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Genomics > Enzyme Der Gentechnik > Flashcards

Enzyme Der Gentechnik Flashcards

1
Q

Wie funktioniert die Klonierung?

A

In einen Plasmidvektor wird ein fremdes DNA-Fragment enzymatisch eingefügt

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Q

Wie isoliere ich die zu untersuchende DNA?

A
  1. Bakterienkultur mit Antibiotikum im RG um die resistenten Bakterien zu erhalten
  2. wird zentrifugiert
  3. die flüssige Masse wird entnommen und aufgebrochen-> Versch. Reinigungsschritte
  4. die DNA wird aus dem Zellextrakt gereinigt (nur wenige nm)
  5. DNA wird angereichert
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Q

Wie kann ich die Zellen aufbrechen, um einen Zellextrakt zu erhalten?

A
  1. Lyse der Zelle

2. Zentrifugieren zum Entfernen der Zelltrümmer

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4
Q

Was muss man machen, um die Lyse der Zellen zu bewirken?

A
  1. Aufbrechen der Zellwand und Zellmembran durch verschiedene Methoden wie zb mit alkalischem Lösemittel, bei e. Coli noch mit Lysozym oder Ultraschall
  2. Puffer hinzufügen (Tris, EDTA zum Mg auffangen, wichtig für die DNA Polymerase), damit die DNA intakt bleibt
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5
Q

Wie trenne ich die Proteine aus meinem Zellextrakt? (Phenolextraktion)

A
  1. Mischen des Zellextraktes mit Phenol
  2. trennen der Schichten durch Zentrifugation
    Schichten (oben nach unten): wässrige Phase mit DNA & RNA, 20% Phenollösung!; Grenzschicht mit Proteinen; Phenol
  3. Chloroform! Denaturiert Proteine, löst sich aber nicht mit Wasser und holt Phenol aus wässriger Lösung
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6
Q

Wie bestimme ich das Volumen der wässrigen Phase?

A

-> Ethanolfällung von Nukleinsäuren
1. 0,1 Vol 3M NaCl + 2,5 Vol Ethanol
Kälte beschleunigt Fällung
2. Zentrifugieren -> ausgefällte DNA als Na-Salz, aufpassen mit Restriktionsenzymen wegen Na vor allem bei Bakterienextraktion
3. Waschschritt: 70% Ethanol, weiter zentrifugieren, Na der DNA geht ins Ethanol, + Tris, EDTA

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7
Q

Wie funktioniert die Reinigung der DNA an Silikat- und Anionenaustauschsäulen?

A
  1. Bindung der DNA an Silicakügelchen
  2. Reinigung der DNA durch Säulenchromatographie:
    A. Zellextrakt durchlaufen lassen-> denaturierte Biomoleküle, verwerfen
    b. Silicakügelchen + Elotionpuffer + Wasser + geringe Salzkonzentration, alkalisch -> löst DNA von Kügelchen - > DNA
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8
Q

Wie funktioniert die Agarosegelelektrophorese?

A
  1. Agarose Gel, UV-durchlässige Kunststoffunterlage + Puffer -> tränken mit EtBr-Lösung 0,5 mikrogramm/ml 15 min lang ( lagert sich in DNA ein)
  2. DNA in Schlitze geben (nicht durchstechen)
    - DNA ist - geladen, wandert daher zum +Pol, Gitter hält DNA fest
    - durch Spannung+Zeit kann DNA reproduzierbar aufgetrennt werden
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9
Q

Wie hängt die Agarosekonzentratiom mit der Fragmentlänge zusammen?

A

Geringere Konzentration 0,5% für große kB-Bereiche (allerdings zu schlabberig)
Am meisten genutzt 0,7-1,2%

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10
Q

Was ist bei er Elektrophorese wichtig?

A
  • je kleiner das Fragment, desto weiter läuft es

- Spannung bestimmt Schnelligkeit der Wanderung ( angeben in: 0,5-5 V/cm Elektrodenabstand, sonst nicht reproduzierbar)

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11
Q

Wie kann ich die DNA sichtbar machen?

A
  • Stopplösung zum Restriktionsansatz, zum Blaufärben Bromphenolblau + Glycerin zum schwer machen + EDTA gegen Enzyme
  • Kontrolldna für Banden, DNA Marker
  • auf Transilluminator legen um es zum leuchten zu bringen
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12
Q

Wie kann ich die DNA-Fragmentgrößen bestimmen?

A
  1. grobe Abschätzung nach Augenmaß anhand von Kontrolle mit Hind3 + Phagen DNA
  2. genaue graphische Abschätzung auf halblogaritmischem Papier
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13
Q

Wie funktioniert der Southern Blot?

