooznačevanja?
1. uporabimo primarna protitelesa (neoznačena)
2. uporabimo sekundarna protitelesa (označena, poliklonska!)
-> za se specifično vežejo na primarna in pokažejo mesta izbranih antigenov
- ojačan signal (protiklonska telesa)
42
Katere označevalce protiteles poznaš?
- fluorescenčna barvila, npr. fluorokrom
- koloidno zlato
- encimi
- biotinilirana sekundarna protitelesa (metoda ABC)
43
Opiši opazovanje s fluorescenčnimi barvili?
- opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom
- IMUNOFLUORESCENCA
44
Kako označujmo protitelesa pri elektronski mikroskopiji?
koloidno zlato
45
Kako uporabljamo biotinilirana sekundarna protitelesa?
- naredimo jih vidne z metodo ABC
- na parafinskih rezinah
- + DAB = rjavo obarvan produkt
- prej je treba deaktivirat peroksidaze -> rezine s primarnimi protitelesi izpostavimo raztopini vodikovega peroksida
46
Kako ugotavljamo medsebojne odnose molekul pri imunooznačevanju?
z inkubacijo z različnimi protitelesi, ki so označena z različnimi označevalci
47
Kaj je avtoradiografija?
- označevanje in analiziranje metabolizma kemijskih sestavin z radioaktivnimi izotopi
- radioaktivni izotopi lahko oddajajo celice alfa, beta, gama žarke
48
Katere izotope najpogosteje uporabljamo pri avtoradiografiji?
- izotope, ki oddajajo beta elektrone
- tricij (H), C, P, S, I
49
Kaj uporabljamo za označevanje:
a) podvojevanje DNA
b) sinteza RNA
c) metabolizem ogljikovih hidratov
d) metabolizem proteinov
a) timidin ali BrdU
b) uridin
c) monosaharidi - galaktoza, manoza
d) aminokisline - lizin, cistein
50
Katere so stopnje avtoradiografskega postopka?
1. inkubacija
2. ekspozicija
3. razvijanje
51
Opiši inkubacijo.
- žive celice sprejmejo radioaktivno označene molekule
- celice vgradijo molekule v svoje makromolekule
- po določenem času ustavimo življenjske procese s fiksacijo tkiva -> radioaktivno označene molekule ostanejo na mestu
- iz tkiva poskusnih živali pripravimo parafinske ali ultratanke rezine
52
Opiši ekspozicijo.
- rezine prevlečemo s fotografsko emulzijo
-> kristalčki srebrovega bromida
- pustimo jih v popolni temi pri 4°C
- v tem času se beta delci zaletavajo ob kristale srebrovega bromida v fotografski emulziji -> reducirajo srebrove ione v elementarno srebro
53
Opiši razvijanje.
- ekspozicijo zaustavimo in zrnca srebra povečamo, da postanejo vidna na mikroskopu
- zrna so tik nad mestom, kamor se je radioaktivno označena molekula med inkubacijo vgradila v proučevanem tkivu
- preparat obarvamo za svetlobno mikroskopijo
54
Kaj dokazujemo z in situ hibridizacijo?
- specifična zaporedja nukleinskih kislin
55
Kaj je hibridizacija?
Kje lahko poteka?
- povezovanje dveh komplementarnih polinukleotidnih verig
- poteka lahko med dvema enojnima verigama DNA, med dvema RNA in eno DNA in eno RNA
56
Kaj je denaturacija?
Kaj je renaturacija?
- razpad H vezi med verigama DNA
- ko se denaturirana DNA pri nižji temperaturi ponovno poveže v dvojno vijačnico
57
Kaj je potrebno pripraviti pri in situ hibridizaciji?
Kako je označena ta stvar?
SONDA - polinukleotidna veriga DNA ali RNA, ki vsebuje znano zaporedje
- označena je z radioaktivnim izotopom, encimom, fluorokromom, majhnim sintetičnim antigenom
58
In situ hibridizacija: kaj sledi po pripravi sonde?
1. pripravimo parafinske, ultratanke ali zamrznjene rezine
2. nukleinske kisline denaturiramo -> razklenemo DNA -> omogočimo dostop sondam
3. rezine inkubiramo v raztopini, ki vsebuje sonde
4. hibridizacija med sondami in nukleinskimi kislinami
59
In situ hibridizacija: kaj sledi po hibridizaciji med sondami in nukleinskimi kislinami?
VIZUALIZACIJA vezanih sond: če je označevalec
a) radioaktivni izotop - izvedemo radiografski postopek (ekspozicija, razvijanje)
b) encim - izvedemo encimsko histokemijo (substrat, reagent)
c) sintetični antigen - izvedemo indirektno imunooznačevanje s primarnimi protitelesi in označenimi sekundarnimi protitelesi
60
Kaj je FISH in zakaj se uporablja?
- fluorescenčna in situ hibridizacija
- označevanje določenega kromosoma, gena na kromosomu, mutiranega gena
61
Kaj označujemo z metodo TUNEL?
- proste konce fragmentirane DNA - značilnost apoptoze
62
Kaj ugotavljamo z metodo TUNEL?
- prisotnost apoptotskih celic v histoloških rezinah
63
Kaj se zgodi z molekulami DNA pri metodi TUNEL?
- na vsakem fragmentu DNA nastane polinukleotidni rep z digoksigeninom
64
Katero metodo še uporabimo pri TUNEL metodi?
Imunooznačevanje: uporabimo protitelesa proti digoksigeninu
- protitelesa imajo vezano peroksidazo
65
Kako dokažemo peroksidazo?
- encimska histokemija
- DAB se obarva rjavo
66
V katerem primeru pri TUNEL metodi imunooznačevanje ni potrebno?
- če smo na proste konce DNA vezali nukleotide, označene s fluorokromom
-> preparate takoj pogledamo s fluorescenčnim mikroskopom
