Κ.4 :Τεχνολογία του ανασυνδιασμενου DNA

Question 1

Που στηρίζεται η τεχνολογια του ανασυνδυασμένου DNA ?

Answer 1

Στηρίζεται στο γεγονός ότι ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν καθολικός και τα ριβοσωματα αποτελούν θέσεις μετάφρασης οποιουδήποτε mRNA

Question 2

Ποια η σημασία των περιοριστικών ενδονουκλεασών και των φορέων κλωνοποίησης; ( για το ανασυνδυασμένο DNA)

Answer 2

Η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών , που είναι ένζυμα τα οποία κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων και 2 ) και η απομόνωση ειδικων φορέων που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο , επέτρεψε την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA και έδωσε στον άνθρωπο την ικανότητα -όχι μόνο να έρευνα αλλά και να επεμβαίνει και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών . Η τεχνολογια αυτή βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή σειράς προϊόντων και τη δημιουργία φυτών και ζώων με βελτιωμένες ιδιότητες . (Οπότε με την ανάπτυξη της υψηλής αυτής τεχνολογίας το DNA , που ήταν τόσο δύσκολο να μελετηθεί , έγινε παιχνίδι στα ανθρώπινα χέρια )

Question 3

Τι επέτρεψε την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA ?

Answer 3

Καταρχας η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων έδωσαν στους ερευνητές την δυνατότητα αναπαραγωγής των διαδικασιών αντιγραφής , αντιστροφής μεταγραφής , μεταγραφής και μετάφρασης in vitro .
Ειδικότερα 1) η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών , που είναι ένζυμα τα οποία κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων και 2 ) και η απομόνωση ειδικων φορέων που μεταφέρουν το DNA από κύτταρο σε κύτταρο , επέτρεψε την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA και έδωσε στον άνθρωπο την ικανότητα -όχι μόνο να έρευνα αλλά και να επεμβαίνει και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών . Η τεχνολογια αυτή βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή σειράς προϊόντων και τη δημιουργία φυτών και ζώων με βελτιωμένες ιδιότητες . Όποτε με την ανάπτυξη της υψηλής αυτής τεχνολογίας το DNA , που ήταν τόσο δύσκολο να μελετηθεί , έγινε παιχνίδι στα χέρια των επιστημόνων .

Question 4

Που βρίσκει εφαρμογή η τεχνολογια του ανασυνδυασμένου DNA ;

Answer 4

Καταρχάς η ανάπτυξη της τεχνολογίας Του ανασυνδυασμένου DNA έδωσε στον άνθρωπο την ικανότητα όχι μόνο να έρευνα αλλά και να επεμβαίνει και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών . Η τεχνολογία αυτή βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή σειράς προϊόντων και τη δημιουργία φυτών και ζώων με βελτιωμένες ιδιότητες . Με την ανακάλυψη της υψηλής αυτής τεχνολογίας το DNA που ήταν τόσο δύσκολο να μελετηθεί έγινε παιχνίδι στα χέρια των επιστημόνων .

Question 5

Τι είναι το ανασυνδυασμένο DNA;

Answer 5

Είναι τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονιδια από δυο ή και περισσότερους οργανισμούς και κατασκευάζεται σε δοκιμαστικό σωλήνα . Το DNA αυτό μπορεί να μπει σε ένα βακτήριο ή ένα ευκαρυωτικό κύτταρο . Τα γενετικά τροποποιημένα βακτήρια ή ευκαρυωτικα κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να αναπαράγονται μεταφέροντας τις καινούριες τους ιδιότητες στους απογόνους τους .

Question 6

Τι είναι η γενετική μηχανική ;

Answer 6

Είναι οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό

Question 7

Ποιοι οι στόχοι της γενετικής μηχανικής ;

Answer 7

Η γενετική μηχανική άνοιξε το δρόμο για νέες εξαιρετικά ενδιαφέρουσες

ερευνητικές και παραγωγικές δυνατότητες αλλά και για την επίτευξη δυο θεμελιωδών στόχων του ανθρώπου :

α. Την κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στη Γη

β.την βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του .
Η βελτίωση αυτή επιτυγχάνεται με της εφαρμογές της γενετικής μηχανικής στην ιατρική ,τη Γεωργία και την κτηνοτροφία .

