Transgene Organismen

Question 1

Wie definiert man einen transgenen bzw gentechnisch veränderten Organismus?

Answer 1

„gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt.“

Question 2

Was sind die Hauptgründe für Gentechnik?

Answer 2

1. Funktion der Gene?

2. Eigenschaften durch Manipulation verändern

Question 3

Was ist das Grundprinzip der Transformation?

Answer 3

DNA (neue Eigenschaft) -> Vektor -> Übertragungsweg -> Zielorgan(ismus)

Question 4

Transiente Transformation (1)

Answer 4

• Nur temporär exprimiert, wird nicht weitergegeben

- Expression der Fremd-DNA im Cytoplasma des Empfängers (meist ohne Replikation)

Question 5

Stabile Transformation (1)

Answer 5

• Integration in das Genom des Empfängerorganismus
• dauerhaft exprimiert und vererbt
• idR Expression einer Genkopie (begrenzte Expressionsstärke)

Question 6

Stabile Transformation (2)

Answer 6

• Integration durch nichthomologe Rekombination (unpräzise)
• durch homologe Rekombination (präzise, aber nicht so gut in Pflanzen)
• Partikelbombardierung und Rekombination
• T-DNA vermittelte Transformation

Question 7

Transiente Expression

Answer 7

• Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen (zB chemisch, elektroporation, Säuger: Transfektion)
• Transiente Transformation mit Agrobakterien (Zellkulturen, Blätter)
• Partikelbombardierung

Question 8

Prinzip der Transformation anhand des Ti-Plasmids

Answer 8

• Agrobakterium, das im Boden lebt
• kann über 600 Aren zweikeimblättrige Pfl infizieren und verursacht Tumore
• Opine catabolism -> Pflanze wird nicht gefressen
• disarmed Plasmid mit Wunsch DNA, was ins Pflanzengenom eingesetzt werden kann

Question 9

Was bedeutet pluripotent

Answer 9

Aus einer Pflanzenzelle ist es möglich, wieder eine ganze Pflanze herzustellen

Question 10

Was sind die Voraussetzungen für die Transformation?

Answer 10

1. Selektierbares Markergen
2. Promotor (konstitutiv, Gewebe-spezifisch oder induzierbar)
3. codierende DNA
4. Polyadenylierungssignal (3‘ UTR Stabilität)

Question 11

Welche selektierbaren Markergene gibt es? Für welche Organismen?

Answer 11

• Kanamycin Resistenz in Eukaryoten neomycin phophotransferase
• Hygromycin B in Pflanzen
• Streptopycin phospphotransferase in Chloroplasten
• Herbizid Bialaphos, das BASTA inaktiviert in Pflanzen

Question 12

Floral Dip (Transfomration von Aradopsis) / Tauchtransformation

Answer 12

1. Agrobacterium Kultur 28° 2 Tage
2. Dipping ( Sucrose+Silvet)
3. Kultivierung in Anzuchtschrank für 2-3 Wochen
4. Samenreifung (Trocknung)
5. Selektion (Transformationsrate 1%, recht viel)

Question 13

Wozu macht man Promotor-Reportergen-Fusionen und wie?

Answer 13

• um herauszufinden, wo ein Gen in der Pflanze exprimiert ist
• Promotor + codierende Region -> cod. Reg mit Reportergen GUS austauschen und in einen Transformationvektor bringen -> farblich markierter Ort, wo Gen exprimiert wird

Question 14

Protein-Reporterprotein-Fusionen

Answer 14

• Promotor+Gen+Reporterproteim (GFP) in Transformationsvektor

Question 15

Wie kann man herausfinden, welches Gen für welche Funktion wichtig ist?

Answer 15

Indem man nacheinander einige Gene abschaltet (vorher mit GUS) und guckt, wann etwas markiert ist

Question 16

Überexpression von Genen

Answer 16

• > zur Funktionsuntersuchung oder Größenveränderung

- Prinzip: Viraler Promotor, Konstitutibe Expression, stärker Promotor

Question 17

Welche Methoden kann man zur Transformation anwenden?

Answer 17

• bioloistic transformation (Gene guns), durch Beschießung

- Injektion von Agrobakterien

Question 18

Wozu dient Reverse Genetik und welche Grundlegenden Möglichkeiten gibt es?

Answer 18

• zur Funktionsaufklärung von Genen (und ihren Produkten)
• vom Genotyp zum Phänotyp
• gerichtete und zufällige Mutagenese

Question 19

Disruption construct

Answer 19

• zerstört/verändert Genfunktion
• markiert es um es zu erkennen
• kanMX Gen

Question 20

Wodurch lässt sich eine gezielte Gen-Inaktivierung durchführen und wie funktioniert es?

Answer 20

• durch homologe Rekombination in Hefe

1. Diploide Zellen durch disruption construct transformieren
2. für G-418 Resistenz selektieren
3. Sporulation -> 4 haploide Zellen

Question 21

Was passiert bei der gezielten Gen-Inaktivierung durch homologe/nichthomologe Rekombination bei Mäusen?

Answer 21

1. Homologe Re.: Zellen sind G-418 und ganciclovir (Gift) resistent und überleben
2. Nicht-homologe Re.: Zellen sind zwar G-418 resistent, aber sensitiv auf Ganciclovir, weswegen sie sterben

Question 22

In welche Phase der Embryoentwicklung inkorporiert man die mutierten ES Zellen?

Answer 22

Blastocystenphase

Question 23

Wofür wird das Cre-lox System verwendet?

Answer 23

Für die Herstellung Gewebe-spezifischer Knock-outs

Question 24

Welche Elemente sind für das Cre-lox System notwendig?

Answer 24

• loxP-DNA-Sequenzen: locus of X-over P1
• Cre-Rekominase

-> Die Sequenz zwischen den Lox-Sequenzen wird durch Rekombination entfernt

Question 25

Conditional Knockout

Answer 25

Cre-sequenz entscheidet, wo das Gen exprimiert wird.

- zB Cre-rekombinase unter einem Herzspezifischen Promotor führt dazu, dass das Gen nur im Herzen ausgeknockt ist

Question 26

Knock-ins

Answer 26

• zum Gene einschalten durch rekombinieren der Stoppsequenz

Question 27

Wie lässt sich eine Mutantenpopulation herstellen?

Answer 27

1. Tauch-Infiltration mit Agrobakterium
2. Samenernte
3. Selektion mit BASTA
4. Isolierung von Insertionslinien

Question 28

Kommerzielle Generierung großer Mutantenpopulationen

Answer 28

• Sequenzierung der flankierenden T-DNA Bereiche = FST
• Bereitstellung der FST Sequenzen in einer Datenbank
• Sequenzvergleich der FSTs mit dem gewünschten Gen
• Bestellen des Samenpools, Isolierung und Verifizierung der gewünschten Mutante
• phänotypische Analyse

Question 29

Was sind Transposons?

Answer 29

Springende Gene

-> beim Springen wird ein Teil des Gens mit rausgerissen, was u verschieden starken Farben zb bei Maiskörnern führt

Question 30

T-DnA induzierte Mutanten

Answer 30

• einfach in Arabidopsis zu etablieren
• technisch beschränkt auf Arabidopsis
• zufällige Verteilung der Insertionen
• geringe Anzahl an Insertkopien

Question 31

Transposon-induzierte Mutanten

Answer 31

• endogene/heterologe transposons
• Generation von stabilisierten Transposons ist genetisch kompliziert
• Technologie auf andere Spezies übertragbar
• erlaubt multiple Allele und revertanten
• keine zufällige Verteilung
• hohe Insertkopieanzahl möglich