A
  • radioaktiver Nachweis von DNA, gilt nur für lineare DNA
    1. elektrophorese der DNA mit Restriktionsenzymen
    2. Filterpapier, Gel, Nitrocellulose Papier-> DNA bleibt kleben. Alklalische Lösung denaturiert DNA
    3. Hybridisierung mit Marker-DNA oder RNA Probe-> muss also einzelsträngig sein
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14
Q

Wofür ist das Southern blotting?

A

Um ein bekanntes DNA-Fragment zu finden in, zB ob eine Mutante in einem Gen ist oder nicht

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15
Q

Was macht man mit Northern Blotting und Western blotting?

A
  • northern: radioaktiver Nachweis von RNA

- Western: Nachweis von Proteinen

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16
Q

Wie wird die DNA radioaktiv markiert?

A
  1. [a32p]dATP -> radioaktives Phosphor
  2. Nick-Translation: einzelsträngige Lücken werden durch DNA-Polymerase + 32p-dATP aufgefüllt, muss denaturiert werde
    3- Auffüllen der Enden: sticky-ends + Klenow-Fragment + 32p-dATP -> markiertes Ende
17
Q

Was passiert beim random Priming?

A

Klenow-Fragment (Bekannte DNA) wird denaturiert und mit zufälligen Primern verbunden; dann gibt man markierte und unmarkierte dNTPs hinzu, denaturiert es wieder
-> Einzelsträngige Proben

18
Q

Wie hybridisiert man DNA?

A
  1. Doppelsträngige DNA schmelzen und auf einen Filter geben (dann nur noch einzelsträngiger)
  2. markierte DNA hinzufügen -> Hybridisierung
  3. Überflüssige markierte DNA wegwaschen
  4. Autoradiographie
19
Q

Wie werden Nukleinsäuren nachgewiesen? 8( Kolonie-Hybridisierung)

A
  1. Übertragung der Kolonien auf Nitrocellulose oder Nylon -> Bakterien bleiben haften
  2. Abbau der Zellen durch alkalischer Puffer und Protease -> Einzelsträngige DNA, Reinigung dieser
  3. Hybridisierung mit markierter DNA, Auflegen eines Röntgenfilms
  4. Autoradiogramm (positives Signal wird unter Petrischale gelegt und identifiziert)
20
Q

Was sind Oligonukleotide und wofür benutzt man sie?

A
  • in Vitro definiert synthetisierte Einzelsträngige DNA-Fragmente von ca 20 Nukleotiden
  • werden als Primer für random priming, Primer extension und PCR, aber auch doppelsträngig als Linker und Adaptoren angewendet
21
Q

Wozu werden Linker verwendet?Wie ?

A
  • zum Schnittstellen anbasteln
  • Linker werden an Moleküle mit glatten Enden angeheftet mit DNA Ligase und dann mit zb BamH1 geschnitten, sodass am DNA Molekül sticky ends entstehen
22
Q

Was ist ein Adapter und wofür wird er verwendet?

A
  • ein typischer Adapter hat sticky ends, verbindet sich mit anderem Adapter
  • wird ans Molekül angeheftet
  • > Molekül hat danach immer noch glatte Enden
23
Q

Wie werden Oligonukleotide synthetisiert?

A
  1. Nukleotid1 an Glasmatrix gebunden, Nukleotid 2 am 5‘ Ende mit DMT Schutzgruppe abgeschirmt -> nur 3‘ Ende von 2 kann mit 1 reagieren
  2. Entfernung von DMT durch ZnBr2, Stabilisationen der p-Gruppe durch Oxi. Mit I2
  3. Finale Entfernung der Methylgruppen (alkalisch), lösen der Oligos von der Matrix.
    Wiederholen mit monomer 3, 4 etc
24
Q 
Template:
Primer:
dNTPs:
polymerase:
Denaturierung:
Annealing:
Elongation:
(wichtige Begriffe für die PCR)
A

Template: Substrat der PCR-Reaktion
Primer: Initiatoren der Polymerisation
dNTPs: Nukleosidtriphosphate werden in neuen Strang eingebaut
Polymerase: Enzym zur Doppelstrangsynthese
Denaturierung: Trennung der D.s. bei 92-98°
Annealing: Anlagerung der Primer an geöffneten D.s
Elongation: Neusynthese des fehlenden D.s.

25
Q

Wie läuft eine typische PCR ab?

A
  1. initiale Denaturierung 2 min bei 95°
  2. Denaturierung 30sec 95°
  3. Annealing 45 sec 55°
  4. Elongation 60 sec 72°
    - > 2. 3. 4. 40 mal wiederholen
  5. Finale Elongation 5 min 72°
26
Q

Wofür wird eine PCR angewendet?

A
  • Amplifikation definierter DNA Fragmente
  • Nachweis bestimmter Sequenzen
  • genet. Fingerabdruck, Vaterschaftstest
  • Nachweis von Mutationen, Gendiagnostik
  • Klonierung
  • Nachweis von transgenen Organismen
  • DNA Sequenzierung
  • RT-PCR zum Nachweis von Genprodukten/ Transkripten

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