Question 8

Κλώνος

Answer 8

Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε μια ομάδα πανομοιοτυπων μορίων , κυττάρων ή οργανισμών .

Question 9

Κλωνοποίηση

Answer 9

Ο όρος κλωνοποίηση αναφέρεται στην κατασκευή πανομοιοτυπων μορίων ,κυττάρων ή οργανισμών .

Question 10

Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεασών .

Answer 10

Καταρχάς είναι ένζυμα και η ανακάλυψη των περιοριστικών ενδονουκλεασών έθεσε το θεμέλιο για τη δημιουργία των γονιδιωματικών βιβλιοθηκών . Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή ξένου DNA.Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 ζεύγη νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA και κόβουν σε συγκεκριμένη θέση. Μία από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται ευρέως είναι η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli . Το ένζυμο αυτό όποτε συνταντα την αλληλουχία :….
στο γονιδίωμα κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του A ( με κατεύθυνση 5’~>3’) αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγαρωτές βάσεις στα κομμένα άκρα . Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο .

Question 11

Γιατί χρησιμοποιείται ευρέως η EcoRI?

Answer 11

Επειδή Η αλληλουχία 5’GAATTC3’
3 CTTAAG-5’
που είναι η αλληλουχία που αναγνωρίζει η ECOR1, υπάρχει διάσπαρτη στα γονιδιώματα των οργανισμών . Έτσι το γονιδίωμα ενός ανώτερου ευκαρυωτικου οργανισμού μπορεί να κοπεί σε χιλιάδες κομμάτια με την περιοριστική αυτή ενδονουκλεαση . Στη συνέχεια τα κομμάτια αυτά ενσωματώνονται σε ειδικούς φορείς .

Question 12

Χαρακτηριστικά πλασμιδίων φορέων

Answer 12

Τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης έχουν την αλληλουχία που αναγνωρίζει κάθε φορά η περιοριστική ενδονουκλεαση που χρησιμοποιείται μόνο μία φορά πχ την 5’… για την EcoRI. Έτσι τα πλασμίδια κόβονται από την περιοριστική ενδονουκλεαση πχ την EcoR1 σε αυτή τη θέση και δημιουργείται ένα γραμμικό μόριο DNA με μονόκλωνα άκρα.Τα δυο είδη DNA του πλασμιδίου και του οργανισμού αναμιγνύονται και επειδή έχουν συμπληρωματικά άκρα ,ενώνονται μεταξύ τους με τη βοήθεια ενός ενζύμου της DNA δεσμασης . Έτσι δημιουργούνται ανασυνδυασμένου πλασμιδια . Μερικά πλασμιδια ξαναγίνονται κυκλικά χωρίς να προσλάβουν DNA του οργανισμού .

Question 13

Χαρακτηριστικά βακτηρίων ξενιστών

Answer 13

Βακτήρια ξενιστές δέχονται σε μικρό ποσοστό πλασμίδια από τα οποία μερικά είναι ανασυνδυασμένα. Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και επομένως είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά . Επίσης δεν πρέπει να έχουν περιοριστική ενδονουκλεάση που μπορεί να κόψει το ξένο DNA .

Question 14

Ορισμός μετασχηματισμού

Answer 14

Ο μετασχηματισμός είναι η γενετική αλλαγή των ιδιοτήτων ενός βακτηριακού κυττάρου μετά από εισαγωγή DNA στο γονιδίωμα του . Κατά τον μετασχηματισμό με κατάλληλη κατεργασία τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια , έτσι ώστε να μπει το πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο ( και το ανασυνδυασμένο DNA ) . Άρα το βακτήριο τροποποιείται γενετικά .

