Klonierungsvektoren

Question 1

Was ist das Prinzip von Klonierungsvektoren und wie funktionieren sie?

Answer 1

• die Art des Vektors bestimmt die Anzahl der Kopien bzw Plasmide in einer Zelle
• Ori, Plasmid cloning vector und Polylinker werden benötigt

Question 2

Was können Klonierungsvektoren ermöglichen?

Was muss man beachten?

Answer 2

Vermehrung und Analyse von bestimmten DNA Fragmenten

1. Klonierungskapazität
2. Handhabbarkeit
3. Anwendung
4. Stabilität der klonierten DNA?

Question 3

Welche Vektoren gibt es?

Answer 3

• Plasmide
• Lamda-Phagen
• Cosmide
• BAC ( bacterial artificial chromosomes)
• YAC (yeast artificial chromosomes)

Question 4

Was sind die Vorteile von Plasmiden?

Answer 4

• leichte Hanhabbarkeit
• relativ stabil
• einfache Transformation und Vermehrung in E. coli
• einfache DNA Isolierung, hohe Ausbeute (ori-abhängig)
• einfache Insert Analyse
• für verschiedene Organismen anwendbar
• klonierungskapazität bis 8 kb

Question 5

Wie funktioniert die Plasmidklonierung?

Answer 5

• Vektor+Insert wir mit Ligase verbunden (Ligation)
• dies wird in E. coli eingeschleust, dann vermehrt
• zuletzt wird die DNA isoliert

Question 6

Was sind Shuttle-Vektoren und was benötigen sie?

Answer 6

Shuttle-Vektoren kann man in mehrere Organismen einbauen, dazu brauchen sie die jeweiligen Oris (also min. 2)
Sie brauchen:
- Ori (E. Coli)
- ampr (selektieren in E. coli)
- CEN oder ARS (Ori für Hefe)
- URA3 (Gen in Uracilbiosynthese)
- Polylinker

Question 7

Phase Lamda

Answer 7

• temperierter E. coli-Phage
• Kopf und Schwanz (nicht Kontraktil)
• DNA linear
• komplexe Regulation
• lytischer und lysogener Zyklus (lysogen: baut DNA in Zelldna ein und vermehrt sich so, Lytisch: vermehrt Bauteile in Zelle und bricht Zelle dann auf

Question 8

Wie wird der Zyklus aus lytisch und lysogen reguliert?

Answer 8

• Promoter etc ‚frühe Gene‘ und Promoter etc. für späte Gene

Question 9

Aus welchen Teilen besteht die Phagen DNA?

Answer 9

• cos Sites
• Linker arm
• stuffer Fragment, welches rausgeschnitten und ersetzt werden kann
• rechter Arm
• cos- Sites (ähnlich wie sticky ends)
• > darf nur um 10% der KB abweichen bei Ersatz

Question 10

Wofür sind Replacement-Vektoren?

Answer 10

• um das stuffer Fragment zu ersetzten
• wird entfernt und durch 10-23kb Inserts eingetauscht
• für DNA Bibliotheken

Question 11

Was sind Insertionsvektoren?

Answer 11

• für cDNA
• Insert wird mithilfe von EcoR1 eingefügt
• Inserts dürfen nicht so groß sein(0-10 kb)

Question 12

Wie werden die Phagen hergestellt?

Answer 12

• vorher gefertigter Lamda Kopf und Schwanz ( einzeln)
• DNA im Kopf wird bearbeitet
• Lamda Schwanz bindet nur an ‚gefüllten‘ Kopf

Question 13

Wie wird eine Phagen DNA Bank hergestellt?

Answer 13

• jedes Gen des Organismus ist drin
• jedes der Plaques enthält ein anderes Stück DNA
• danach Screenings der DNA Bank

Question 14

Phagenscreenings

Answer 14

Siehe GoodNotes

Question 15

Wie kann man Phagen isolieren?

Answer 15

• Agarplatte mit Phagen Plaques
• Nitrocellulose Filter darauf legen
• Filter in alkalischer Lösung inkubierenum Phagen zur Lyse zu bringen und DNA zu denaturieren
• mit markierter Probe hybridisieren, Autoradiogramm machen
• > Signal erscheint über der Phagen DNA, die zur Probe komplementär ist

Question 16

Wie wird der erste Strang in der cDNA synthetisiert?

Answer 16

1. mRNA wird mithilfe von oligo-dT Primer hybridisiert an Poly-A-Schwanz
2. mit Reverse Transkriptase wird rNA zu cDNA
3. mit Alkalilösung wird RNA entfernt, poly(dG)-Schwanz wird angefügt
   4- Einzelsträngige wird mithilfe von Oligo-dC Primer hybridisiert

Question 17

Wie synthetisiert man dann den komplementären Doppelstrand (cDNA)

Answer 17

1. synthetisier complementary Strand mithilfe von ddNTPs
2. cDNA durch Methylierung an den EcoR1 Sites schützen
3. cDNA an restriktion Site Linkers ligieren

Question 18

Wie wird dieser cDNA Strang in die Phagen kloniert?

Answer 18

1a. Mit EcoR1 spalten (sticky ends)
1b. Mit EcoR1 schneiden und ersetzbare Region entfernen
2. Ligate To Lamda Arms
3. in vitro verpacken -> in jedem Phagen wurde ein anderes Stück DNA eingebaut

Question 19

Wie funktioniert die Synthese des Cosmide?

Answer 19

• Synthese des cos-sites des Phagen Lamda mit einem Plasmid
• Cosmid wird mit Insert verbunden ( sehr groß und zerbrechlich)
• kein lytischer Zyklus -> Vermehrung als Plasmid
• Isolierung von Plasmiden

Question 20

Was ist bei BAC wichtig und wie wird es hergestellt?

Answer 20

• Ori (ParA, ParB)
• multiple cloning site
• Reportergen
• Selektionsmarker

1. genomische DNA wird partiell verdaut
2. ein Teil dieser wird ins BAC inserted
   - > Trafo in E. coli, Vermehrung, Isolierung

Question 21

Was wird für die YACs benötigt? Wie wird DNA eingefügt?

Answer 21

• Telomer-Sequenzen
• TRP1, ARS, CEN
• EcoR1
• URA3 als Selektionsmarker

Genomische DNA wird mit EcoR1 partiell verdaut; Ligation und Transformation in Hefezellen

Question 22

Was sind Genomische Banken?

Answer 22

Eine Sammlung von rekombinanten Klonen, die ein vollständiges Genom repräsentiert

Question 23

Wozu dienen Genomische Banken?

Answer 23

Zum Finden und Klonieren eines Gens, zur Kartierung von Genom(Abschnitten), zur Sequenzanalyse

Question 24

Welche Anforderungen gibt es an die GB?

Answer 24

• Repräsentativität (Wahrscheinlichkeit jedes beliebige Gen zu finden)
• technisch einfache Handhabbarkeit
• Stabilität der klonierten DNA

Question 25

Wie lautet die Formel um die benötigten Klone für Genomische Banken zu berechnen?

Answer 25

N=(ln(1-P))/(ln(1-a/b))

N= Anzahl der erforderlichen Klone
P= Wahrscheinlichkeit, dass jedes Gen vorhanden ist (Wurde bei diesen Berechnungen auf 0,95 gesetzt, also 95%)
a= durchschnittliche Größe des Fragments
b=Gesamtgröße des Genoms