5. Themen des Fachkurses Flashcards
(8 cards)
Welche Komponenten gehören in einen PCR-Ansatz?
- die zu amplifizierende DNA
- entsprechende Primer
- Nukleotide
- Polymerase (hitzeresistent)
- Puffer
Erklären sie Ligation und Transformation!
Ligation: Verknüpfung des 5’-Ende eines DNA-Stranges mit dem 3’-Ende eines anderen durch Ligasen
Transformation: nicht virale Übertragung freier DNA in kompetente Zellen
Erklären sie die Begriffe Operon, Regulon, Modulon! Ordnen sie das Maltose-Transportsystem den Begriffen zu!
Operon
- Gruppen von Genen, die über gemeinsamen Promotor reguliert werden und eine gemeinsame mRNA bilden
Regulon
- Gruppe von Operons, die über gemeinsamen, spezifischen Regulator kontrolliert werden
Modulon
- Gruppe von Operons und Regulons, die durch übergeordneten, globalen Regulator kontrolliert werden
Es existiert ein Maltose Regulon für das Maltose-Transportsystem MalE
Erklären sie die blau/weiß-Selektion!
- Selektionsverfahren zur Identifizierung von Transformanten, in die gewünschte Plasmide eingeführt wurden
- Ansatz wird auf selektivem Medium plattiert (enthält Ampilicin, IPTG und Xgal)
- Nichttransformierte Zellen können sich durch Ampilicin nicht vermehren
- Zellen mit Plasmid ohne Insert vermehren sich u. Transkribieren LacZ, welches sich mit ß-Galaktoidasieprotein zu Hybridprotein verbindet
- > Xgal kann zu einem blauen Produkt hydrolisiert werden -> Kolonie erscheint blau
- Zellen mit Plasmid und klonierter DNA bilden farblose Kolonien aus , da die eingefügte Fremd-DNA das LacZ-Gen unterbricht und damit die Herstellung des entsprechenden Proteins gehemmt wird, wodurch Xgal nicht hydrolysiert werden kann
Welche Besonderheiten muss das PCR-Produkt aufweisen, wenn es in einen pGEM-T-Vektor ligiert werden soll.
- die DNA-Fragmente müssen ein überhängendes Poly-A am 3’-Ende aufweisen (durch Taq-Polymerase angehängt), was die einfache Ligation des pGEM-T-Vektors erlaubt (besitzt überhängendes T am 3’-Ende)
Mit welchen Verfahren kann die Funktionsfähigkeit von MalE untersucht werden.
Affinitätschromatographie: mit einer Amylose Matrix
Proteine, die ausschließlich Maltose binden, werden von der Matrix nicht zurückgehalten. Da MalE auch Maltodextrine bindet, wird sie durch die Matrix gebunden, während die anderen Proteine in den Durchlauf gehen.
Komplementationstest: Wachstum auf MacConkey-Agar (enthält Neutral-Rot)
Durch mikroaerobe Bedingungen innerhalb der Kolonien wird die Maltose fermentiert
-> pH-Absenkung -> Indikator wird unter pH-7 rot
Kann die Maltose nicht abgebaut werden wachsen die Bakterien nur auf ebenfalls angebotenen Aminosäuren -> Kolonien gelb
Wozu wird der Überexpressions-(pGEMT)-Vektor genutzt? Welche Auswirkungen auf die Klonierung und Expression hat das?
Der Vektor dient dazu, das zuvor von ihm aufgenommene malE Gen, sowie eine Antibiotikaresistenz in die Zelle einzuschleusen.
Dadurch hat das Gen eine hohe Anzahl an Kopien in der Zelle, nämlich in der chromosomalen DNA und in den eingefügten Plasmiden, wodurch eine Überexpression stattfindet.
Außerdem wird durch den Vektor (mit Insert) das LacZ Gen blockiert, dessen Genprodukt in der blau-weiß-Selektion das Xgal abbaut(blau)
Erklären sie „Induktorausschluß“ anhand des Maltose-Transport-Systems!
Bei Anwesenheit von Glucose liegt EIIA hauptsächlich in seiner dephosphorylierten Form vor, welche als Inhibitor für FGK2 wirkt. (Induktorausschluss)
- EIIA verhindert das schließen des MalK-Dimers nach Bindung von ATP
In der phosphorylierten Form ist EIIA an der Aktivierung der Adenylat-Cyclase beteiligt, welche cAMP synthetisiert. Dieses bindet an CRP und wird für die Aktivierung der mal Gene benötigt.