Question 15

Διαδικασία διαχωρισμού μετασχηματισμένων βακτηρίων από μη μετασχηματισμένα βακτήρια

Answer 15

Ο διαχωρισμός γίνεται με τη χρήση κατάλληλου αντιβιοτικού .Συγκεκριμένα η επιλογή των βακτηρίων που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξη τους παρουσία αντιβιοτικού , επειδή το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Κάθε βακτήριο που προσέλαβε ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο πολλαπλασιάζεται και δίνει ένα κλώνο .

Question 16

Ποια βακτήρια χρησιμοποιούνται ως ξενιστές ;

Answer 16

Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και επομένως είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά επίσης δεν πρέπει να έχουν περιοριστική ενδονουκλεάσης που μπορεί να κόψει το ξένο DNA .

Question 17

Ποιοι είναι οι πιο χαρακτηριστικοί τύποι φορέων κλωνοποίησης

Answer 17

Οι πιο χαρακτηριστικοί τύποι φορέων κλωνοποίησης είναι τα πλασμιδια και το DNA των φαγων .

Question 18

Ποτε χρησιμοποιούνται ως φορείς τα πλασμιδια και ποτε οι φαγοι ;

Answer 18

Τα πλασμίδια αποτελούν το συνηθέστερο φορέα κλωνοποίησης για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα διότι η κλωνοποίηση σε πλασμίδια είναι σχετικά απλή.

Οι Φαγοι χρησιμοποιούνται ευρύτατα καθώς μπορουν να ενσωματώσουν μεγαλύτερα κομμάτια ξένου DNA. ( βακτηριοφαγος λ) Η στρατηγική της κλωνοποίησης είναι ίδια με αυτή που χρησιμοποιείται και στα πλασμιδια .

Question 19

Γιατί απομονώνεται το ώριμο mRNA ?( και όχι πχ πρόδρομο ή γονίδιο )

Answer 19

Απομονώνεται το ώριμο mRNA επειδή τα βακτήρια που συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές δεν έχουν μηχανισμούς απομακρυνσης των εσωνιων ( μηχανισμούς ωρίμανσης) ώστε να μπορεί να μεταφραστεί το mRNA και άρα δεν θα μπορούσε να παραχθεί η επιθυμητή πρωτεΐνη

Question 20

Ποιο ήταν το αποτέλεσμα της απομόνωσης και χρήσης ενζύμων στο εργαστήριο ;

Answer 20

Η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων έδωσαν στους ερευνητές την δυνατότητα αναπαραγωγής των διαδικασιών αντιγραφής , αντιστροφής μεταγραφής , μεταγραφής και μετάφρασης in vitro .

Question 21

Τι είναι η cDNA βιβλιοθήκη ;

Answer 21

Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν αντίγραφα των ώριμων mRNA των γονιδιων που εκφράζονται σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο -δότη .

Question 22

Τι είναι η αποδιάταξη ;

Answer 22

Είναι η διαδικασία που πραγματοποιείται αν επιδράσουμε στο DNA που απομονώθηκε με κατάλληλες χημικές ουσίες ή αν αυξήσουμε τη θερμοκρασία , τότε σπάζουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δυο συμπληρωματικών αλυσίδων και οι δυο αλυσίδες χωρίζουν η μια από την άλλη .

Question 23

Τι είναι η υβριδοποίηση και ποια η σημασία της ;

Answer 23

Η υβριδοποιηση είναι η σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή συμπληρωματικών DNA-RNA , που στηρίζεται στο γεγονός ότι δυο μονόκλωνες συμπληρωματικές αλυσίδες σε κατάλληλες συνθήκες μπορούν να συνδεθούν .

Η υβριδοποιηση είναι μια πολύ σημαντική ιδιότητα του DNA που μας δίνει τη δυνατότητα αν έχουμε ένα γνωστό μόριο DNA να το χρησιμοποιήσουμε ως ανιχνευτή για τον εντοπισμό του συμπληρωματικού του όταν το τελευταίο βρίσκεται μαζί με χιλιάδες αλλά κομμάτια .

Question 24

Τι περιέχει μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη ;

Answer 24

Μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει

έναν τεράστιο αριθμό από κλωνοποιημένα κομμάτια χρωμοσωμικού DNA ,τα οποία έχουν παραχθεί με δράση κάποιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης .

Ορισμένα από τα κομμάτια αυτά περιέχουν
ολόκληρα γονιδια
άλλα περιέχουν κομμάτια γονιδίων
και άλλα περιέχουν τμήματα DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες .

Question 25

Ποια η σημασία δημιουργίας αντιγράφων DNA ?

Answer 25

Η κατασκευή

Question 26

Τι είναι η μέθοδος PCR και ποιες οι εφαρμογές της ;

Answer 26

Η μέθοδος

Question 27

Σε ποια βιβλιοθήκη ( γονιδιωματική ή cDNA ) περιέχεται υποκινητής

Answer 27

Ο υποκινητής κλωνοποιείται μόνο με γονιδιωματική βιβλιοθήκη αφού δεν μεταγράφεται .

Question 28

Ποτε κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκη ;

Answer 28

Όταν θελουμε να κλωνοποιήσουν μόνο τα γονιδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα .

Question 29

Περιέγραψε την διαδικασία ανίχνευσης επιθυμητού κλώνου σε γονιδιωματική ή cDNA βιβλιοθήκη .

Answer 29

1. Είναι γνωστή η αλληλουχία DNA του κλώνου που θέλουμε να απομονώσουμε . 2. Χρήση ιχνηθετημενων μορίων DNA ή RNA που περιέχουν συμπληρωματικές αλληλουχίες προς το κλωνοποιημένο DNA . 3. Απομόνωση δείγματος από τους κλώνους 4. Αποδιαταξη του DNA του δείγματος 5. Ανάμιξη ιχνηθετημενου μορίου DNA ή RNA με τα απόδιαταγμένα δείγματα . 7. Το ιχνηθετημενο μόριο υβριδοποιείται μόνο με το συμπληρωματικό και έτσι το αναγνωρίζουμε .

Question 30

Ποια η σημασία δημιουργίας αντιγράφων DNA;

Answer 30

Η κατασκευή βιβλιοθηκών μας δίνει τη δυνατότητα να απομονώσουμε το βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο . Στη συνέχεια πολλαπλασιάζονται τα βακτήρια του κλώνου και δημιουργούνται πολλά αντίγραφα του γονιδίου που περιέχει . ! Η δημιουργία πολλών αντιγράφων είναι απαραίτητη για τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου και για την παραγωγή της πρωτεΐνης που αυτό κωδικοποιεί .!

Question 31

Τι είναι η μέθοδος PCR και ποιες οι εφαρμογές της ;

Answer 31

Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης μας επιτρέπει να αντιγράψουμε επιλεκτικά , εκατομμύρια φορές ειδικές αλληλουχίες DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA , ΧΩΡΙΣ τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου . Η τεχνική αυτή που άρχισε να εφαρμόζεται ευρέως από το 1985 , έχει αυξήσει την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων και έχει πολλές πρακτικές εφαρμογές : 1. Χρησιμοποιείται στην ιατρική για τη διάγνωση ασθενειών όπως το AIDS 2. Στην εγκληματολογία για τη διαλεύκανση υποθέσεων . 3. Μελέτη DNA απολιθωμάτων .

Question 32

Τι γίνεται όταν ένα μόριο αντιγράφεται τη μέθοδο PCR ?

Answer 32

Όταν ένα μόριο αντιγράφεται με τη μέθοδο PCR χωρίζουν οι δυο αλυσίδες και κάθε μια αντιγράφεται συνεχώς από το 3’ακρο της . Οπότε πρωταρχικό τμήμα απέναντι στις νέες αλυσίδες δημιουργείται απέναντι από το 3’ ακρο της παλιάς .

Question 33

Ποιο μόριο από διατάσσεται πρώτο σε δίκλωνα μόρια που έχουν το ίδιο μήκος ;( ή και όχι )

Answer 33

Σε Δίκλωνα μόρια που έχουν το ίδιο μήκος πρώτο αποδιατασεται αυτό που έχει τους λιγότερους τριπλούς δεσμούς ( δηλαδή ζεύγη G-C )

Question 34

Ένα μόριο ανιχνευτή με τι θα συνδεθεί ; Σχετικά με το μόριο που θελουμε να εντοπίσουμε .

Answer 34

Ένα μόριο ανιχνευτή DNA ή RNA μπορεί να συνδεθεί με βάση τον κανόνα της συμπληρωματικότητας με την μια από τις δυο αλυσίδες του μορίου που θελουμε να εντοπίσουμε ( πρέπει να είναι συμπληρωματικό και αντιπαραλληλο )

Question 35

Ποιος πρέπει περιγραφικά να είναι ο αριθμός των Παλαμήδι η που θα χρησιμοποιήσουμε για να συνδεθούνε στο DNA δότη και ποιος βακτηρίων ;

Answer 35

Ο αριθμός των πλασμιδιων που θα χρησιμοποιήσουμε για να συνδεθούν στο DNA δότη πρέπει να είναι μεγαλύτερος από τον αριθμό των κομματιών ,διότι κάποια πλασμιδια κλείνουν χωρίς να συνδεθούν με DNA δότη . Και τα βακτήρια ξενιστές θα είναι περισσότερα από τα πλασμιδια διότι σε κάποια βακτήρια σεν θα μπει πλασμίδιο . Τμήματα DNA δότη < πλασμιδια < βακτήρια . . ξενιστές

Question 36

Πως είναι δυνατόν στη cDNA βιβλιοθήκη ενός κυττάρου Α και σε αυτη ενος κυττάρου Β να υπάρχουν κάποιοι κλώνοι που είναι ίδιοι ;

Answer 36

Στη cDNA βιβλιοθήκη ενός κυττάρου Α και στην cDNA βιβλιοθήκη ενός κυττάρου Β υπάρχουν κάποιοι κλώνοι που είναι ίδιοι , αφού υπάρχουν γονιδια που εκφράζονται σε όλα τα είδη των κυττάρων Πχ γονιδια DNA πολυμερασης , RNA πολυμερασης κα

Question 37

Με πόσους τρόπους μπορεί να συνδεθεί το τμήμα DNA δότη ένα πλασμίδιο ;

Answer 37

Ένα τμήμα DNA δότη μπορεί να συνδεθεί σε ένα πλασμίδιο με δυο τρόπους , κανονικά και ανεστραμμένα . Αν δίνεται υποκινητής στο πλασμίδιο ο οποίος πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την έκφραση του DNA δότη τότε υπάρχει ένας μόνο τρόπος σύνδεσης , το 3’ ακρο της μη κωδικής αλυσίδας βρίσκεται προς τη Μεριά του υποκινητή .

Question 38

Ποιος υποκινητής χρησιμοποιείται συνήθως για την έκφραση του DNA δότη σε κύτταρο ξενιστή ; ( πλασμιδιου ή DNA δότη ; )Και γιατί ;

Answer 38

Για την έκφραση DNA δότη σε κύτταρο ξενιστή χρησιμοποιείται ο υποκινητής του γονιδίου του πλασμιδιου και όχι ο δικός του , γιατί τα βακτήρια ξενιστές δεν έχουν την ποικιλία των μεταγραφικών παραγόντων που έχουν τα ευκαρυωτικα κύτταρα . Αν έχει το δικό του υποκινητή συνεπώς μπορεί αν μην βρει τους μεταγραφικός του παράγοντες .

Question 39

Αλληλουχία DNA που αναγνωρίζει μια περιοριστική ενδονουκλεαση .

Answer 39

Η αλληλουχία που αναγνωρίζει μια περιοριστική ενδονουκλεαση πρέπει να αποτελείται από 4-8 ζεύγη βάσεων και να διαβάζεται με τον ίδιο τρόπο και η συμπληρωματική της 5~> 3 3